苹果矮化砧木茎段继代培养返童绿枝扦插繁殖的方法
【专利摘要】本发明公开了苹果矮化砧木茎段继代培养返童绿枝扦插繁殖的方法。该方法包括使离体的成年期苹果矮化砧木茎尖分生组织在继代培养基中长成植株，得到成年期苹果矮化砧木茎尖分生组织初代组培苗，取所述初代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行继代培养，得到第1代组培苗，取所述第1代组培苗的茎段在所述继代培养基中连续进行所述继代培养直到返童，得到返童组培苗；将所述返童组培苗转入生根培养基进行生根培养得到返童组培苗的生根植株，将所述返童组培苗的生根植株移栽到大田，得到采穗母株，取所述采穗母株上的嫩梢作为插穗，用生根剂处理所述插穗得到处理后插穗，将所述处理后插穗插入基质中培养得到扦插生根苗。
【专利说明】苹果矮化砧木茎段继代培养返童绿枝扦插繁殖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过茎段继代培养实现苹果矮化砧木绿枝扦插繁殖的方法。
【背景技术】
[0002]苹果无性系矮化砧木的繁殖方式主要有嫁接、压条和组培。压条是苹果无性系矮化砧木的常用无性繁殖方式。虽然绿枝扦插的繁殖系数明显高于压条，且繁育周期短。但苹果矮化砧木扦插生根难，需要特殊技术处理，因而未能在生产苗圃中广泛应用。
[0003]“一种SH系苹果矮化砧木无性繁殖的方法”(申请号:201310074272.1)发明了一种将SH系苹果矮化砧木埋干促发新枝，再将新枝在拱棚中扦插生根的无性繁殖方法，生根率达80%以上。“一种苹果矮化砧木自根苗繁育技术”(申请号:201310039320.3)，发明了一种苹果矮化砧木温床培育苹果矮化砧木嫩枝、嫩枝扦插前处理技术、营养钵直接扦插技术、间歇性喷雾控制技术、炼苗移栽的自根苗繁育技术，可实现苹果矮化砧木和其它难生根木本植物的工厂化扦插育苗，并可实现当年扦插，当年达到嫁接粗度的育苗要求。“一种中石占I号的繁殖方法”(申请号:201210001119.1),发明了一种从中站I号童期树的枝条上剪取插穗，基部浸蘸2000ppm-4000ppm的IBA溶液，扦插到穴盘中进行培养的繁殖方法，具有繁殖系数高、繁育周期短、生产成本低等优点。
[0004]诱导茎发生不定根是木本植物扦插成功的关键。随着供体植株年龄的增长，插穗形成不定根的能力显著下降。3年生卡罗莱纳州鼠李(Carolina Buckthorm)插穗生根率为88%，远高于成年期树(36年生)插穗17%(Graves，2002)。童期北美红杉插穗生根率100%，成年期30%(Li et al，1 992)。因此，通过诱导插穗返童可以提高插穗生根能力。将成年期芽连续嫁接到幼年期站'木可以诱导返童(Delargy and Wright, 1979; Husen, 2008b; Husenand Pal, 2003; Huang et al.，1992)。外施用赤霉素(GA3)或在培养基里添加GA3能显著提高甜楼桃(Prunus avium)生根能力，GA3可能诱导甜楼桃返童(Ford et al.，2002)。
[0005]miR156基因介导开花植物营养阶段向生殖阶段转变，童期阶段miR156基因相对表达量显著高于成年期阶段(Poethig2009;Wu et al.，2009;Wang et al., 2011 ;Huijserand Schmid2011)。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种通过诱导成年期苹果矮化砧木返童来实现苹果矮化砧木绿枝扦插繁殖的方法。
[0007]本发明所提供的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，包括使离体的成年期苹果矮化砧木茎尖分生组织在继代培养基中长成植株，得到成年期苹果矮化砧木茎尖分生组织初代组培苗，取所述初代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行继代培养，得到第I代组培苗，取所述第I代组培苗的茎段在所述继代培养基中连续进行所述继代培养直到返童，得到返童组培苗；将所述返童组培苗转入生根培养基进行生根培养得到返童组培苗的生根植株，将所述返童组培苗的生根植株移栽到大田，得到采穗母株，取所述采穗母株上的嫩梢作为插穗，用生根剂处理所述插穗得到处理后插穗，将所述处理后插穗插入基质中培养得到扦插生根苗。
[0008]上述方法中，所述基质可为河沙。
[0009]上述方法中，所述得到返童组培苗的方法为取所述第I代组培苗的茎段在所述继代培养基中连续进行所述继代培养直到第N代，得到第N代组培苗，所述第N代组培苗即为所述返童组培苗，所述N为大于等于18小于等于21的任一个自然数。
[0010]上述方法中，所述苹果矮化砧木可为中砧I号、M9或M26。在本发明的一个【具体实施方式】中，所述苹果矮化砧木为中砧I号，N为大于等于18小于等于21的任一个自然数。在本发明的另一个实施方式中，所述苹果矮化砧木为M9，N为21。在本发明的另一个实施方式中，所述苹果矮化砧木为M26，N为21。
[0011]上述方法中，取所述第I代组培苗的茎段在所述继代培养基中连续进行所述继代培养直到第N代，得到第N代组培苗的方法可为取所述第I代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第2代组培苗，取所述第2代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第3代组培苗，取所述第3代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第4代组培苗，取所述第4代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第5代组培苗，取所述第5代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第6代组培苗，取所述第6代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第7代组培苗，取所述第7代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第8代组培苗，取所述第8代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第9代组培苗，取所述第9代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第10代组培苗，取所述第10代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第11代组培苗，取所述第11代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第12代组培苗，取`所述第12代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第13代组培苗，取所述第13代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第14代组培苗，取所述第14代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第15代组培苗，取所述第15代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第16代组培苗，取所述第16代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第17代组培苗，取所述第17代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第18代组培苗。
[0012]上述方法中，得到第N代组培苗的方法可为取所述第18代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第19代组培苗。
[0013]上述方法中，得到第N代组培苗的方法可为取所述第19代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第20代组培苗。
[0014]上述方法中，得到第N代组培苗的方法可为取所述第20代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行所述继代培养，得到第21代组培苗。
[0015]上述方法中，所述继代培养基可为在MS培养基中加入BA和IBA得到的固体培养基，所述继代培养基中BA的浓度为0.2mg/L，所述继代培养基中IBA的浓度为0.5mg/L。
[0016]上述方法中，上述所有茎段均至少带一个芽和一片营养叶。
[0017]上述方法中，所述继代培养的条件为每天的光照周期为16小时光照8小时黑暗，光强为2000Lx，光照时温度为24-25°C，黑暗时温度18°C。
[0018]上述方法中，所述生根培养基可为在1/2MS培养基中加入IBA得到的固体培养基，所述生根培养基中IBA的浓度为0.5mg/L。
[0019]上述方法中，所述生根培养的条件可为每天的光照周期为16小时光照8小时黑暗，光强为2000Lx，光照时温度为24-25°C，黑暗时温度18°C。
[0020]上述方法中，所述生根剂的溶剂为水，溶质可为IBA和H2O2 ;所述生根剂中，IBA的浓度为3000mg/L，H2O2的浓度为50mM。
[0021]上述方法中，所述用生根剂处理所述插穗可为将所述插穗浸蘸所述生根剂，浸蘸深度为2.0cm，浸蘸时间为I分钟。
[0022]本发明通过苹果矮化砧木的成年期枝条茎尖分生组织的继代培养使苹果矮化砧木成年期材料返童，恢复苹果矮化砧木扦插生根能力，将在我国苹果矮化密植栽培中得到广泛应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为中砧I号成年期枝条叶片和连续继代过程中第0、3、6、9、12、15和18代的叶片形态变化。
[0024]图2为中砧I号连续继代过程中miR156基因相对表达量变化。
[0025]图3为苹果砧木返童(R)、童期(J)和成年期(A)插穗生根能力比较。
【具体实施方式】
[0026]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。河沙购自北京昌平区阳坊镇。实施例中的实验地点均为北京。
[0027]苹果矮化砧木中砧I号是中国农业大学历时25年从小金海棠(Malusxiaojinensis Cheng et Jiang)中选出的耐缺铁优良种质,具有耐盐碱、耐热、耐旱、耐?劳、抗寒(_45°C)、抗白粉病、固地性好等特性(韩振海等，苹果砧木新品种中砧I号。农业生物技术学报，2013，21 (7): 879-882)。该砧木新品种已经于2009年12月30日由北京市林木品种审定委员会审定为林木良种，良种编号为京S-SV-MX-015-2009，此信息可从2010年I月16日发布的《2009年北京市林木品种审定公告》上查询，公众可从中国农业大学获得。
[0028]M9和M26是英国东茂林试验站选育出的优良苹果矮化砧木，作为苹果砧木能使树体矮化，早结果，早丰产，提高果实品质，大幅度增加单位面积产量(宣景宏，2001 ;王贵平等，2012)，M9和M26公众可以从果树苗圃购买。
[0029]实施例1、通过诱导成年期苹果矮化砧木返童来实现苹果矮化砧木绿枝扦插繁殖的方法
[0030]1,2012年3月初，剪取苹果矮化砧木中砧I号成年期(树龄10年)树冠枝条、M9成年期树冠枝条、M26成年期树冠枝条催芽，选取饱满的芽体作为外植体。
[0031]2、外植体用自来水冲洗30分钟，75%的医用酒精消毒30秒，无菌水清洗3遍，再用
0.1%的升汞消毒6分钟，无菌水清洗3遍，之后用灭过菌滤纸将外植体表面水浙干，得到初代(记为O代)外植体。
[0032]3、外植体继代培养
[0033]在无菌条件下用解剖刀剥取初代外植体的茎尖分生组织接入继代培养基(MS+0.2mg/L BA+0.5mg/L IBA)，进行继代培养四周，长成无根植株，该植株即为成年期苹果矮化砧木茎尖分生组织初代(记为O代)无根组培苗；取苹果矮化砧木茎尖分生组织初代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第I代无根组培苗，取第I代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第2代无根组培苗，取第2代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第3代无根组培苗，取所述第3代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第4代无根组培苗，取所述第4代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第5代无根组培苗，取所述第5代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第6代无根组培苗，取所述第6代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第7代无根组培苗，取所述第7代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第8代无根组培苗，取所述第8代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第9代无根组培苗，取所述第9代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第10代无根组培苗，取所述第10代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第11代无根组培苗，取所述第11代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第12代无根组培苗，取所述第12代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第13代无根组培苗，取所述第13代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第14代无根组培苗，取所述第14代无根组培苗的茎段(带`一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第15代无根组培苗，取所述第15代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第16代无根组培苗，取所述第16代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第17代无根组培苗，取所述第17代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第18代无根组培苗，取所述第18代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第19代无根组培苗，取所述第19代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第20代无根组培苗，取所述第20代无根组培苗的茎段(带一个芽和一片营养叶)在上述继代培养基中进行相同的继代培养四周，得到第21代无根组培苗。
[0034]其中，每个继代周期为4周，上述继代培养的条件均为每天的光照周期为16小时光照8小时黑暗，光强为2000Lx，光照时温度为24-25°C，黑暗时温度18°C。期间观察叶片形态变化，取生长正常的嫩叶测定miR156基因的相对表达量。[0035]miR156基因相对表达量的检测方法如下:
[0036](I) miR156基因的提取及检测
[0037]1)0.5g样品转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨样品，期间不断加入液氮，直至研磨至粉末状；
[0038]2)向研钵中加入2ml RNAiso for Small RNA，将粉末状样品完全覆盖，室温静置，待样品完全融化继续研磨至裂解液呈透明状；
[0039]3)匀浆液转入离心管，室温静置5min。之后12000g4°C离心5min，小心吸取上清液，转入新离心管中；
[0040]4)上清液中加入400ul氯仿，盖紧离心管管盖，用手剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后，室温静置5min。之后12000g4°C离心15min ；
[0041]5)小心取出离心管，吸取上清至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置lOmin。之后12000g4°C离心IOmin ；
[0042]6)弃上清，75%乙醇Iml清洗沉淀2次，最后吸尽上清保留沉淀；
[0043]7)室温干燥5min，加入适量DEPC水溶解沉淀；
[0044]8)取2ulRNA提取样品，加入IOX loading buffer混匀后，用含EB3%的琼脂糖凝胶电泳检测小分子RNA的完整性；
[0045]9)使用微量紫外分光光度计检测小分子RNA的浓度及纯度；
[0046](2)利用茎环引物的RT-PCR`
[0047]RT反应体积为20ul，在0.2ml PCR管中先加入RNA1.5ug，RT引物(茎环引物)Iul和dNTPs (10mmol/l) lul，用DEPC水补足至14ul，混匀65°C变性5min，立即放入冰水混合物中冷却，然后加入反转录酶AMV (5U/ul)lul,Buffer(5X)4ul和RNase抑制剂Iul，通过160C 30min;20°C 30s, 42°C 30s, 50°C ls，60 个循环；85°C IOmin 完成反转录反应。对于内参5.8s rRNA的反转录即将上述中RT引物换成5.8s rRNA本身的RT引物，其它体系及反转录条件不变。
[0048]反转录结束后取lul cDNA进行PCR反应，反应体积为10ul，含Iul正义PCR引物，Iul反义PCR引物，5ul Premix Taq，用DEPC水补足至IOul0 PCR反应程序为-MV 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s30个循环；72°C 7min。用含EB的3%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
[0049]RT-PCR的引物如表1。
[0050]表1.RT-PCR中的引物序列(5' —3')
[0051]
【权利要求】
1.苹果矮化砧木扦插繁殖方法，包括使离体的成年期苹果矮化砧木茎尖分生组织在继代培养基中长成植株，得到成年期苹果矮化砧木茎尖分生组织初代组培苗，取所述初代组培苗的茎段在所述继代培养基中进行继代培养，得到第I代组培苗，取所述第I代组培苗的茎段在所述继代培养基中连续进行所述继代培养直到返童，得到返童组培苗；将所述返童组培苗转入生根培养基进行生根培养得到返童组培苗的生根植株，将所述返童组培苗的生根植株移栽到大田，得到采穗母株，取所述采穗母株上的嫩梢作为插穗，用生根剂处理所述插穗得到处理后插穗，将所述处理后插穗插入基质中培养得到扦插生根苗。
2.根据权利要求1所述的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述得到返童组培苗的方法为取所述第I代组培苗的茎段在所述继代培养基中连续进行所述继代培养直到第N代，得到第N代组培苗，所述第N代组培苗即为所述返童组培苗，所述N为大于等于18小于等于21的任一个自然数。
3.根据权利要求1或2所述的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述继代培养基为在MS培养基中加入BA和IBA得到的固体培养基，所述继代培养基中BA的浓度为0.2mg/L，所述继代培养基中IBA的浓度为0.5mg/L。
4.根据权利要求1或2或3所述的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述继代培养的条件为每天的光照周期为16小时光照8小时黑暗，光强为2000LX，光照时温度为24-25°C，黑暗时温度18°C。
5.根据权利要求1-4中任一所述的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述生根培养基为在1/2MS培养基中加入IBA得到的固体培养基，所述生根培养基中IBA的浓度为 0.5mg/L。
6.根据权利要求1至5中任一所述的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述生根培养的条件为每天的光照周期为16小时光照8小时黑暗，光强为2000LX，光照时温度为24-25°C，黑暗时温度18°C。
7.根据权利要求1至6中任一所述的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述生根剂的溶剂为水，溶质为IBA和H2`O2 ;所述生根剂中，IBA的浓度为3000mg/L，H202的浓度为 50mM。
8.根据权利要求1至7中任一所述的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述用生根剂处理所述插穗为将所述插穗浸蘸所述生根剂，浸蘸深度为2.0cm，浸蘸时间为I分钟。
9.根据权利要求1至8中任一所述的苹果矮化砧木扦插繁殖方法，其特征在于:所述苹果矮化砧木为中砧I号、M9或M26。
【文档编号】A01G1/00GK103814725SQ201410062191
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】韩振海, 肖祖飞, 张艳珍, 吉娜, 张新忠, 王忆, 吴婷, 许雪峰 申请人:中国农业大学