专利名称：草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种农业育苗技术领域的方法，具体是一种草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法。
背景技术：
草莓(Fragaria ananassa Ducde)是蔷薇科草莓属宿根性多年生常绿草本植物，是一种靠匍匐茎进行无性繁殖的作物，体内病毒积累逐年增加，病毒病发生严重。感染了病毒的草莓生长缓慢、叶皱缩、果子一年比一年小、畸形、品质差，一般减产30％-80％，并逐年加重。在我国已造成损失的草莓病毒病主要有草莓斑驳病毒(SmoV)，草莓轻型黄边病毒(SMYEV)，草莓镶脉病毒(SVBV)，草莓皱缩病毒(SCrV)等四种。据报道这四种病毒总侵染率为80.2％，其中单种病毒侵染率为41.6％，2种以上的病毒复合侵染率为38.6％。对于病毒病，目前还没有药剂可以治理。因此，培育无病毒母本苗，栽培无病毒苗木，是防治草莓病毒病的根本对策。目前，世界上培育草莓无毒苗有三种方法热治疗法、花药培养法和茎尖培养法。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利申请号03110849.0，名称为植物组织培养生产草莓苗的方法，该专利自述为提供了一种采用植物组织培养生产草莓苗的方法。该方法是在MB培养基上培养草莓叶片，再生草莓幼苗，得到草莓无性系。草莓再生率达到97.0％以上，生根率达100％，生产成本低，不污染环境，达到产业化水平。该项技术不足之处在于利用叶片建立无性繁殖体系，必然要经过愈伤组织这个阶段，难免会产生大量变异，虽然再生率很高，但培养出来的草莓苗不能保持其种性，不符合生产需要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，使其建立一套既能保持原始品种优良种性，不发生变异，又能脱除病毒，提供健壮脱毒苗的草莓无性繁殖供种体系，解决常规大田利用匍匐茎繁种病毒累集的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤(1)取材灭菌利用春秋两季采集5cm长的草莓匍匐茎顶芽，进行灭菌处理；(2)茎尖培养在双筒解剖镜下剥取茎尖，大小为0.2mm左右，将切下的茎尖生长点接种到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培养基中，在25℃、光强30μmol·m2·ws-1、光照时间16hr/天的条件下培养，生长出丛芽；(3)快速繁殖将丛芽整块或切成小块转接到MS+BA0.2mg/L的培养基中培养；(4)试管苗生根经过几代增殖培养后，将草莓大苗从丛生芽块上切下，转接到1/2MS培养基上促使生根，其余的继续转接到MS+BA0.2mg/L的培养基上培养；(5)试管苗驯化生根苗经驯化培养后移栽到苗床，作为在隔离室中繁殖生产用苗的原原种苗。
本发明采用以茎尖培养的方法进行脱毒。以茎尖直接诱导丛生芽，并形成完整植株，这样的过程发生变异的概率小，可以放心地应用于生产。病毒粒子是通过植物体的疏导组织在体内传播，而植物的茎尖部分是一团旺盛分裂的细胞，还没有进入器官分化阶段，及还不存在疏导组织，因此，植物的茎尖部分不含病毒粒子。将该部分细胞切割下来，在培养基上培养，获得的植株就不含病毒。应用这种方法，可以在实验室生产大量草莓脱毒苗，不受季节的限制，脱毒苗经简单驯化就可以应用于生产，省时省力。
本发明获得的草莓试管苗，用电子显微镜鉴定，没有或很少观察到病毒颗粒，与常规方法繁殖种苗相比，病毒颗粒大为减少；用野生草莓小叶嫁接法鉴定，可以明显看到嫁接常规种苗的野生草莓叶片表现为皱缩，而嫁接脱毒苗的野生草莓叶片仍然平整，无皱缩表现。大田生产试验表明利用脱毒苗进行生产，产量比常规苗作种苗的生产田高出30％以上，并且品质有明显改善。
具体实施例方式
结合本发明的内容提供以下实施例，具体实施如下1.取材灭菌自田间选取健壮草莓母株上生长充实而小叶尚为展开的匍匐茎顶端5cm长的顶芽，用自来水冲洗2h后，在超净台上进行灭菌处理。先用小镊子将匍匐茎的外部大叶摘除，再用70％酒精快速处理30s，用饱和漂白精液浸泡15min，然后用无菌水冲洗3遍。
2.茎尖培养在双筒解剖镜下由外向内逐层剥去幼叶，直至闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来，切取0.2mm大小茎尖接种到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培养基中，培养容器为100ml的玻璃瓶，培养基放30ml/瓶，每瓶接种3个材料，接种后移至培养室内培养，光照30μmol·m-2·s-1，16h/天，温度25℃(下同)。大约10天后茎尖转绿，30天后形成幼小丛芽，60天后丛芽长大。
3.快速繁殖将将丛芽整块转接到MS+BA0.2mg/L培养基上，培养容器为250ml带塞三角塑料瓶。增殖时，继代组培苗株数为3株/瓶，增殖培养过程中每40天继代一次。
4.试管苗生根经过几代增殖培养后，将生长健壮的组培苗转接到1/2MS生根培养基上。生根时使用100ml三角瓶。
5.试管苗驯化生根培养20天后，将生根试管苗瓶口打开，培养室内放置3天取出后洗净其根部的培养基，移栽到蛭石上(严格隔离的防虫网室中)，温度保持在25℃，相对湿度90％，适当遮荫，后期逐渐通风，增加光照，常规管理。
试管苗在蛭石上移栽成活后，在草莓基地进行生产试验，以常规繁殖苗为对照。结果表明应用脱毒苗，草莓亩产达到3000公斤/亩左右，草莓产量比常规苗增加25％-40％，最高的增加50％以上。
权利要求
1.一种草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取材灭菌利用春秋两季采集草莓匍匐茎顶芽，进行灭菌处理；(2)茎尖培养在双筒解剖镜下剥取茎尖，将切下的茎尖生长点接种到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培养基中培养，生长出丛芽；(3)快速繁殖将丛芽整块或切成小块转接到MS+BA0.2mg/L的培养基中培养；(4)试管苗生根经过几代增殖培养后，将草莓大苗从丛生芽块上切下，转接到1/2MS培养基上促使生根，其余的继续转接到MS+BA0.2mg/L的培养基上培养；(5)试管苗驯化生根苗经驯化培养后移栽到苗床，作为在隔离室中繁殖生产用苗的原原种苗。
2.根据权利要求1所述的草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，其特征是，所述的步骤(1)，取材灭菌具体如下选取健壮草莓母株上生长充实而小叶尚为展开的匍匐茎顶端5cm长的顶芽，用自来水冲洗2h后，在超净台上进行灭菌处理，先用小镊子将匍匐茎的外部大叶摘除，再用70％酒精快速处理30s，用饱和漂白精液浸泡15min，然后用无菌水冲洗3遍。
3.根据权利要求1所述的草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，其特征是，所述的步骤(2)，茎尖培养具体如下在双筒解剖镜下由外向内逐层剥去幼叶，直至闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来，切取0.2mm大小茎尖接种到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培养基中，培养容器为100ml的玻璃瓶，培养基放30ml/瓶，每瓶接种3个材料，接种后移至培养室内培养，光照30μmol·m-2·s-1，16h/天，温度25℃，生长出丛芽。
4.根据权利要求1所述的草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，其特征是，所述的步骤(3)，快速繁殖具体如下将将丛芽整块转接到MS+BA0.2mg/L培养基上，培养容器为250ml带塞三角塑料瓶，增殖时，继代组培苗株数为3株/瓶，增殖培养过程中每40天继代一次。
5.根据权利要求1所述的草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，其特征是，所述的步骤(4)，试管苗生根具体为经过几代增殖培养后，将生长健壮的组培苗转接到1/2MS生根培养基上，生根时使用100ml三角瓶。
6.根据权利要求1所述的草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，其特征是，所述的步骤(4)，试管苗驯化具体如下生根培养20天后，将生根试管苗瓶口打开，培养室内放置3天取出后洗净其根部的培养基，移栽到蛭石上，温度保持在25℃，相对湿度90％，适当遮荫，后期逐渐通风，增加光照，常规管理。
全文摘要
一种农业育苗技术领域的草莓茎尖培养生产脱毒苗的方法，步骤为(1)取材灭菌利用春秋两季采集草莓匍匐茎顶芽，进行灭菌处理；(2)茎尖培养在双筒解剖镜下剥取茎尖，大小为0.2mm，将切下的茎尖生长点接种到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培养基中培养，生长出丛芽；(3)快速繁殖将丛芽整块或切成小块转接到MS+BA0.2mg/L的培养基中培养；(4)试管苗生根经过几代增殖培养后，将草莓大苗从丛生芽块上切下，转接到1/2MS培养基上促使生根，其余的继续转接到MS+BA0.2mg/L的培养基上培养；(5)试管苗驯化生根苗经驯化培养后移栽到苗床，作为在隔离室中繁殖生产用苗的原原种苗。利用本发明获得的脱毒苗进行生产，产量比常规苗作种苗的生产田高出30％以上，并且品质有明显改善。
文档编号A01H4/00GK1748478SQ20051003044
公开日2006年3月22日 申请日期2005年10月13日 优先权日2005年10月13日
发明者何欢乐, 蔡润, 潘俊松 申请人:上海交通大学