专利名称：一种蚕豆离体培养方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的培养方法，特别是一种蚕豆离体培养方法。
背景技术：
细胞全能性学说的提出及其在动植物上的证明，是生命科学研究的一大杰出成果。克隆技术已在植物上得到广泛应用，于动物以及人类上的应用也已展开。由于蚕豆染色体大而数量少，细胞分生组织增殖周期短，是一种用于监测环境污染及重金属污染的指示植物，因此，如何利用现代植物培养技术，快速培养蚕豆植物已成为当今生物界的重要话题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种蚕豆离体培养方法。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种蚕豆离体培养方法，包括以下步骤1)、获取无菌种子苗选择饱满、均匀的蚕豆种子，放置于70％的酒精中1分钟后，再用饱和的漂白粉溶液浸泡，用无菌水冲洗；再倒入添加5mg/L GA3的无菌水浸泡12h，待种子完全吸胀后，再用饱和的漂白粉溶液浸泡，用无菌水冲洗，采用胚根向上放置方式接种到无激素的发芽培养基上，进行光周期下培养；2)、构建克隆3代群体当芽长出2-3cm时，将芽切下转移至增殖培养基上，连续克隆三代；3)、环境胁迫筛选将克隆苗按照下面的a)步骤或b)步骤进行环境胁迫筛选a)、45℃ 1h、2h，在光照培养箱中进行；b)、紫外灯照射，在超净工作台上将培养瓶的盖子打开，将苗暴露在20w的紫外灯下照射，高度60cm，时间设置为1h和2h；4)、生根繁殖培养环境胁迫处理结束后，将无菌苗接种至无激素的恢复培养基培养，21天后统计存活率，并将存活的植株转移到生根培养基生根。
上述发芽培养基和恢复培养基是以MS培养基为基本培养基，其中添加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂，pH5.8；增殖培养基则在发芽培养基的基础上添加0.5mg/L 6-BA、0.01mg/LNAA、0.5mg/L MET、800mg/L CH、1mg/L PVP、0.5g/L AC；恢复培养基以MS培养基为基本培养基，其中添加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂，pH5.8；生根培养基是以MS培养基为基本培养基，其中添加1.0mg/L NAA、0.5g/L AC并在121℃高温高压灭菌。
本发明在蚕豆种子苗的克隆过程中，切口部分受伤氧化，容易出现褐化现象，使克隆无法进行下去，因此在1000克增殖培养基中添加1mg/L PVP和0.5g/L AC能较为有效地阻止褐化的发生；尤其是在添加AC的培养基上，褐化现象也得到了控制，植株生长十分健壮。
另外，本发明在蚕豆克隆苗中，玻璃苗现象也较为严重，严重影响了繁殖系数，因此在培养基中添加0.5mg/L MET可以十分有效地控制克隆苗的玻璃化。
本发明在增殖培养基上，30d可以继代一次。
采用本发明的培养方法，其苗与种子苗没有差异，茎秆粗壮，叶色浓绿，长势良好。
具体实施例方式
一种蚕豆离体培养方法，包括以下步骤1、获取无菌种子苗选择饱满、均匀的蚕豆种子，放置于70％的酒精中1分钟后，再用饱和的漂白粉溶液浸泡10分钟，用无菌水冲洗5-6次。放在铺有无菌纱布的磁盘中，倒入添加5mg/L GA3的无菌水浸泡12h，待种子完全吸胀后，再用饱和的漂白粉溶液浸泡10分钟，用无菌水冲洗5-6次，采用胚根向上放置方式接种到无激素的发芽培养基上，在23±1℃、光强1800lx、每天光照12h/黑暗12h的光周期下培养；2、构建克隆3代群体当芽长出2-3cm时，将芽切下转移至增殖培养基上，连续克隆三代；3、环境胁迫筛选将克隆苗按照下面的a)步骤或b)步骤进行环境胁迫筛选a)、45℃1h、2h，在光照培养箱中进行；b)、紫外灯照射，在超净工作台上将培养瓶的盖子打开，将苗暴露在20w的紫外灯下照射，高度60cm，时间设置为1h和2h；4、生根繁殖培养环境胁迫处理结束后，将无菌苗接种至无激素的恢复培养基培养，21天后统计存活率，并将存活的植株转移到生根培养基生根。
上述发芽培养基和恢复培养基是以MS培养基为基本培养基，其中添加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂，pH5.8；增殖培养基则在发芽培养基的基础上添加0.5mg/L 6-BA、0.01mg/LNAA、0.5mg/L MET、800mg/L CH、1mg/L PVP、0.5g/L AC；生根培养基是以MS培养基为基本培养基，其中添加1.0mg/L NAA、0.5g/L AC并在121℃高温高压灭菌。
权利要求
1.一种蚕豆离体培养方法，包括以下步骤1)、获取无菌种子苗选择饱满、均匀的蚕豆种子，放置于70％的酒精中1分钟后，再用饱和的漂白粉溶液浸泡10分钟，用无菌水冲洗5-6次。放在铺有无菌纱布的磁盘中，倒入添加5mg/L GA3的无菌水浸泡12h，待种子完全吸胀后，再用饱和的漂白粉溶液浸泡10分钟，用无菌水冲洗5-6次，采用胚根向上放置方式接种到无激素的发芽培养基上，在23±1℃、光强18001x、每天光照12h/黑暗12h的光周期下培养；2)、构建克隆3代群体当芽长出2-3cm时，将芽切下转移至增殖培养基上，连续克隆三代；3)、环境胁迫筛选将克隆苗按照下面的a)步骤或b)步骤进行环境胁迫筛选a)、45℃ 1h、2h，在光照培养箱中进行；b)、紫外灯照射，在超净工作台上将培养瓶的盖子打开，将苗暴露在20w的紫外灯下照射，高度60cm，时间设置为1h和2h；4)、生根繁殖培养环境胁迫处理结束后，将无菌苗接种至无激素的恢复培养基培养，21天后统计存活率，并将存活的植株转移到生根培养基生根。上述发芽培养基和恢复培养基是以MS培养基为基本培养基，其中添加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂，pH 5.8；增殖培养基则在发芽培养基的基础上添加0.5mg/L 6-BA、0.01mg/LNAA、0.5mg/L MET、800mg/L CH、1mg/L PVP、0.5g/L AC；生根培养基是以MS培养基为基本培养基，其中添加1.0mg/L NAA、0.5g/L AC并在121℃高温高压灭菌。
全文摘要
本发明公开的一种蚕豆离体培养方法，包括获取无菌种子苗、构建克隆3代群体、环境胁迫筛选、生根繁殖培养等步骤。培养时所使用的发芽培养基和恢复培养基是以MS培养基为基本培养基，其中添加30g/L蔗糖、6.0g/L琼脂，pH 5.8；增殖培养基则在发芽培养基的基础上添加0.5mg/L 6－BA、0.01mg/L NAA、0.5mg/L MET、800mg/L CH、1mg/L PVP、0.5g/L AC；生根培养基是以MS培养基为基本培养基，其中添加1.0mg/L NAA、0.5g/L AC并在121℃高温高压灭菌。采用本发明的培养方法，其苗与种子苗没有差异，茎秆粗壮，叶色浓绿，长势良好。
文档编号A01C1/00GK1771796SQ20051002984
公开日2006年5月17日 申请日期2005年9月21日 优先权日2005年9月21日
发明者胡润田, 许凌波, 康诗腾, 陆瑞菊, 屈巧玲 申请人:上海市七宝中学