专利名称：草地早熟禾脂肪酸含量测定方法
技术领域：
本发明涉及脂肪酸的含量測定方法，具体地，涉及草地早熟禾脂肪酸含量測定方法。
背景技术：
目前测定植物脂肪酸含量的方法技术多集中在油料作物，以及植物组织中的种子部分。关于植物叶片组织的脂肪酸含量的測定方法国外有拟南芥、菠菜等叶片组织脂肪酸含量的測定方法比较成熟。这些方法概况起来分为油脂提取、皂化和甲酯化三个主要步骤，所需试剂种类多，步骤繁复，花费时间长。草地早熟禾(Poa Pretensis)属于多年生草本植物，须根系，具有根状茎，叶色青緑，观赏效果好，根茎繁殖，再生力強，耐修剪，抗寒能力強，耐旱性稍差，耐践踏，是非常重要的草坪草和牧草草种。在北方及中部地区，南方部分冷凉地区广泛用于公园、机关、学校、居住区、运动场等地緑化。其特性是喜冷凉湿润的气候，在我国北方部分地区，可保持较长的绿期，可在一定程度上满足园林四季常青的要求。但草地早熟禾对高温和干旱条件不适应，在北方夏季高温条件下，易感病，故该草种对种植管理要求较高，需要较高的水分、养分等投入。草地早熟禾的耐旱性和其不饱和脂肪酸含量相关，科研工作者可通过不饱和脂肪酸含量的比较结果，不饱和脂肪酸含量较高的品种耐旱性也较好。可以通过选育、培育耐旱品种，以满足高温、干燥地区园林绿化的需要。因此，能够简易快速准确地測定草地早熟禾各脂肪酸的含量成为ー个亟待解决的问题。关于草地早熟禾叶片组织脂肪酸含量的測定方法，在现有技术中是ー个空白。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种草地早熟禾脂肪酸含量測定方法。本发明提供的草地早熟禾脂肪酸含量測定方法，包括以下步骤(I)取草地早熟禾新鲜叶片组织于玻璃瓶中；(2)加入含十七烷酸的硫酸；(3)排空玻璃瓶内空气、密封，水浴或金属浴；(4)冷却，加入氯化钠溶液和正己烷，充分摇匀，离心；(5)取离心后的上层油相，入GC-MS仪器分析，根据样品峰图计算脂肪酸的含量。其中，步骤I)所述的叶片组织为O. 2±0. 02g全部展开的叶片组织，将其处理为小于Icm的叶段置于玻璃瓶中。其中，步骤2)所述的硫酸浓度为1N(0. 5mol/L)，硫酸与十七烷酸的体积质量比为ImL:O. Img ;加入硫酸与叶片组织的体积质量比为ImL:O. 2g。本发明的O. 5mol/L硫酸是用甲醇稀释浓硫酸获得的。其中，步骤3)所述水浴或金属浴的温度为6(T80°C，时间为9(Tl20min。
优选地，步骤3)所述水浴或金属浴的温度为80°C，时间为90min。其中，步骤4)所述的冷却温度为-20 -10°C，冷却5 15min。优选地，冷却温度为-20°C，冷却时间lOmin。其中，步骤4)所述氯化钠溶液浓度为O. 9%，其加入量与叶片组织的体积质量比为
I.5mL: O. 2g0 其中，步骤4)所述正己烷加入量与加入硫酸体积比例为ImL :0. 2mL。其中，步骤4)所述离心为1500 3000rpm, 2_5min。其中，步骤5)取f 3 μ L上层油相，入GC-MS仪器分析。优选地，步骤5)取I μ L上层油相，入GC-MS仪器分析。在本发明的一个实施例中，使用气相色谱-质谱仪HP GG-MS(HP 6890GC和HP5973MS)，采用60-mHP-5MS毛细管柱子，内直径O. 25mm，气相色谱仪的程序參数设置如下1700C lOmin，上升到220°C lOmin，气相流速ImL min — 1。用注射器注入I μ L上层油相之后，启动程序。I个样品的脂类分析持续时间大约为40min。通过气相质谱联仪分析，与标准质谱数据库对比分析确定甲酯化脂肪酸的名称，并得到每个样品的峰图。采用内參法，即十七烷酸17:0的重量和质谱分析图上的峰面积计算其他脂肪酸的含量百分比。草地早熟禾主要脂肪酸种类如下16:0棕榈酸，饱和脂肪酸；16:1棕榈油酸，不饱和脂肪酸；18:0硬脂酸，饱和脂肪酸；18:2亚油酸，不饱和脂肪酸；18:3亚麻酸，不饱和脂肪酸。(注分号前边数字代表脂肪酸碳链的长度，即碳原子的个数，分号后边代表碳链双键的个数)假设某特定脂肪酸的重量含量为X μ g，则其计算公式为X/Ax=100/A17:0, X=IOOXAx/A17:0公式中的A指代峰面积，Ax为某含量为X的脂肪酸的峰面积，A17:0为内參的峰面积。所有脂肪酸重量含量之和Wt (单位 μ g) =W16:0+W16:1+W18:0+W18:2+W18:3则某特定脂肪酸含量的百分比Px为Px=X/fftX100%本发明通过将草地早熟禾脂肪酸甲酷化，用GG-MS分析，通过上述公式计算得到
各脂肪酸含量。本发明还提供了上述測定方法在选育耐旱性草地早熟禾品种中的应用。本发明提供的方法克服了样品间脂类提取效率不一致的问题，优化所需检测样品的植物组织样品量，节省甲酯化过程中的一系列试剂用量；简化了甲酯化的操作步骤，节约了上样之后GC-MS的检测分析时间；克服草地早熟禾甲酯化过程中碳化严重的问题，是ー种低成本，快速，简单，高效的草地早熟禾脂肪酸分析方法。本发明通过摸索甲酯化过程每个步骤方法，克服了样品间脂类提取效率不一致以及碳化现象严重的问题，水浴或金属浴的条件控制为80°C，时间为90min，这个条件能够降低草地早熟禾叶片组织的碳化率，有利于后续实施步骤中的油相分离，減少干扰。本发明简化了草地早熟禾脂肪酸分析步骤，把脂类提取和皂化过程简为ー个步骤完成，节约了所需试剂的使用量，是ー种快速、高效的草地早熟禾脂肪酸含量分析方法。
具体实施例方式以下实施例进ー步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的试剂，均为市售。实施例I草地早熟禾脂肪酸甲酷化处理
I、脂类甲酯化前期准备溶液试剂的准备用甲醇稀释硫酸到lN(lmol/L H+)H2SO40配制O. 9%的NaCl溶液。准备好色谱纯级正己烷，十七烷酸(17:0)待用。2、脂类甲酯化过程取草地早熟禾O. 2g新鮮叶片组织，迅速用剪刀把叶片剪短到Icm的长段，放入带盖子的测试玻璃瓶中。加入ImL IN H2SO4，含有100 μ g的十七烷酸(17:0)作为内參，用氮吹仪队轻吹，赶走空气，迅速拧紧瓶盖。80°C水浴，加热90min，完成脂肪酸甲酯化过程。3、脂类甲酯化后期处理放入-20°C冰箱冷却10分钟。加入I. 5mL O. 9%NaCl和200 μ L正己烷(Hexane,Sigma 34859)，充分摇匀，离心5min，转速1500rpm。用10 μ L量程的玻璃注射器，小心吸取上层油相，推进I μ L入GC-MS进样器，用于GC-MS分析。实施例2草地早熟禾脂肪酸甲酷化处理I、脂类甲酯化前期准备溶液试剂的准备用甲醇稀释硫酸到lN(lmol/L H+)H2SO40配制O. 9%的NaCl溶液。准备好色谱纯级正己烷，十七烷酸(17:0)待用。2、脂类甲酯化过程取草地早熟禾O. 2g新鮮叶片组织，迅速用剪刀把叶片剪短到O. 8cm的长段，放入带盖子的测试玻璃瓶中。加入ImL IN H2SO4，含有100 μ g的十七烷酸(17:0)作为内參，用氮吹仪N2轻吹，赶走空气，迅速拧紧瓶盖。60°C金属浴，加热120min。完成脂肪酸甲酯化过程。3、脂类甲酯化后期处理放入-20°C冰箱冷却15分钟。加入I. 5mL O. 9%NaCl和200 μ L正己烷(Hexane,Sigma 34859),润旋20sec,离心2min,转速3000rpm。用10 μ L量程的玻璃注射器,小心吸取上层油相，推进3 μ L入GC-MS进样器，用于GC-MS分析。实施例3GC-MS分析草地早熟禾脂肪酸I、脂类含量分析将实施例I处理过的样品使用气相色谱-质谱仪HP GG-MS (HP6890GC and HP5973MS)，采用60-mHP-5MS毛细管柱子，内直径O. 25mm，气相色谱仪的程序參数设置如下170。。lOmin，上升到220°C lOmin，气相流速ImL min — 1。注射器注入样品之后，启动程序。I个样品的脂类分析持续时间约为40分钟。2、通过气相质谱分析，得到每个样品的峰图。采用内參法，即十七烷酸17:0的重量和质谱分析图上的峰面积计算其他脂肪酸的含量百分比。草地早熟禾脂主要肪酸种类如下16:0棕榈酸，饱和脂肪酸；16:1棕榈油酸，不饱和脂肪酸；18:0硬脂酸，饱和脂肪酸；
18: 2亚油酸，不饱和脂肪酸；18:3亚麻酸，不饱和脂肪酸。(注分号前边数字代表脂肪酸碳链的长度，即碳原子的个数，分号后边代表碳链双键的个数)假设某特定脂肪酸的重量含量为X μ g，则其计算公式为X/Ax=100/A17:0, X=IOOXAx/A17:0公式中的A指代峰面积，Ax为某含量为X的脂肪酸的峰面积，A17:0为内參的峰面积。所有脂肪酸重量含量之和Wt (单位 μ g) =W16:0+W16:1+W18:0+W18:2+W18:3则某特定脂肪酸含量的百分比Px为Px=X/fftX100%实施例4本发明方法与常规方法的对比试验—、本发明方法I、用甲醇稀释硫酸到lN(lmol/L H+)H2SO40配制O. 9%的NaCl溶液。准备好色谱纯级正己烷，十七烷酸(17:0)待用。植物材料的准备剪取3份草地早熟禾品种‘Midnight’ (来源于美国新泽西州立罗格斯大学 II 农场，邮编 08901,地址59Dudley RD,New Brunswick,New Jersey,USA。)3份新鲜叶片样品，命名Ml,M2,M3,3份品种‘Brilliant’(来源同品种‘Midnight’ )新鲜叶片组织，命名为BI，B2，B3。Ml，M2，M3，BI，B2，，B3分别放入6个玻璃测试瓶中。样品重量见表I。表I样品重量
品名 MI M2 M3 BIB2 B3
_i t§21254 02292E _0,22922 _0.22055 _0JI895 _0.201!8 _2、每个玻璃测试瓶中，都加入ImL IN H2SO4，含有100 μ g的十七烷酸(17:0)作为内參，用氮吹仪N2轻吹，赶走空气，迅速拧紧瓶盖。80°C水浴，90分钟。3、放入-20 V冰箱冷却10分钟。4、从冰箱中取出，加入 I. 5mL O. 9%NaCl 和 200 μ L正己烷(Hexane，Sigma 34859)，润旋 20sec,离心 2min,转速 2000rpm。
5、用IOyL量程的玻璃注射器，小心吸取上层油相，推进I μ L入GC-MS进样器，用于GC-MS分析。6、通过气相质谱分析，得到每个样品的质谱数据库比对后结果。采用内參法，利用17:0的重量计算其他脂肪酸的含量百分比。6个样品经过GC-MS分离和质谱数据库的比对，确定脂肪酸类别名称和峰面积，结果如下表2 :表2各样品中脂肪酸的峰面积
权利要求
1.一种草地早熟禾脂肪酸含量测定方法，包括以下步骤 1)取草地早熟禾新鲜叶片组织于玻璃瓶中； 2)加入含十七烷酸的硫酸； 3)排空玻璃瓶内空气、密封，水浴或金属浴； 4)冷却，加入氯化钠溶液和正己烷，充分摇匀，离心； 5)取离心后的上层油相，入GC-MS仪器分析，根据样品峰图计算脂肪酸的含量。
2.如权利要求I所述的测定方法，其特征在于，步骤I)所述的叶片组织为0.2±0. 02g全部展开的叶片组织，将其处理为小于Icm的叶段置于玻璃瓶中。
3.如权利要求I所述的测定方法，其特征在于，步骤2)所述的硫酸浓度为0.5mol/L，硫酸与十七烷酸的体积质量比为ImL 0. Img ;加入硫酸与叶片组织的体积质量比为ImL : 0. 2g0
4.如权利要求I所述的测定方法，其特征在于，步骤3)所述水浴或金属浴的温度为60 80°C，时间为 90 120min。
5.如权利要求I所述的测定方法，其特征在于，步骤4)所述的冷却温度为-20 -10°C，冷却时间5 15min。
6.如权利要求I所述的测定方法，其特征在于，步骤4)所述氯化钠溶液浓度为0.9%，其加入量与叶片组织的体积质量比为I. 5mL 0. 2g。
7.如权利要求I所述的测定方法，其特征在于，步骤4)所述正己烷加入量，与加入硫酸体积比例为ImL 0. 2mL。
8.如权利要求I所述的测定方法，其特征在于，步骤4)所述离心为1500 3000rpm,2 5min。
9.如权利要求I所述的测定方法，其特征在于，步骤5)取I L上层油相，入GC-MS仪器分析。
10.如权利要求I 9任一所述的测定方法在选育耐旱性草地早熟禾中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种草地早熟禾脂肪酸含量测定方法，包括以下步骤(1)取草地早熟禾叶片组织于玻璃瓶中；(2)加入含十七烷酸的硫酸；(3)排空玻璃瓶内空气、密封，水浴或金属浴；(4)冷却，加入氯化钠溶液和正己烷，涡旋、离心；(5)取离心后的上层油相，入GC-MS分析，根据样品峰图计算脂肪酸的含量。本发明提供的方法克服了样品间脂类提取效率不一致的问题，优化所需检测样品的植物组织样品量，节省甲酯化过程中的一系列试剂用量；简化了甲酯化的操作步骤，节约了上样之后GC-MS的检测分析时间；克服草地早熟禾甲酯化过程中碳化严重的问题，是一种低成本，快速，简单，高效的草地早熟禾脂肪酸分析方法。
文档编号G01N30/02GK102706974SQ20121014505
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者许立新, 韩烈保, 黄炳茹 申请人:北京林业大学