蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法，所述三种脂肪酸分别为3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸，通过气相色谱方法测定蜂王浆中3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸的含量。本发明提供的色谱条件可以使色谱峰得到较好的分离，操作简便，准确快捷，灵敏性高，重现性好。并且通过这些有效成分的含量了解蜂王浆的质量品质，为蜂王浆质量标准提供了新的指标。
【专利说明】蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品质量控制方法，涉及蜂王浆有效成分的检测方法，特别涉及蜂王 浆中3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸三种脂肪酸含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 蜂王楽（royal jelly)是5?15日龄的哺育工蜂的咽下腺（subpharyngeal gland)和上颚腺（mandibular gland)分泌的、用以饲喂蜂王和3日龄以内工蜂、雄蜂幼虫 的浆状物质。颜色呈乳白色或淡黄色。其气味与口感主要是酸味和辛辣味。蜂王浆的化学 组成极为复杂，含有蛋白质、多肽、碳水化合物、脂肪酸、维生素、矿物质、酸等，其中，脂质占 蜂王浆干重的89Γ19%，是蜂王浆中最重要的成份之一，其中游离脂肪酸占脂质的809Γ90% 以上，是蜂王浆抗菌、免疫调节、抗肿瘤等诸多生物学功能的物质基础。
[0003] 目前，针对蜂王浆中脂肪酸成分的检测方法主要集中于10-羟基-2-癸烯酸 (10-HDA)，缺乏对其他脂肪酸成分的可靠的定量检测方法。3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸 二酸均是蜂王浆中重要的功能性脂肪酸，但对这些脂肪酸的检测方法研究大多只是定性检 测，缺乏简便、有效、准确的定量检测方法。因此，建立蜂王浆中这三种脂肪酸的定量测定方 法对蜂王浆的质量控制体系的进一步完善有着重大的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法，所述三种脂肪 酸分别为3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸， 本发明提供的蜂王浆中3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸含量的检测方法，通过以 下步骤实现： (1) 以对羟基苯甲酸甲酯、3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸为对照品，制成一定含 量的对羟基苯甲酸甲酯、3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸的溶液，甲硅烷化衍生，通过 气相色谱测定其图谱，以对羟基苯甲酸甲酯为内标物，由对羟基苯甲酸甲酯与3-羟基癸 酸、10-羟基癸酸和癸二酸的特征吸收峰面积的比值和对照品的进样量的比值绘制标准曲 线. (2) 将待测蜂王浆加溶剂超声处理，过滤得滤液，甲硅烷化衍生，制得供试品； (3) 在与步骤（1)相同的色谱条件下测定步骤（2)制得的供试品的气相色谱图谱，并分 别计算对羟基苯甲酸甲酯、3_羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸的特征吸收峰峰面积，根据 步骤（1)绘制的标准曲线、添加标准品质量和称取蜂王浆的质量得到待测蜂王浆中3-羟基 癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸的含量。
[0005] 上述步骤（1)用809Γ100%乙醇溶解对羟基苯甲酸甲酯、3-羟基癸酸、10-羟基癸 酸和癸二酸对照品，制成对轻基苯甲酸甲酯浓度为0. 1 mg/ml~0. 15 mg/ml，3-轻基癸酸浓 度为 0· 004 mg/ml?0· 05 mg/ml、l〇-轻基癸酸浓度为 0· 013 mg/ml?0· 14 mg/ml 和癸二酸 浓度为〇. 0015 mg/ml~0. 025 mg/ml的对照品溶液，吸取1 ml左右对照品溶液，使用滤膜过 滤，挥干溶剂，再用1~3 ml纯乙醚溶解，吸取1 ml左右乙醚溶液，使用滤膜过滤，之后挥干 溶剂，加入 300 μ--500 μ? 纯吡啶和 80 μ--120 ylBSTFA+TMS(99:l)，50。C?70。C 水浴30分钟~60分钟，然后使用气相色谱检测。
[0006] 上述步骤（2)使用809Γ100%乙醇制成对羟基苯甲酸甲酯浓度为0. 5 mg/mf〇. 75 mg/ml的内标溶液，称取约0.5 g蜂王浆，置于容量瓶中，加入100 yflOOO μ? O.Olmol/ 1~0.03 mol/1盐酸，振荡溶解蜂王浆，精密吸取3ml~7ml的内标溶液加入容量瓶，用 809Γ100%乙醇稀释至刻度，超声15分钟~30分钟，制成待测溶液，吸取1 ml左右待测溶 液，使用滤膜过滤，挥干溶剂，再用1 m广3 ml纯乙醚溶解，吸取1 ml乙醚溶液，使用滤膜过 滤，之后挥干溶剂，加入300 μ 1?500 μ 1纯吡啶和80 μ 1?120 μ 1 BSTFA+TMS (99:1)， 50° (T70° C水浴30分钟~60分钟，然后使用气相色谱检测。
[0007] 上述步骤（1)和步骤（3)中采用气相色谱法的是毛细管柱气相色谱法。
[0008] 上述步骤（1)和步骤（3)中采用气相色谱的色谱条件是：使用分流进样；采用 (5%_苯基）_甲基聚硅氧烷为涂层的毛细管色谱柱，载气为氮气；检测器为FID检测器。气 相色谱的进样口温度为250° C，分流比为1:10?1:30,进样量1 μ 1;柱箱程序升温起始 温度50° C，保持5分钟，然后以5° C/分钟速度上升至300° C;检测器温度为330° C;所 采用（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷为涂层的毛细管色谱柱为Rtx-5柱，柱长30 m，内径0. 25 _，涂层厚 〇. 25 μπι。
[0009] 本发明的另一个目的是提供所述方法在蜂王浆中对3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和 癸二酸的含量进行测定中的应用。
[0010] 本发明采用气相色谱法对蜂王浆中3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸的含量进 行测定，所提供的色谱条件可以使色谱峰得到较好的分离，操作简便，准确快捷，灵敏性高， 重现性好。并且通过这些有效成分的含量了解蜂王浆的质量品质，为蜂王浆质量标准提供 了新的指标。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1是实验例1得到的3-羟基癸酸标准曲线。
[0012] 图2是实验例1得到的10-羟基癸酸标准曲线。
[0013] 图3是实验例1得到的癸二酸标准曲线。
[0014] 具体实施方法 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0015] 实施例1 蜂王浆中3种脂肪酸成分含量测定的方法学研究 1.仪器与实验用药 仪器：气相色谱仪（GC 2010,日本岛津制作所)，自动进样器（A0C-20s)，FID检测器，GC solution工作站，天平(精度0· lmg，BS 124S，德国赛多利斯集团）。
[0016] 试剂：标准品：10-羟基癸酸（10-HDAA)、3-羟基癸酸（3-HDAA)、癸二酸，均购自 Sigma公司； BSTFA+TMS (99:1) (Sigma 公司）； 批陡（Sigma公司）； 氢气、氮气、空气(杭州今工特种气体有限公司）； 甲醇(色谱纯，Merck公司）； 乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司）； 无水乙醚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司）； 盐酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司）； 对羟基苯甲酸甲酯(分析纯，国药集团化学试剂有限公司）； 蜂王浆采集自浙江省平湖种蜂场，实验用水为超纯水。
[0017] 2.色谱条件选择 色谱柱：Rtx-5,（30 m，0. 25 mmID，0. 25 μπι);进样口温度：250 °C，进样量：1 uL，分流 比：1: 20 ;;柱箱温度梯度：50° C保持5 min，5 ° C/min上升至300 ° C，300 ° C保持5 min， 载气流速：1. 0 mL/min ;检测器温度：330 °C。在此条件下对羟基苯甲酸甲酯、3-羟基癸酸、 10-羟基癸酸和癸二酸与样品中其他组分分离良好。
[0018] 3.空白试验 取吡啶和BSTFA+TMS混合，水浴30分钟，作为空白试剂，使用气相色谱检测，在对羟基 苯甲酸甲酯对照品、3-羟基癸酸对照品、10-羟基癸酸对照品和癸二酸对照品相同保留时 间无吸收峰。
[0019] 称取0.5g蜂王浆，置于25ml容量瓶中，加入200 μ 1 0.01 mol/1盐酸，振荡溶解 蜂王浆，使用无水乙醇稀释至刻度，超声15分钟，制成待测溶液，吸取1 ml待测溶液，使用 滤膜过滤，挥干溶剂，再用1.5 ml左右乙醚溶解，取1 ml乙醚溶液，使用滤膜过滤，挥干溶 齐[J，加入400 μ 1吡啶和100 μ 1 BSTFA+TMS(99:1)，60° C水浴30分钟，然后使用气相色 谱检测，在对羟基苯甲酸甲酯对照品相同保留时间处无吸收峰。
[0020] 表示目标物质的吸收峰不会受到杂质干扰。
[0021] 4.线性关系考察 称取0.1625 g对轻基苯甲酸甲酯，加入无水乙醇并转移至250 mL容量瓶中，用无水乙 醇稀释至刻度，制成内标溶液。精密称取〇. 0134 g 10-HDAA、0. 0049 g 3-HDAA和0. 0020 g癸二酸，加入无水乙醇溶解后转移至50 mL容量瓶，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混 标母液。精密吸取〇. 5，1，2,3,4,5 mL混标母液至10 mL容量瓶中，加入2 mL内标溶液后 定容至刻度。按上述色谱条件测定对羟基苯甲酸甲酯、3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸 的吸收峰面积，以被测物质与内标物峰面积比值为横坐标，以浓度比为纵坐标，绘制标准曲 线。结果见表1-表3。 ?1 3-?基煢酸_±?a测定结采
[0022]
【权利要求】
1. 一种蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法，所述脂肪酸为3-羟基癸酸、10-羟基癸 酸和癸二酸，其特征在于，通过以下步骤实现： (1) 以对羟基苯甲酸甲酯、3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸为对照品，制成一定含 量的对羟基苯甲酸甲酯、3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸的溶液，甲硅烷化衍生，通过 气相色谱测定其图谱，以对羟基苯甲酸甲酯为内标物，由对羟基苯甲酸甲酯与3-羟基癸 酸、10-羟基癸酸和癸二酸的特征吸收峰面积的比值和对照品的进样量的比值绘制标准曲 线. (2) 将待测蜂王浆加溶剂超声处理，过滤得滤液，甲硅烷化衍生，制得供试品； (3) 在与步骤（1)相同的色谱条件下测定步骤（2)制得的供试品的气相色谱图谱，并分 别计算对羟基苯甲酸甲酯、3_羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸的特征吸收峰峰面积，根据 步骤（1)绘制的标准曲线、添加标准品质量和称取蜂王浆的质量得到待测蜂王浆中3-羟基 癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸的含量。
2. 根据权利要求1所述的一种蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法，其特征在于，步 骤（1)用809Γ100%乙醇溶解对羟基苯甲酸甲酯、3-羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸对照 品，制成对轻基苯甲酸甲酯浓度为〇. 1 mg/ml~0. 15 mg/ml，3-p5基癸酸浓度为0.004 mg/ ml?0· 05 mg/ml、l〇-轻基癸酸浓度为0· 013 mg/ml?0· 14 mg/ml和癸二酸浓度为0· 0015 mg/mfO. 025 mg/ml的对照品溶液，吸取对照品溶液,使用滤膜过滤，挥干溶剂，再用纯乙醚 溶解，吸取乙醚溶液，使用滤膜过滤，之后挥干溶剂，按照99:1的比例加入300 μ广500 μ 1 纯吡啶和80 μ 1?120 μ 1 BSTFA+TMS，50° C?70° C水浴30分钟?60分钟，然后使用气相 色谱检测。
3. 根据权利要求1所述的一种蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法，其特征在于，步 骤（2)使用80%?100%乙醇制成对轻基苯甲酸甲酯浓度为0. 5 mg/ml?0. 75 mg/ml的内标溶 液，称取0.5 g蜂王浆，置于容量瓶中，加入100 μ--1000 μ? O.Olmol/Ι?0.03 mol/1盐 酸，振荡溶解蜂王浆，吸取3ml~7ml的内标溶液加入容量瓶，用809Γ100%乙醇稀释至刻度， 超声15分钟~30分钟，制成待测溶液，吸取待测溶液，使用滤膜过滤，挥干溶剂，再用纯乙 醚溶解，吸取乙醚溶液，使用滤膜过滤，之后挥干溶剂，按照99:1的比例加入300 μ f 500 μ 1纯吡啶和80 μ 1?120 μ 1 BSTFA+TMS，50° C?70° C水浴30分钟?60分钟，然后使用 气相色谱检测。
4. 根据权利要求1所述的一种蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法，其特征在于，步 骤（1)和步骤（3)中采用气相色谱法的是毛细管柱气相色谱法。
5. 根据权利要求4所述的一种蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法，其特征在于，步 骤（1)和步骤（3)中采用气相色谱的色谱条件是：使用分流进样；采用（5%-苯基）-甲基聚 硅氧烷为涂层的毛细管色谱柱，载气为氮气；检测器为FID检测器；气相色谱的进样口温度 为250° C，分流比为1 :10?1 :30,进样量1 μ 1 ;柱箱程序升温起始温度50° C，保持5分 钟，然后以5° C/分钟速度上升至300° C;检测器温度为330° C;所采用（5%-苯基）-甲 基聚硅氧烷为涂层的毛细管色谱柱为Rtx-5柱，柱长30 m，内径0.25 mm，涂层厚0.25 μ m。
6. 根据权利要求1所述的一种蜂王浆中三种脂肪酸含量的检测方法在检测蜂王浆中 3_羟基癸酸、10-羟基癸酸和癸二酸三种脂肪酸中的应用。
【文档编号】G01N30/88GK104155401SQ201410417420
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月24日 优先权日:2014年8月24日
【发明者】胡福良, 吴雨祺, 魏文挺, 郑火青 申请人:浙江大学