专利名称：红苞半蒴苣苔的繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种红苞半蒴苣苔的繁殖方法。
背景技术：
全世界苦苣苔科(Gesneriaceae)植物约有150属3700余种，分布于亚洲东部和南部、非洲、欧洲南部、大洋洲、南美洲至墨西哥的热带至温带地区。我国现已知的有58属463种(27属特产于中国)，均属苦苣苔亚科，绝大部分种类具有较高的观赏价值，其中药用植物约100多种，且有相当一部分为濒危植物。半蒴苣苔属为中国特有属，共24种，5个变种，其中贵州半蒴苣苔(Hemiboeacavaleriei)、蛾眉半蒴苣苔(Hemiboea omeiensis)、半蒴苣苔(Hemiboea subcapitata)、短莖半蒴苣苔(Hemiboea subacaulis)、华南半蒴苣苔(Hemiboea follicularis)等均为民间传统草药，但由于分布范围狭窄、对环境条件要求较高、生境恶劣，致使种群数量过少，而在自然状态下该属植物常籍匍匐枝行营养繁殖，增殖速度较慢。红荀半蒴苣苔(Hemiboea rubribracteata)是2004年发表的苦苣苔科半蒴苣苔属的新种，为多年生草本或半灌木，花和红色总苞美丽，供观赏。目前仅在广西靖西发现一个分布点，生于石灰岩山地峡谷疏林中潮湿岩石上，数量稀少，个体总数不及60株，急需保护。因此，如何妥善保存稀有 的种植资源成为一个需要迫切解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种红苞半蒴苣苔的繁殖方法。本发明提供的红苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步骤:(I)将红苞半蒴苣苔的叶片灭菌后切块，即为外植体；(2)将步骤(I)得到的外植体接种于诱导培养基上，20-280C (如23 ± I °C -25 ± I °C、25±1 V -27±1 °C、23±1 °C、25±1 V 或 27±1 °C)、光强为 20 μ mol.πΓ2.s_1 以下(如10-20 μ mol.πΓ2.s-1、10 μ mol.πΓ2.s-1、20 μ mol.πΓ2.s_1 或黑暗)的条件下培养，获得不
定芽；所述诱导培养基的pH值为5.8-6.0 ；所述诱导培养基是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的浓度为20-30g.Γ1 (如 20g.Γ1 或 30g.Γ1)、KT 的浓度为 0.1-1.0mg.L-1 (如 0.1-0.2mg.L'0.2-0.5mg.L \θ.5-1.0mg.L \θ.1mg.L \θ.2mg.L \0.5mg.L 1 或 1.0mg.L 0、IBA 的浓度为 0.1-0.5mg.L 1 (如 0.1-0.2mg.L \θ.2-0.3mg.L \θ.3-0.5mg.L \0.1mg.L \0.2mg.L \0.3mg.L 1 或 0.5mg.L1);(3)将步骤(2)得到的不定芽转接至繁殖培养基，20-28°C (如23±1°C _25±1°C、25±1°C -27±1°〇、23±11:、25±11:或27±1°0光照培养，获得丛生芽；所述繁殖培养基的pH值为5.8-6.0 ；所述繁殖培养基是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的浓度为20-30g.Γ1 (如 20g.Γ1 或 30g.Γ1)、KT 的浓度为 0.1-1.0mg.L-1 (如 0.1-0.2mg.L'0.2-0.5mg.L \θ.5-1.0mg.L \θ.1mg.L \θ.2mg.L \0.5mg.L 1 或 1.0mg.L 1)> NAA 的浓度为 0.1-0.5mg.L 1 (如 0.1-0.2mg.L \θ.2-0.3mg.L \θ.3-0.5mg.L \0.1mg.L \0.2mg.L \0.3mg.L 1 或 0.5mg.L1);(4)将步骤(3)得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，20-28 °C (如23±1°C -25±1°C、25±1°C _27± 1°C、23± 1°C、25± 1°C或 27± 1°C )光照培养至生根；所述生根培养基的pH值为5.8-6.0 ；所述生根培养基为培养基甲或培养基乙；所述培养基甲的制备方法:在1/2MS固体培养基中加入蔗糖和IBA，蔗糖的浓度为20_30g.L 1 (如 20g.L 1 或 30g.L O、IBA 的浓度为 0.1-0.5mg.L 1 (如 0.1-0.2mg.L \0.2-0.5mg.L \θ.1mg.L \θ.2mg.L 1 或 0.5mg.L1);所述培养基乙的制备方法:在1/2MS固体培养基中加入蔗糖、IBA和活性炭，蔗糖的浓度为 20-30g.I71 (如 20g.I71 或 30g.I71)、IBA 的浓度为 0.1-0.5mg.I71 (如
0.1-0.2mg.L \θ.2-0.5mg.L \θ.1mg.L \θ.2mg.L 1 或 0.5mg.L 0、活性炭的浓度为 0.1-0.5g/100mL (如 0.1-0.2g/100mL、0.2-0.5g/100mL、0.lg/100mL、0.2g/100mL 或
0.5g/100mL)。 所述步骤(I)中:将红苞半蒴苣苔的叶片灭菌后切成0.5-0.8cm2大小，即为外植体；所述步骤(I)中所述灭菌的方法为:用质量百分含量为0.1%的HgCl2水溶液侵泡
1.5-2.5分钟(如1.5-2分钟、2-2.5分钟、1.5分钟、2分钟或2.5分钟)。所述步骤(2)中，所述培养的时间为30-50天(如30-40天、40-45天、45-50天、40天、45天、50天或30天)。所述步骤(2)中，所述培养为光照培养，每天的光照时间为12-14小时。所述步骤(3)中，所述光照培养的光强为50-80 μ mol.m_2.s—1 (如50-60 μ mol.m 2.s \60~80 μ mol.m 2.s \50 μ mol.m 2.s \60 μ mol.m 2.s 1 或80 μ mol.πΓ2.s4),每天的光照时间为14小时。所述步骤(3)中，每30-45天继代一次，每个继代周期增殖3.6-4.3倍(如3.6-3.9倍、3.9-4.3 倍、3.6 倍、3.9 倍或 4.3 倍)。所述步骤(3)中，所述光照培养的时间为30-45天。所述步骤(4)中，所述光照培养的光强为50-80 μ mol.m_2.s—1 (如50-60 μ mol.m 2.s \60~80 μ mol.m 2.s \50 μ mol.m 2.s \60 μ mol.m 2.s 1 或80 μ mol.πΓ2.s4),每天的光照时间为14小时。所述步骤(4)中，所述光照培养的时间为30天。所述方法还包括将步骤(4)得到的生根的幼苗移栽至培养基质并培养，获得栽培苗的步骤；所述培养基质由1-2质量份石灰石、2-5质量份蛭石和1-2质量份河沙混合得至IJ。所述培养的时间可为20-30天。所述培养的条件为:湿润、遮阴的环境。外植体处理是影响外植体存活的重要因素，由于红苞半蒴苣苔叶片略为革质，单薄，两面无毛或仅脉上疏生短柔毛，在灭菌处理过程中要格外注意时间控制，避免过分杀菌而导致外植体死亡。
本发明的方法中所用培养基均以MS培养基或1/2MS培养基为基本培养基，根据不同的培养目的，附加不同剂量的活性炭和激素类物质(KT、NAA和IBA)。MS为国际通用的培养基。1/2MS培养基于MS培养基的差别仅在于大量兀素和微量兀素减半。本发明通过摸索一系列合理的培养基配方和培养条件，实现了使红苞半蒴苣苔有效繁殖的目的，可有目的地诱导外植体细胞不定芽的形成、丛生芽繁殖体系的建立以及生根。利用组织培养方法进行快速繁殖，试管苗的繁殖速度是以几何级数增殖的，本发明从外植体的诱导到获得栽培苗只需要130天，试管苗移栽成活率可达90%以上。本发明开辟了一条人工快速繁殖红苞半蒴苣苔的途径，使红苞半蒴苣苔的规模化工业生产成为可能，从而为今后进一步保护和利用该物种奠定了良好的基础，具有广泛的应用前景。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。KT即激动素。IBA即3-吲哚丁酸。NAA即α-萘乙酸。红荀半蒴苣苔(Hemiboea rubribracteata):李振宇，刘演.广西半蒴苣苔属(苦苣苔科)一新种——红苞半蒴苣苔.植物分类学报，2004, 42 (6): 537-540.。MS培养基的组成见表I。
表IMS培养基的组成
权利要求
1.红苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步骤: (1)将红苞半蒴苣苔的叶片灭菌后切块，即为外植体； (2)将步骤(I)得到的外植体接种于诱导培养基上，20-28°C、光强为20μπιο1.πΓ2 s—1以下的条件下培养，获得不定芽； 所述诱导培养基的PH值为5.8-6.0 ;所述诱导培养基是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和IBA得到的，蔗糖的浓度为20-30g.L-1、KT的浓度为0.1-1.0mg.L-1、IBA的浓度为0.1-0.5mg.L 1 ； (3)将步骤(2)得到的不定芽转接至繁殖培养基，20-28°C光照培养，获得丛生芽； 所述繁殖培养基的PH值为5.8-6.0 ;所述繁殖培养基是在MS固体培养基中加入蔗糖、KT和NAA得到的，蔗糖的浓度为20-30g.L' KT的浓度为0.1-1.0mg.L' NAA的浓度为0.1-0.5mg.L 1 ； (4)将步骤(3)得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，20-28°C光照培养至生根； 所述生根培养基的PH值为5.8-6.0 ;所述生根培养基为培养基甲或培养基乙； 所述培养基甲的制备方法:在1/2MS固体培养基中加入蔗糖和IBA，蔗糖的浓度为20-30g.L' IBA 的浓度为 0.1-0.5mg.Γ1 ； 所述培养基乙的制备方法:在1/2MS固体培养基中加入蔗糖、IBA和活性炭，蔗糖的浓度为20-30g.L' IBA的浓度为 0.1-0.5mg.L'活性炭的浓度为0.1-0.5g/100mL。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(I)中所述灭菌的方法为:用质量百分含量为0.1%的HgCl2水溶液侵泡1.5-2.5分钟。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，所述培养的时间为30-50 天。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，所述培养为光照培养，每天的光照时间为12-14小时。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述光照培养的光强为50-80 μ mol.m_2.s_\每天的光照时间为14小时。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，每30-45天继代一次，每个继代周期增殖3.6-4.3倍。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述光照培养的时间为30-45天。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，所述光照培养的光强为50-80 μ mol.m_2.s_\每天的光照时间为14小时。
9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，所述光照培养的时间为30天。
10.如权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于:所述方法还包括将步骤(4)得到的生根的幼苗移栽至培养基质并培养，获得栽培苗的步骤；所述培养基质由1-2质量份石灰石、2-5质量份蛭石和1-2质量份河沙混合得到。
全文摘要
本发明公开了一种红苞半蒴苣苔的繁殖方法。本发明提供的红苞半蒴苣苔的繁殖方法，包括如下步骤(1)将红苞半蒴苣苔的叶片灭菌后切块，即为外植体；(2)将步骤(1)得到的外植体接种于诱导培养基上，20-28℃、光强为20μmol·m-2·s-1以下的条件下培养，获得不定芽；(3)将步骤(2)得到的不定芽转接至繁殖培养基，20-28℃光照培养，获得丛生芽；(4)将步骤(3)得到的丛生芽切分后转接至生根培养基，20-28℃光照培养至生根。本发明开辟了一条人工快速繁殖红苞半蒴苣苔的途径，使红苞半蒴苣苔的规模化工业生产成为可能，从而为今后进一步保护和利用该物种奠定了良好的基础，具有广泛的应用前景。
文档编号A01H4/00GK103141390SQ20131007776
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者石雷, 贾蕙宁, 陈维伦, 郭东红, 邢全, 李扬 申请人:中国科学院植物研究所