获得无融合生殖亚麻种子的方法
【专利摘要】本发明公开了获得无融合生殖亚麻种子的方法。该方法包括以亚麻H2010018为母本，以亚麻H2010049为父本进行杂交，得到杂交当代所结的种子，将所述杂交当代所结的种子进行种植培育至开花，去除花药未成熟花朵的所有雄蕊得到待诱导花朵，用亚麻失活花粉涂抹所述待诱导花朵的柱头并用10mg/L的2，4-D溶液处理所述待诱导花朵的子房壁完成诱导得到诱导花朵，收获诱导花朵所结的种子得到无融合生殖的亚麻种子；所述亚麻H2010018是以亚麻H04052为母本，以亚麻new1为父本进行杂交得到的杂种第一代；所述亚麻H2010049是以亚麻H04052为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到的杂种第一代。
【专利说明】获得无融合生殖亚麻种子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及获得无融合生殖亚麻种子的方法。
【背景技术】
[0002]无融合生殖是指不经过精卵融合即可繁殖后代的一种生殖方式，是以无性生殖的方式产生种子的过程。无融合生殖由于其具有固定杂种优势、加速育种进程、积累优良基因的优势，因此在农业生产及遗传育种上具有重要的意义和潜力[吴曼等，2010]。尽管目前已在被子植物52个科的400多种植物中发现了无融合生殖植物，但作物中普遍缺乏无融合生殖特性[郝建华等，2009]。自然界中植物无融合生殖常伴随着有性生殖发生，在一定条件下，即使专性无融合生殖后代中也偶尔出现有性生殖后代[Nogler，1984]，兼性无融合生殖体的有性胚与无性胚的比率也会受到外界环境因素如光周期、温度、无机盐以及营养水平的影响[郝建华等，2009]。开展可以达到人工诱导、调节和控制无融合生殖发生的工作，获得由无融合生殖产生的种子，可以简化育种中长期艰难的选择过程。
[0003]亚麻是自花授粉作物，育种周期较长，采用常规杂交方法育成一个品种需10?15年的时间。在亚麻的栽培种(Linum usitatissimum L.)内存在极少部分的多胚种质[康庆华，2004 ;康庆华等，2011]。这种多胚种质一般表现为双胚的发生，并且其中的一个胚通常是通过无融合生殖途径产生，即胚囊的配子体细胞不经受精而发育成胚胎个体，多数为单倍体，少数为纯合二倍体或镶嵌体。目前在已经检测过的材料中还没有发现通过珠被细胞经无性生殖产生的母体体细胞克隆。因此，在亚麻育种上，可利用无融合生殖进行单倍体育种，其产生的非受精 胚经筛选后进行表型选择。由于栽培种亚麻(Linum usitatissimumL.)内无融合生殖频率极低，为提高无融合生殖率，获得仅由无融合生殖产生的后代对育种十分有利。
[0004]栽培种亚麻(Linum usitatissimum L.) H04052是2004年黑龙江省农业科学院经济作物研究所采用自创的多胚品系与本所育成品种黑亚13号杂交选择育成的种质，该材料多胚率为0.5%?9% (康庆华等.多胚亚麻种质的研究与利用.中国麻业科学.179-201.2011 年第 33 卷第 4 期)。栽培种亚麻(Linum usitatissimum L.) new I (刘岩等.土壤外源重金属铬对亚麻形态学指标的影响.安徽农业科学.2012,40 (31):15167-15168)为2006年由黑龙江省农业科学院经济作物研究所从荷兰引进的高纤、抗倒纤维亚麻资源，在该所内经过三年扩繁和鉴定，原茎、全麻、种子产量分别达到5063.3公斤/公顷、1080.8公斤/公顷和714.0公斤/公顷；长麻率22.0%，全麻率30.3%。栽培种亚麻(Linum usitatissimum L.)H09052是2009年黑龙江省农业科学院经济作物研究所采用从俄罗斯引进的多胚资源与自创的双单倍体品系进行杂交选择育成的种质，该材料多胚率为
5.56% (康庆华等.多胚亚麻种质的研究与利用.中国麻业科学.179-201.2011年第33卷第4期)。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是获得无融合生殖亚麻种子的方法。
[0006]本发明所提供的获得无融合生殖亚麻种子的方法，包括以亚麻H2010018为母本，以亚麻H2010049为父本进行杂交，得到杂交当代所结的种子，将所述杂交当代所结的种子进行种植培育至开花，去除花药未成熟(开放前一天)花朵的所有花药得到待诱导花朵，用亚麻失活花粉涂抹所述待诱导花朵的柱头，并用10mg/L的2，4-D溶液处理所述待诱导花朵的子房壁完成诱导得到诱导花朵，收获所述诱导花朵所结的种子得到无融合生殖的亚麻种子;
[0007]所述亚麻H2010018是以亚麻H04052为母本，以亚麻newl为父本进行杂交得到的杂种第一代；
[0008]所述亚麻H2010049是以亚麻H04052为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到的杂种第一代。
[0009]上述方法中，用10mg/L的2，4_D溶液处理所述待诱导花朵的子房壁完成诱导具体可为向所 述待诱导花朵的子房壁滴注10mg/L的2，4-D溶液。
[0010]在本发明的一个实施方式中，用10mg/L的2，4-D溶液处理所述待诱导花朵的子房壁完成诱导的方法为向所述待诱导花朵的子房壁连续5天滴注10mg/L的2，4-D溶液，每天I次，每次0.5ml。
[0011]上述方法中，所述亚麻失活花粉是对来源于所述待诱导花朵所在植株的花粉进行灭活得到的没有活力的花粉。
[0012]上述方法中，所述亚麻失活花粉可按照包括如下步骤的方法制备:收集所述待诱导花朵所在植株的花粉，用体积百分比浓度为70%的乙醇水溶液浸泡14小时，除去乙醇得到失活花粉。
[0013]2，4-D在制备亚麻无融合生殖诱导剂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0014]该应用中，所述亚麻为以亚麻H2010018为母本，以亚麻H2010049为父本进行杂交，得到的杂交第一代；
[0015]所述亚麻H2010018是以亚麻H04052为母本，以亚麻newl为父本进行杂交得到杂种第一代；所述亚麻H2010049是以亚麻H04052为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到杂种第一代。
[0016]实验证明，10mg/L的2，4-D溶液可以在没有受精作用的情况下诱导亚麻H2011017无融合生殖，亚麻H2011017可做为亚麻无融合生殖种质的被选材料提供给育种者。
【具体实施方式】
[0017]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0018]下述实施例中的亚麻H04052 (康庆华等.多胚亚麻种质的研究与利用.中国麻业科学.179-201.2011年第33卷第4期)、H09052 (康庆华等.多胚亚麻种质的研究与利用.中国麻业科学.179-201.2011年第33卷第4期)、newl (刘岩等.土壤外源重金属铬对亚麻形态学指标的影响.安徽农业科学.2012，40 (31):15167-15168)，公众可从黑龙江省农业科学院经济作物研究所获得，以重复本申请实验。[0019]实施例1、获得无融合生殖亚麻种子
[0020]1.1试验材料
[0021]供试的亚麻材料有两个，分别是H2011017和H2011044。
[0022]H2011017是以亚麻H2010018为母本，以亚麻H2010049为父本进行杂交得到的杂交当代所结的种子及由它所长成的植株。H2011044以亚麻H2010020为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到的杂交当代所结的种子及由它所长成的植株。
[0023]其中，亚麻H2010018是以亚麻H04052为母本，以亚麻newl为父本进行杂交得到的杂种第一代；亚麻H2010049是以亚麻H04052为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到的杂种第一代；亚麻H2010020是以亚麻newl为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到的杂种第一代。
[0024]1.2试验方法
[0025]试验在黑龙江省农业科学院智能温室及盆栽场进行。实验重复三次，每次重复的实验方法如下:
[0026]选取H2011017的60粒健康饱满的种子(以亚麻H2010018为母本，以亚麻H2010049为父本进行杂交得到的杂交当代所结的种子)、H2011044的60粒健康饱满的种子(以亚麻H2010020为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到的杂交当代所结的种子)种植于盆内，生育前期放置于智能温室培养，后期搬置于盆栽场，整个生育期给以充足的水分及营养。温室昼夜温度:春季22/15±5°C ;夏季25/20±5°C。昼夜光照:16/8。
[0027]在亚麻初花期，选取第二天能够正常开花的花蕾去除所有雄蕊，套袋隔离，得到待诱导花朵。第二天早晨5:30-7 :30用亚麻失活花粉对待诱导花朵的柱头涂抹授粉，然后对子房壁进行生长调节剂滴注处理，连续滴注5天，每天早晨5:30-7:30滴注I次，每次0.5ml生长调节剂溶液，进行无融合生殖诱导。试验采用的生长调节剂分为12种处理:不同浓度的ΝΑΑ(α-萘乙酸)溶液处理(N-l、Ν_2、Ν_3和Ν_4)、不同浓度的KT(激动素，6-糠氨基嘌呤)溶液处理(Κ-1、Κ-2、Κ-3和Κ-4)、不同浓度的2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)溶液处理(D-l、D-2、D-3和D-4)，各处理的相应生长调节剂溶液的浓度分别如表I所示。同时设三种对照处理组:去雄后用失活花粉授粉，并用清水代替生长调节剂对子房进行滴注处理(CKl);去雄后不做任何处理(CK2);正常自花授粉，不做处理(CK3)。授粉3天后开始调查蒴果膨大情况。生长调节剂处理组及对照处理组的蒴果都在成熟期收获，并调查蒴果和种子产生情况，统计各处理总花朵数的成果数(成果标准:各处理蒴果成熟时体积大于或等于1/2本株正常自花授粉蒴果成熟时体积)、各处理总花朵数的结籽粒数(结籽的标准:成果内所获得的种子与本株正常自花授粉所得蒴果内的种子在饱满度、尺寸大小上相当)、坐果率％=每个处理总花朵的成果数/该处理总花朵数X 100 ;结籽率％=每个处理总花朵数的结籽粒数/该处理总花朵数XIOX 100。
[0028]其中，H2011017的待诱导花朵采用的亚麻失活花粉来自H2011017的待诱导花朵所在的植株，H2011044的待诱导花朵采用的亚麻失活花粉来自H2011044的待诱导花朵所在的植株。亚麻失活花粉的制备方法如下:收集亚麻待诱导花朵所在植株的花粉，用体积百分比浓度为70%的乙醇水溶液浸泡14小时，纯净水冲洗除去乙醇后800rpm/min离心5分钟收集沉淀得到亚麻失活花粉。
[0029]上述方法中，H2011017和 H2011044 均在 N_l、N_2、N_3、N-4、Κ_1、Κ_2、Κ_3、K-4、D-l、D-2、D-3、D-4、CKl和CK2这14种处理中，每个处理各进行3株，每株均全部诱导7个花朵进行统计。CK3中，H2011017和H2011044各选5朵自花授粉花朵进行检测。
[0030]表1.12种生长调节剂处理所采用的生长调节剂溶液及其浓度
[0031]
【权利要求】
1.获得无融合生殖亚麻种子的方法，包括以亚麻H2010018为母本，以亚麻H2010049为父本进行杂交，得到杂交当代所结的种子，将所述杂交当代所结的种子进行种植培育至开花，去除花药未成熟花朵的所有雄蕊得到待诱导花朵，用亚麻失活花粉涂抹所述待诱导花朵的柱头并用10mg/L的2，4-D溶液处理所述待诱导花朵的子房壁完成诱导得到诱导花朵，收获所述诱导花朵所结的种子得到无融合生殖的亚麻种子； 所述亚麻H2010018是以亚麻H04052为母本，以亚麻newl为父本进行杂交得到的杂种第一代； 所述亚麻H2010049是以亚麻H04052为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到的杂种第一代。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述亚麻失活花粉是对来源于所述待诱导花朵所在植株的花粉进行灭活得到的没有活力的花粉。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述亚麻失活花粉按照包括如下步骤的方法制备:收集所述待诱导花朵所在植株的花粉，用体积百分比浓度为70%的乙醇水溶液浸泡14小时，除去乙醇得到失活花粉。
4.2，4-D在制备亚麻无融合生殖诱导剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述亚麻为以亚麻H2010018为母本，以亚麻H2010049为父本进行杂交，得到的杂交第一代； 所述亚麻H2010018是以亚麻H04052为母本，以亚麻newl为父本进行杂交得到杂种第一代； 所述亚麻H2010049是以亚麻H04052为母本，以亚麻H09052为父本进行杂交得到杂种第一代。
【文档编号】A01H1/02GK103430831SQ201310355880
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】康庆华, 关凤芝, 吴广文, 黄文功, 江卫东, 赵东升, 宋喜霞, 刘岩, 吴建忠, 程莉莉, 于莹, 袁红梅, 姚玉波, 路颖, 杨学, 宋宪友, 王福亮, 孙中义, 徐涵 申请人:黑龙江省农业科学院经济作物研究所