一种百合酯类花香基因LoAAT1及其应用的制作方法

一种百合酯类花香基因LoAAT1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体公开了一种百合酯类花香基因LoAAT1及其应用。所述LoAAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～2所示；基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。LoAAT1基因在有香味的百合花组织表达，在无香味的百合品种中不表达，并且其表达与花发育进程有关。将LoAAT1基因可以连接到任意一种植物转化载体，然后导入百合或其它植物细胞中，可获得表达所述基因的转基因花香，从而用于生产；也可以根据本发明所述基因序列信息产生特异性的分子标记，用于鉴定百合或其它植物的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
【专利说明】一种百合酯类花香基因LoAAT1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地，涉及一种百合酯类花香基因LoAAT1及其应用。
【背景技术】
[0002]大多数植物的花香是由一系列低分子量的挥发物混合在一起形成，其化学成分主要是職烯类化合物、苯丙酸类化合物/苯环型化合物和脂肪酸衍生物(Pichersky et al,2006 ；Dudareva et a7，2004)。经莽草酸途径形成的苯丙烷类酯类成分苯甲酸乙酯是百合主要特征香气成分之一(范燕萍，2008)。
[0003]苯甲酸乙酯是苯丙酸类化合物/苯环型化合物，它是以L-苯丙氨酸前体的。在质体中通过莽草酸途径产生苯丙氨酸，在苯丙氨酸裂解酶(PAL)的催化作用下生成肉桂酸。肉桂酸在一系列酶的催化作用下合成苯甲醛、苯甲酸，在苯甲酸辅酶A连接酶(BZL)作用下，苯甲酸形成苯甲酰CoA (Boatright J.et a7, 2004),最后在醇酰基转移酶(AAT)催化下生成，该酶是控制苯甲酸乙酯形成的末端关键酶。
[0004]Nordstrom (1962)首次指出酵母中酯类合成主要依靠酰基转移酶或酯合成酶的作用。到目前为止，已从不同的酵母中克隆出三个不同的醇酰基转移酶基因。花和果实是植物体中酯类挥发性成分合成的主要器官，成熟酯类挥发性成分构成了花和果实特有的香气，这一过程也与醇酰基转移酶有关。Ueda和0gata(1977)发现香蕉细胞提取液中的酯类挥发性香气成分的合成依赖酰基CoA和酰基转移酶。此后，人们在草莓、苹果、菠萝、甜瓜等水果中研究了醇酰基转移酶与酯类挥发性物质合成之间的关系。这些果实中酯类物质的形成都是在醇酰基转移酶的作用下，将酰基CoAs中的酰基转移到醇类底物形成了酯。Perezet al.(1993)对4个草莓品种果实成熟期间AAT活性的研究表明，各品种AAT活性均随果实成熟而增加，但不同品种最大活性差异很大。Shalit et al.(2001)的研究表明，富有香气的甜瓜品种‘Arava’成熟果实与未熟果实中香气挥发性成分组成显著不同。
[0005]近年来，随着生物技术的发展，已经在花和果实中克隆了几个醇酰基转移酶基因。研究发现，这些结构和功能类似的酶是酰基转移酶类(EC 2.3.1.X)进化来的一个新类别，都属于酰基转移酶类的BAHD基因家族。植物中最早分离出的醇酰基转移酶基因来自Clarkia breweri花，编码苯甲醇乙酰转移酶,调控了乙酸苯甲酯的代谢,属于酰基转移酶的 BAHD 家族(Dudareva et al, 1998)0 D，Auria et al.(2002)米用表达序列标签(EST)文库搜索结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术从仙女扇中获得了 BEBT的cDNA的全长。该基因与植物酰基转移酶基因序列具有很大的同源性，属于酰基转移酶中的BAHD家族。沒妨在花和受伤的叶片中都有表达，表明苯甲酸苄酯在植物防御机制中也起一定作用。
[0006]Aharoni et al.(2000)首次采用表达序列标签(EST)文库搜索结合植物挥发性成分谱，利用cDNA芯片从成熟草莓果实中分离了一个新的与芳香气味相关的醇酰基转移酶基因说义几它具有催化中链脂肪酸乙酸酯形成的能力。在Charentais甜瓜中克隆出两个具有高度同源性(87%，在蛋白水平确定)的醇酰基转移酶基因，CM-AATl (GenBankCAA94432)和 CM-AAT2 (GenBank AF468022)，编码 461 个氨基酸，分子量分别为 51.5KD 和51.8 KD, pi分别为8和8.5。转化酵母发现CM-AATl具有合成酯类挥发性成分的能力，而CM-AAT2没有检测到醇酰基转移酶活性。Shalit et al.(2003)在含有1834个单基因的玫瑰花EST数据库中检索，发现3个可能的EST序列与已知的其它来源的BAHD醇酰基转移酶基因相似。其中一个cDNA被命名为编码一个458个氨基酸残基的多肽，其分子量51.8 KD, pi 5.45，属于BAHD酰基转移酶家族。通过同源性比较，这个蛋白序列与草莓SAAT蛋白具有69%的同源性。Boatright et al.(2004)在对矮牵牛的研究中，运用功能基因组学的方法克隆出苯甲醇/苯基乙醇苯甲酰转移酶基因(沒/货/)。该基因的氨基酸序列与烟草的BEBT基因和仙女扇的说以7都具有较高的同源性。苯甲醇/苯乙醇苯甲酰基转移酶以苯甲酰辅酶A为苯甲酰基供体，以苯甲醇和苯基乙醇为前体，将苯甲酰基转移至苯甲醇和苯乙醇上，形成苯甲酸苄酯和苯甲酸苯乙酯。Li et al.(2006)通过RT-PCR和RACE-PCR技术分离了乔纳金苹果和金冠苹果果实中的醇酰基转移酶基因，分别命名为MdAAn和MdAA 2ο其全长分别为:1,639 bp和1，628 bp，二者在氨基酸水平上的同源性为94.26%。序列比对发现量偏72也含有BAHD基因家族和其它已知醇酰基转移酶基因共有的保守区=HXXXD和FGWG。聚类分析发现，MdAAT2蛋白与同属蔷薇科仁果类的梨果实醇酰基转移酶蛋白亲缘关系最近，而与柠檬、草莓、玫瑰花等醇酰基转移酶蛋白亲缘关系较远。此外，Yoshioka和Hashimoto (1981)在酵母研究中发现醇酰基转移酶是定位在细胞膜上，并对该酶的酶学特性进行了初步的研究。D’ Auria (2002)认为大部分BAHD家族的成员被认为定位于细胞质。Fujiwara et al.(1998)对三花龙胆)的 5_0_ 葡萄糖苷芳香族酰基转移酶进行免疫定位研究发现其主要分布于上表皮细胞的细胞质中。然而 Yu et al.(2008)发现蔡藜苜猜(ifet/icago trunca tula )中的 BAHD 家族的 MtMaTl 则是定位于细胞核中。
[0007]近年来，植物花香次生生物合成的基因操作已成为一个热门的研究领域。Guterman et al.(2006)将从月季中克隆的也导入矮牵牛中，结果在转基因植株中产生乙酸卞酯和乙酸苯乙酯。这为采用基因工程技术培育香花品种提供了一条有效的途径。

【发明内容】

[0008]目前，国内对醇酰基转移酶与花香形成的研究鲜见报道，直到本专利申请前没有发现对百合花香基因报道。克隆花香基因是对百合花香形成机理研究的前提，揭示百合花香的分子机理可以增加花香。这为采用基因工程的方法培育具浓郁花香植物新品种提供了一条崭新的途径。本发明的目的是分离克隆西伯利亚百合百合花中携带的一个控制酯类花香成分苯甲酸乙酯的基因。
[0009]本发明另一目的在于提供上述基因编码的蛋白质。
[0010]本发明另一目的在于提供含有上述基因的载体。
`[0011]本发明另一目的在于提供含有上述载体的转基因植物。
[0012]本发明还有一个目的在于提供上述基因在产生分子标记及其在选育对花香品种中的应用，以及上述基因编码的蛋白质在制备香精和药物中的应用。
[0013]本发明通过以下技术方案予以实现上述目的:
一种百合酯类花香基因所述基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，全长cDNA序列长1380bp ;基因的全长DNA序列如SEQ ID NO: 2所示，全长DNA序列长1472bp。
[0014]百合酯类花香基因赋予姜花花朵沉香醇香味，而且百合酯类花香基因77在有香味的百合花组织表达，在无香味的百合品种中不表达，并且其表达与花发育
进程有关。该基因基因编码区共1380bp (即全长cDNA序列)，推测其编码459个氨基酸，蛋白分子量为50 kDa。在这个基因序列中有HXXXD和DFGWG两个保守序列，DNA全长核苷酸序列长度为1472bp，包含I个内含子，位于第442?533位，共有92bp，且剪切位置均符合“GT-AG法则”。通过原核表达并用反应底物乙醇和苯甲酰辅酶A反应体外生成苯甲酸乙酯。
[0015]一种百合酯类花香基因编码的蛋白质，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
[0016]一对用于扩增 百合酯类花香基因ZoW77的引物，引物序列如SEQ ID NO: 10?11所示。
[0017]一种重组载体，在出发载体的多克隆位点插入，权利要求1所述百合酯类花香基因的序列。所述出发载体可以是本【技术领域】中经常用到的所有类型的植物表达载体，优选地，本发明所用的植物表达载体为pMOGMON植物表达载体。
[0018]一种包含如上所述重组载体的重组菌。一种包含如上所述重组载体的细胞系。
[0019]一种转基因植物，含有如上所述载体。
[0020]如上所述百合酯类花香基因LoAATl的应用，具体为将百合酯类花香基因LoAATl连接到植物转化载体中，然后导入百合或其它植物细胞中，获得表达所述百合酯类花香基因LoAATl的转基因花香品种。
[0021]如上所述百合酯类花香基因的应用，具体为根据该基因产生特异性的分子标记，用于鉴定百合或其它植物的花香基因型。
[0022]如上所述百合酯类花香基因编码的蛋白质在制备香精和药物中的应用。
[0023]本发明同样包括将花香基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗性反应得到人为的控制。其中环境条件包含病虫害的攻击、高低温和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。
[0024]根据本发明提供的基因序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与等同的基因:(1)通过数据库检索获得；(2)以基因片段为探针筛选姜花或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从姜花或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在LoAATl基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。
[0025]本发明提供的百合花香基因具有重要的应用价值。应用之一是将所述的LoAATl基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将花香基因导入百合或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因花香，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物产生花香和增强抗性的能力。
[0026]本发明提供的花香基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、SSR (简单序列重复多态)、RFLP (限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用这些标记可鉴定百合或其它植物的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
[0027]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明将克隆的花香基因转入无花香的植物，有助于产生新的花香植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个花香基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。花香基因的克隆是克服传统育种中不能在植物种间转移花香基因的问题的前提。另外，本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的花香的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株。
[0028]说明书附图
图1.LoAATl在花香苯甲酸乙酯释放量不同的百合品种中的表达；A:百合花瓣花香主成分苯甲酸乙酯的释放量；B:百合花瓣ZW777表达水平；C:不同的百合品种。
[0029]图2.LoAATl在花器官不同发育时期的表达和不同组织表达特异性；A =Siberia百合不同器官表达水平；B = Siberia百合花朵不同花发育时期苯甲酸乙酯的释放量；C:Siberia百合不同开花时期；D:Siberia百合花瓣77表达量；E:Siberia百合花尊LoAATl表达量；F:Siberia百合雄蕊77表达量；G:Siberia百合雌蕊表达量。
[0030]图3.重组蛋白体外酶催化反应；A:pET-28a-重组蛋白体外酶催化反应产物色谱和质谱分析图:苯甲酸乙酯标样色谱和质谱分析图。
[0031]图4.77转基因烟草植株的PCR检测图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法均为本领域常规使用的试剂和方法。
[0033]实施例1 LoAATl基因cDNA和DNA全长的获得:
S1.百合花瓣RNA的提取:称取0.2g百合盛开期花瓣，加液氮迅速研磨成粉末状，快速转入4°C存放的加有0.5 mL2 % CTAB (含0.1 %的巯基乙醇)提取液的2 mL离心管中，振荡至彻底混勻；室温放置5min,平放离心管,使表面积最大；4°C 12000rpm离心lmin,上清转入新的无RNase离心管。加入0.lmL5M NaCl,温和混勻；加入0.3mL氯仿,上下颠倒混匀；4°C 12000rpm离心lOmin，取上层水相转入新的无RNase离心管。加入与所得水相等体积的预冷的异丙醇，颠倒混勻，室温放置IOmin,平放离心管,使表面积最大；4°C 12000 rpm离心lOmin，弃掉上清，注意不要倒出沉淀，加I mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤RNA沉淀，颠倒混勻；4°C 5000 rpm离心3min,倒出液体,注意不要倒出沉淀。剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温晾干2?3 min ;加入30μ? DEPC H2O,反复吹打，混匀，充分溶解RNA。放于_80°C保存备用。
[0034]S2.以百合盛开期的花瓣总RNA作为模板，用生工M-MuLV First cDNA SynthesisKit合成第一链cDNA。据GenBank核酸数据库中报道的相关基因序列设计引物，上游引物Fl:TCTCCAAGGCTCTGGTGTTCTA(T/C) TA(T/C) CC(A/C/G/T) (G/T/C) T ;如 SEQ ID NO:4 所示。下游引物 Rl:TGCATGAACCTGATAGCGAAG (A/G) (T/C) (A/G) AA (A/C/G/T) CC (A/C/G/T ) CC ;如SEQ ID N0:5所示。并交由上海生物工程公司合成。以上述合成的cDNA为模板采用TaKaRaPCR Amplification Kit进行PCR扩增反应，具体方法按照说明书进行。PCR程序为:94°C预变性4min ;94°C变性30s、57°C复性30s、72°C延伸lmin，30个循环；然后72°C延伸lOmin。在一 20°C下保存备用。PCR反应结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳初步检测PCR产物中是否含有目的片段条带。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用手术刀在紫外灯下切出含有目的片段的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit,TaKaRa)进行回收，回收方法基本参照试剂盒说明书。之后要对回收产物进行1%琼脂糖电泳检测，看其回收效果及大致浓度，以便保证后续试验的进行。根据回收的目的片段大小及其有效浓度，取适量回收纯化的产物与克隆载体连接，载体选用TaKaRa pMD18_T载体，目的DNA与克隆载体的摩尔比控制在3:1左右，具体操作按说明书进行。在16°C下恒温连接3?6h，连接时间的长短视目的片段的长度而定。提前将感受态细胞DH5 a (TaKaRa)从一80°C冰箱取出，并置于冰盒中待其自然融化，将IOPL连接液全量加入感受态细胞的离心管中，冰浴30min后，42°C水浴热激50s，迅速冰上放置2?5min，然后加入37°C预温的SOC液体培养基890μ?补足到lmL，混匀后37°C下180rpm振荡培养Ih。在含lOOPg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板表面上涂30μ?的X-gal (20mg/mL)和30μ? IPTG (20mg/mL),然后涂布适量转化液，待转化液完全被吸收后倒置于37°C恒温箱中过夜培养，约16h后观察结果，通过X-gal/IPTG蓝白斑筛选白色菌落，并初步鉴定重组质粒，平板置于4°C保存。通过蓝白斑初步筛选后，通常选6个菌斑摇菌后提取质粒，用于进一步鉴定。用灭菌的牙签从LB平板培养基上挑取白色单菌落接种于含有lOOPg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于控温震荡水浴摇床上37°C、240rpm振荡过夜培养，用质粒DNA小抽试剂盒(上海博亚生物有限公司)提取质粒，步骤按说明书上方法进行。对所提质粒进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，比较质粒大小并将明显滞后的质粒进行双酶切(及7? I /Hind III, TaKaRa)分析。在37°C下酶切Ih后，对酶切产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。随意选送酶切鉴定后含目的片段的重组质粒进行DNA序列测定。测序工作交由上海英骏生物技术有限公司完成，采用美国ABI377序列分析仪。所得的序列在NCBI进行比对和同源性分析。
[0035]根据已得到的cDNA片段序列,利用生物软件Primer Premier 5.0在靠近片段序列的 3'端设计两个特异引物，3' -RACE 1st Primer:GAGTTGCTCTTCGACGTTGAG ;如 SEQ IDNO:6 所示；3' -RACE 2nd Primer:CGCTGATCCTAATTCAGGTGACTC ;如 SEQ ID NO: 7 所示。经生物软件Oligo 6.0分析后交由上海生物工程公司合成。以01igo(dT)-3'末端锚定引物为引物，反转录合成cDNA第一链。将合成的cDNA第一链作为模板，用3' —回引物与3'末端锚定引物进行3'末端PCR扩增。PCR程序为:94°C预变性3min;94°C变性30s、复性30s (温度视具体而定)、72°C延伸lmin，30个循环；然后72°C总延伸lOmin。第一次PCR反应液稀释10-100倍后作为模板，用3' 二回巢式引物进行第二次PCR反应。PCR反应结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳初步检测PCR产物中是否含有目的片段条带。经过回收、检测，随机选送酶切鉴定后含目的片段的重组质粒进行DNA序列测定。测序工作交由上海英骏生物技术有限公司完成，采用美国ABI377序列分析仪。把测序结果与cDNA片段的序列进行拼接分析，判断其是否是cDNA片段序列3'的延伸。
[0036]同样利用已知的cDNA片段序列，在靠近其5'末端的位置设计一对引物，5' -RACE 1st Primer:CGAGCCGAACATTGGCATCAG ;如 SEQ ID N0:8 所示；3' -RACE 2ndPrimer:TAGAACACCAGAGCCTTGGA ;如SEQ ID NO:9所示。采用Y端加接头的方法进行，经回收、检测，随机选送酶切鉴定后含目的片段的重组质粒进行DNA序列测定。测序工作交由上海英骏生物技术有限公司完成。把测序结果与cDNA片段的序列进行拼接分析，判断其是否是cDNA片段序列5'的延伸。
[0037]对所得到的片段序列、3 和5 序列进行Blast分析后，利用DNAstar软件包的SeqMan程序将三个片段进行比对拼接，拼接所得序列即为萜类合成酶基因cDNA全长序列。拼接所得的cDNA全长序列再在NCBI上对核苷酸序列及推导的蛋白质序列进行同源性比较和分析。
[0038]基因cDNA全长序列的犾得:
根据已经得到的基因cDNA全长，设计并合成上下游引物，Hctpsl-Pl:ATGGCATCATCCCTCACTTTCTC ;如SEQ ID NO: 10所示。Hctpsl_P2:CTA GAGGGCAGAAGCAATAAAC ；如 SEQ ID NO: 11 所示。以百合 cDNA 为模板，采用 TaKaRa PCR Amplification Kit 进行PCR扩增反应。反应条件为:94°C预变性4min ;94°C变性30s、复性30s (温度视具体而定)、72°C延伸3min，35个循环；然后72°C总延伸lOmin。取5PLPCR产物在含溴化乙锭0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，紫外光下观察实验结果。
[0039]应用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa),按照操作说明，将PCR产物纯化回收，回收产物溶解于25PLElution Buffer中。取纯化回收产物4gL、pMD20_TVector ?μ?、连接液Solution I 5μ?,组成10μ?的连接体系，16°C下连接过夜。转化大肠杆菌菌株DH5a感受态细胞，涂布于含有X-gal、IPTG、氨苄青霉素的LB固体培养基上，37°C培养过夜；然后挑选白色克隆斑20个于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C、240rpm扩大培养16-24h ;用质粒DNA小抽试剂盒(上海博亚生物有限公司)提取质粒，琼脂糖凝胶电泳比较质粒大小并将明显滞后的质粒进行酶切鉴定。从鉴定出的阳性重组质粒中随机挑选，送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。获得1AAH基因的全长cDNA序列和全长DNA序列，根据cDNA序列推测出其蛋白序列。
[0040]实施例2 77基因的表达分析:
不同品种百合花瓣，西伯利亚百合不同发育时期花瓣及西伯利亚百合不同组织部位的RNA提取使用Trizol法(TaKaRa)，荧光定量PCR采用SYBR green(TaRaKa)法，染料法的具体原理见说明书。利用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物，按荧光定量PCR引物设计原则，用Primer premier 5.0分别设计引物，通过荧光定量PCR检测其是否有错配或引物二聚体及其扩增效率，从中选择一对最佳引物，Pl:ATTGTGGTGCCAGTTTGCTTGC ；如 SEQ ID NO: 12 所示。P2:CCCTTTTACCCTTCGTTGAACTTC ;如 SEQ ID NO: 13 所示。内参基因ACT根据Real-time PCR引物的设计原则，用Primer premier 5.0设计引物，ACT-Pl:TTCGTGTTGCACCAGAAGAGdnSEQ ID NO: 14所示，ACT-P2:TGAATGGCGACATACATGGCAG ;如 SEQID N0:15所示。通过Real-time PCR进行检测，并制作标准曲线，以检测其扩增效率(E)是否在90?110%范围内进行筛选。以各样品的cDNA为模板，在ABI荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应。每个样品设3个重复，以ddH20为阴性对照。反应体系为SYBR PremixEx Taq (TaKa Ra)10.0 μ?，上游引物(10 μΜ) 0.4 μ?，下游引物(10 μΜ) 0.4 μ?, cDNA 2.0μ?, ddH20 7.2μ?。反应程序为 94°C，30 s ；94°C, 15 s ；55°C,30 s ；72°C,30 min;40个循环，94°C 15 s, 72°C 30 s, 0.4°C /s融解曲线分析。反应结束后确认扩增曲线和融解曲线，用 2-AAct 法(2 (-Delta Delta C(T)), Livak and Schmittgen, 2001)进行数据分析,计算百合1AAH在不同样品中的表达情况。基因表达分析结果见图1和图2。从图1和图2中可以看出:
77仅在有花香主成分苯甲酸乙酯释放的百合品种花瓣中表达，没有改成分释放的品种中不表达，且表达量与花香释放量成显著正相关'LoAATl仅在百合花器官中表达，在根、茎和叶等营养器官不表达，该基因的表达量与不同开花时期成显著正相关，苯甲酸乙酯释放量最多盛花期花瓣77表达量最 高，而不香的蕾期则不表达，说明77是控制百合花香主成分苯甲酸乙酯合成释放的关键基因。
[0041]实施例3 汝基因原核表达:
S1.根据所得到基因的cDNA全长，用包含feMlI和Afoi I酶切位点的特异引物进行PCR扩增。PCR产物用Takara回收试剂盒回收，回收产物直接用和AbtI限制性内切酶进行双酶切，1%琼脂糖凝胶回收目的片段。pET-28a原核表达载体用Bamm和AbtI限制酶进行双酶切1%琼脂糖凝胶回收大片段。于16°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌(M.coli ) DH5 α感受态细胞；提取质粒经酶切和测序鉴定后，获得重组原核表达载体。
[0042]S2.用经鉴定的重组质粒DNA转化大肠杆菌(Rosetta)感受态细胞，挑取单菌落接种于5mL LB (含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)培养基中，37°C震荡培养过夜。转接100 μ?种子液于新鲜的IOOml(含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)的LB培养基中，37°C 180rpm培养4?6h，测OD值至0.4?0.6后用一定量的IPTG (0.1?0.2mM)在14?18°C诱导14?16h。同时取另一对照组其中未加IPTG诱导。离心收集菌体，用5ml裂解buffer (50mM磷酸buffer pH 8.0)悬浮细胞，将菌体冷却，置于冰上超声波破碎细胞。12000rpm，4°C离心IOmin,将上清移至新的离心管中，用双蒸水清洗沉淀一次,再用5mL裂解buffer悬浮沉淀。分别取上清和沉淀各50 μ?，保存与-20°c，进行SDS-PAGE电泳分析。配制12.5% SDS聚丙烯酰胺凝胶，按照顺序上样。分别用60V和120V的电压对浓缩胶和分离胶的进行电泳。电泳完毕，考马斯亮蓝染色30min，再用脱色液脱色I?8h，观察并记录试验结果。
[0043]S3.蛋白的纯化:挑取单菌落接种于5ml的液体LB培养基中，37°C，180rpm，培养过夜，后全部转接至500mL的新鲜液体LB培养集中，37°C，180rpm，培养4h，用IPTG (0.1?0.2 mM)，18°C条件下诱导16h后，收集菌体。取200μ?菌体于离心管中，4°C保存，进行SDS-PAGE电泳分析。用5mL的裂解buffer悬浮细胞并转移至离心管内，置于冰上使菌体始终保持冷却，超声波破碎细胞。10，000 X g，4°C离心20?30 min，收集上清液。取20 μ?的上清于_20°C保存，进行SDS-PAGE分析。向5mL细胞裂解液中加入I?2mL的N1-NTAresin (镍一次氮基三乙酸树脂填料)混勻，并低速在4°C摇床上结合60min。将结合完全的细胞裂解液和树脂混合物装入层析柱中，移走底部盖帽收集流出液部分(flow-thixmghfraction,F),取20μ?的流出液，于_20°C保存,进行SDS-PAGE分析。用4ml的洗漆buffer洗脱层析柱两次，收集每部分的洗脱液(wash fraction, W),各取20 PL保存于_20°C冰箱中作SDS-PAGE分析。用0.5mL的洗脱buffer洗柱四次，分别用不同的收集管依次收集每部分的洗脱液(elution fraction, E),分别标记为El, E2, E3, E4,各取20μ?进行SDS-PAGE分析。根据SDS-PAGE的检测结果，集中含有目标蛋白洗脱部分于一个离心管中，用移液器转移至透析袋中，4°C透析过夜。收集透析后的溶液，加入甘油使蛋白溶液中甘油总含量为20%，并且以200 μ? /管的量进行分装，取微量进行SDS-PAGE蛋白浓度检测，其余的放于_70°C超低温冰箱进行保存备用。
[0044]S4.醇酰基合成酶酶活性鉴定:转接100 μ种子液于新鲜的200mL (含25 mg /LKan, 34 mg /L ChD的LB培养基中，37°C 180rpm培养4-6h，测OD值至0.4-0.6后用一定量的 IPTG (0.1 -0.2mM)在 14 -18°C诱导 14 -16h。5000rpm，4°C离心 5min 离心收集菌体，用5mLbuffer (IOmM MOPS buffer pH 7.0 10%甘油ImM DTT)悬浮细胞，置于冰上超声波破碎细胞。12000rpm，4°C离心20min，将上清移至新的离心管中。
[0045]S5.酶促反应及 GC-MS 分析:将 80 μ? 50μΜ pH 8.0Tris-HCl，酶提取液 50μ?，0.05μΜ苯甲酰CoA 20μ?溶液，5.8 μ? 20Mm的乙醇溶液，巯基乙醇溶液2 Pl-PddH2O 842.2PL加入样品瓶中密封，将75Mm聚二甲基氧烷(PMDS)萃取纤维头插入玻璃瓶中，28°C水浴lh，顶空固相微萃取，反应结束后将萃取纤维头放至气相色谱-质谱连用仪中进行分析，气相色谱条件为:色谱柱为HP-1NN0WAX柱(30mX0.25mm);载气为高纯氦气，分流比20:1，柱前压50 Pa，流量I mL /min ;取样时间2min ;程序升温:柱起始温度45 °C，保持2min，以5V /min的速度升至80 °C保持lmin,然后以10°C /min的速度升至250°C保持5 min。质谱条件为=GC-MS的接口温度220 °C，电子轰击源E1、350V ;离子源温度170 °C ;电子能量70eV ;扫描质量范围35-335aum，采集到的质谱图用WILLEY/MAINLIB库进行分析。原核表达结果见图3。从图3中可以看出:以乙醇和苯甲酰CoA为底物的pET-28a- Lo-AATl体外酶催化反应产物经质谱鉴定为苯甲酸乙酯，与采用苯甲酸乙酯标样色谱和质谱图相一致，说明该基因编码生成的酶是一种以乙醇与苯甲酰CoA为底物合成苯甲酸乙酯的酶，该基因为乙醇苯甲酰基转移酶基因。
[0046]实施例4 LoAATl对烟草的遗传转化:
S1.载体构建及农杆菌转化--将1AAn基因的全长CDNA序列用&ORI和汉酶切，回收目的片段；载体pMOGMON用&0RI和汉-bHI酶切，纯化回收相应大小的片段，连接，转化DH5 α，提质粒，酶切鉴定，挑出所需克隆，测序，并将其转化到农杆菌LBA4404中。
[0047]S2.烟草转化:将烟草“W38”叶片(0.5 cmX0.5 cm的方块)在培养基中预培养2-3 d，用步骤SI得到的OD6tltl 0.5-0.8的农杆菌LBA4404菌液，浸染5-lOmin，然后共培养3 d，烟草在含有20 mg/L潮霉素Hyg ,400 mg/L头孢霉素Cef的培养基上，矮牵牛在含有5 mg/L潮霉素Hyg、400 mg/L头孢霉素Cef的培养基上，在光照2000-lOOOOLx，25 1:条件下进行选择培养。选择培养2-3周后，外植体的转化细胞将产生抗性愈伤组织，将材料转入相应的选择分化培养基中进行分化出芽培养，待不定芽长至I cm以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养，每瓶插入2-3棵小苗，进行生根诱导。将根长至约4-5 cm健壮小苗，炼苗5-6d，炼苗结束后，清水洗净根部培养基，进行移栽。[0048]S3.转基因烟草基因组DNA的提取:
S31.取0.2 g材料，加入液氮研磨成粉末，将磨好的材料转入2 ml的离心管中，加入I ml预热2 % CTAB提取液(含0.1 %的巯基乙醇)，充分混匀，置于65°C水浴45 min，6-8min 混勻一次。10000 rpm,离心 5 min。
[0049]S32.冷至室温，取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1 )，轻轻混匀至溶液成乳化状，10000 rpm,离心5 min。
[0050]S33.取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇，-20°C放置30min。10000 rpm离心5min,弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2-3次。加入200 μ I TE溶液溶解。
[0051]S34.加入1/10体积NaAC (3 mol/L)和2倍体积的无水乙醇，_20°C放置2h以上。12000 rpm离心5min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗漆2-3次,室温干燥沉淀。用20-50 μ?ΙΧΤΕ 溶解，_20°C保存。
[0052]S4.转基因烟草PCR检测:以转化菌液为阳性对照，未转化DNA作阴性对照，进行PCR扩增体系。
[0053]上游引物F2:CTT CTA CAC AGC CAT CGG TCC AGA ;如 SEQ ID NO: 16 所示。
[0054]下游引物R2:GAT GTA GGA GGG CGT GGA TAT GTC ；如 SEQ ID NO: 17 所示。
[0055]反应体系(20μυ:转基因植株 DNA ?μ? (20ng"50ng) ； 10 X buffer 2μ? ；MgCl2 (2.5mM) 2μ? ；Taq 酶 0.2μ? ； dNTP (2.5mM) 2μ? ;引物各加 ΙΟμΜ ;加无菌水至 25μ?。
[0056]反应条件-MV，4分钟-MV，30秒；54°C，30秒；72°C，I分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。筛选出PCR阳性植株(图4)。
[0057]S5.转基因烟草植株挥发性物质SPME-GC/MS分析:采用固相微萃取一气相色谱质谱方法分析。将烟草小苗从基质中取出，洗净，置于2.5 L密封箱中，加入31.6 ng/ L(100μΜ SNP处理为316 ng/ L)的癸酸乙酯10 PL作为内标物，用聚四氟乙烯衬里的硅橡胶垫密封，插入100 Mm聚二甲基娃氧烧(PMDS)萃取纤维头,于25°C温下顶空取样30 min。米用FINNIGAN TRACE MS气质联用仪(美国)进行分析。色谱条件为DB-5石英毛细管柱长30m,内径0.25 mm,液膜厚0.25 Mm,载气He，柱头压力68.974 kPa，程序分流/不分流(LSS)进样口温度250°C。程序升温:50°C，保持2 min ;以3°C /min的升温速度升至250°C，保持30 min。在SPME分析中，PSS进样口设定为不分流进样方式，不分流时间为2 min，衬管采用1.5 mm内径的玻璃管，脱附时间为3 min ;在DHS进样口分流比为20:1，进样量为2.0 μ?。GC/MS传输线温度为250°C，质量扫描范围是30-350 aMm，扫描时间0.3 S，扫描间隔0.2s，EI离子源温度170°C，EI电子能量70 eV，光电倍增管(PMT)电压230 V，对采集到的质谱图用WILEY、MAINLIB、REPLIB及NISTDEM0 4个库进行分析，并根据各组分峰面积与内标癸酸乙酯峰面积之比定量，确定烟草挥发性物质的化学成分。结果表明:野生型烟草中主要的挥发物是乙酸叶醇酯和叶醇，含量分别为0.241 Pg/gFW.h和0.263 Pg/gFW.h ;而转基因植株中有苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯和2-羟基苯甲酸甲酯，它们挥发量分别是0.020 μδ/gFW.h、0.349 Pg/gFW.h和0.044 Pg/gFW.h，其中苯甲酸乙酯是主要的挥发成分。这说明醇酰基转移酶基因77在烟草中正义表达改变了烟草叶片挥发性成分的组成，苯甲酸乙酯挥发量有较大提高。
【权利要求】
1.一种百合酯类花香基因ZoA/7，其特征在于，所述基因的全长CDNA序列如SEQ IDNO:1所示；基因的全长DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.一种百合酯类花香基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:3 所示。
3.一对用于扩增百合酯类花香基因的引物，其特征在于，引物序列如SEQ IDNO: 10?11所示。
4.一种重组载体，其特征在于，在出发载体的多克隆位点插入，权利要求1所述百合酯类花香基因77的序列。
5.一种包含权利要求4所述重组载体的重组菌。
6.一种包含权利要求4所述重组载体的细胞系。
7.—种转基因植物，其特征在于，含有权利要求4所述载体。
8.权利要求1所述百合酯类花香基因的应用，其特征在于，将百合酯类花香基因77连接到植物转化载体中，然后导入百合或其它植物细胞中，获得表达所述百合酯类花香基因的转基因花香品种。
9.权利要求1所述百合酯类花香基因的应用，其特征在于，根据该基因产生特异性的分子标记，用于鉴定百合或其它植物的花香基因型。
10.权利要求2所述百合酯类花香基因编码的蛋白质在制备香精和药物中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103436537SQ201310369037
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】范燕萍, 刘芳, 尹君乐, 余让才, 王文君, 李满意, 黄丽君, 岳跃冲, 玉云祎 申请人:华南农业大学