一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法。按如下四个步骤进行：（1）配制培养基（2）采集枝条（3）枝条消毒（4）接种。采用本项发明有效降低了滨梅茎段外生菌和内生菌染菌率，死亡率减少到10%以下，无菌苗获得率高于80%。本发明操作简单，成本低廉，易于推广。
【专利说明】一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法。
【背景技术】
[0002]滨梅(Prunus maritima)是蔷薇科楼桃属的一种沙生灌木果树,原产于美国大西洋沿岸，从纽芬兰到北卡罗来纳州均有分布。滨梅春季开白色花朵，有着很高的观赏意义。其果实酸甜可口，叶片可提取绿色染料，种子可提取植物油等，在盐溃土壤地区具有很高的经济价值。滨梅还具有抗干旱、耐盐碱的特性，可以适应海滨的恶劣条件，在海滨滩涂的生态修复与水土保持上有着非常重要的作用。目前滨梅在中国的引种和栽培已获得成功。然而滨梅的引种成活率低，采用种子和扦插等方式进行繁殖又极为困难，因此组织培养成为其种苗繁殖的重要途径。然而植物组织培养过程中仍然存在不少问题，其中在获取无菌苗时采用的传统消毒技术只能降低外植体感染外生菌的几率，而滨梅外植体的内生菌感染率也非常高，导致很难获取无菌苗，严重阻碍了滨梅组织培养的后继程序，大大限制了滨梅的大规模工厂化繁育。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法，以期望可以解决外植体感染外生菌和内生菌问题，为诱导愈伤组织等后继组织培养提供健康的无菌苗。
[0004]本发明通过如下技术方案实现:
[0005]一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法，按以下步骤进行:
[0006](I)配制培养基:以MS培养基为基础，其中蔗糖浓度为30g.L_\琼脂浓度为8.0g.L_\ pH5.8 ;培养基在121°C条件下灭菌20min后冷却备用；
[0007](2)采集枝条:在五月下旬选择日光充足的晴天采集生长健壮、无病虫害的一年生枝条，用湿报纸包裹后4°C保藏备用；
[0008](3)枝条消毒:取滨梅枝条修剪成长2cm带有2~3个腋芽的茎段，用自来水清洗后，接着用流水冲洗半小时，再用无菌滤纸吸干水分，然后转移至无菌操作台，在无菌条件下，先浸入体积浓度为75%的酒精消毒20~40s，然后用无菌水冲洗3~4次，无菌滤纸吸干水分，后转入质量浓度为0.1%的升汞消毒3~6min，再反复用无菌水冲洗并将茎段两头剪掉0.3~0.5cm，最后再转入质量浓度为3~5%。的制霉菌素溶液处理5~IOs ;
[0009](4)接种:把完成消毒的茎段接种到含蔗糖的MS固态培养基中，在25±2°C，空气相对湿度为65~75%，光照强度为220 μ EnT2s'光照时间为14h/d的条件下培养I个月即得无菌苗。
[0010]与传统滨梅无菌苗获取技术相比，采用本发明有效降低了滨梅茎段外生菌和内生菌染菌率，死亡率减少到10%以下，无菌苗获得率高于80%。本发明操作简单，可以快速获得大量无菌苗，对后继组织培养或其他生物技术研究具有重要意义。【具体实施方式】 [0011]实施例1
[0012]一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法，按以下步骤进行:
[0013](I)配制培养基:以MS培养基为基础，其中蔗糖浓度为30g.ΙΛ琼脂浓度为8.0g.L_\ ρΗ5.8 ;培养基在121°C条件下灭菌20min后冷却备用。
[0014](2)采集枝条:在五月下旬选择日照充足的晴天，于南京市傅家边农业观光园滨梅林中采集生长健壮、无病虫害的一年生枝条20根，采集长度约25~35cm，并立即把叶片剪去，再用湿报纸包裹后4°C保藏备用。
[0015](3)枝条消毒:取滨梅新生枝条部位，修剪成长2cm带有2~3个腋芽的茎段200个，用自来水清洗后，接着用流水冲洗半小时，再用无菌滤纸吸干水分，然后转移至无菌操作台。在无菌条件下，先浸入体积浓度75%酒精消毒20秒，然后用无菌水冲洗3~4次，无菌滤纸吸干水分，后转入质量浓度为0.1%的升汞消毒3分钟，再反复用无菌水冲洗8~10次，并将茎段两头各剪掉0.3cm，最后再转入质量浓度为5%。制霉菌素溶液处理5s。
[0016](4)接种:把完成消毒的茎段接种到含蔗糖的MS固态培养基中，在25±2°C，空气相对湿度为65~75%，光照强度为220 μ EnT2s'光照时间为14h/d的条件下培养I个月即得无菌苗。
[0017]实施结果表明，采用该方法可大幅降低茎段死亡率减少到9.2%，无菌苗获得率为81.3%，不定芽数长势较好。
[0018]实施例2
[0019]一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法，按以下步骤进行:
[0020](I)配制培养基:以MS培养基为基础，其中蔗糖浓度为30g.L_\琼脂浓度为
8.0g.L_\ pH5.8 ;培养基在121°C条件下灭菌20min后冷却备用；
[0021](2)采集枝条:在五月下旬选择日光充足的晴天采集生长健壮、无病虫害的一年生枝条，用湿报纸包裹后4°C保藏备用；
[0022](3)枝条消毒:取滨梅枝条修剪成长2cm带有2~3个腋芽的茎段，用自来水清洗后，接着用流水冲洗半小时，再用无菌滤纸吸干水分，然后转移至无菌操作台，在无菌条件下，先浸入体积浓度为75%的酒精消毒40s，然后用无菌水冲洗3~4次，无菌滤纸吸干水分，后转入质量浓度为0.1%的升汞消毒6min，再反复用无菌水冲洗并将茎段两头剪掉
0.3~0.5cm，最后再转入质量浓度为3%。的制霉菌素溶液处理IOs ；
[0023](4)接种:把完成消毒的茎段接种到含蔗糖的MS固态培养基中，在25±2°C，空气相对湿度为65~75%，光照强度为220 μ EnT2s'光照时间为14h/d的条件下培养I个月即得无菌苗。
[0024]实施结果表明，采用该方法可大幅降低茎段死亡率减少到8.9%，无菌苗获得率为83.1%，不定芽数长势较好。
[0025]以下结合对比试验对本发明作进一步说明。
[0026]试验I不同消毒时间对滨梅茎段染菌率及死亡率的影响
[0027]试验过程:首先配制MS培养基，其中蔗糖浓度为30g.L_\琼脂浓度为8.0g.L—1，PH5.8 ;培养基在121°C条件下灭菌20min后冷却备用。然后在五月下旬选择日照充足的晴天，于南京市傅家边农业观光园滨梅林中采集生长健壮、无病虫害的一年生枝条20根，采集长度约25~35cm，并立即把叶片剪去，再用湿报纸包裹后4°C保藏备用。取滨梅新生枝条部位，修剪成长2cm带有2~3个腋芽的茎段360个，用自来水清洗后，接着用流水冲洗半小时，再用无菌滤纸吸干水分，然后转移至无菌操作台。在无菌条件下，采用表1的方法对滨梅茎段进行75%酒精和0.1%的升汞消毒处理，再反复用无菌水冲洗8~10次，并将茎段两头各剪掉0.3cm，最后再转入质量浓度为4%。制霉菌素溶液处理8s。最后把完成消毒的茎段接种到含蔗糖的MS固态培养基中，在25±2°C，空气相对湿度为65~75%，光照强度为220 μ EnT2s'光照时间为14h/d的条件下培养。每处理重复60次，30d后统计茎段染菌率和死亡率。
【权利要求】
1.一种利用滨梅枝条获取无菌苗的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)配制培养基:以MS培养基为基础，其中蔗糖浓度为30g.Ι，琼脂浓度为8.0g -1,PH5.8 ;培养基在121°C条件下灭菌20min后冷却备用； (2)采集枝条:在五月下旬选择日光充足的晴天采集生长健壮、无病虫害的一年生枝条，用湿报纸包裹后4°C保藏备用； (3)枝条消毒:取滨梅枝条修剪成长2cm带有2~3个腋芽的茎段，用自来水清洗后，接着用流水冲洗半小时，再用无菌滤纸吸干水分，然后转移至无菌操作台，在无菌条件下，先浸入体积浓度为75%的酒精消毒20~40s，然后用无菌水冲洗3~4次，无菌滤纸吸干水分，后转入质量浓度为0.1%的升汞消毒3~6min，再反复用无菌水冲洗并将茎段两头剪掉.0.3~0.5cm,最后再转入质量浓度为3~5%。的制霉菌素溶液处理5~IOs ; (4)接种:把完成消毒的茎段接种到含蔗糖的MS固态培养基中，在25±2°C，空气相对湿度为65~75%，光照强度为220 μ EnT2s'光照时间为14h/d的条件下培养I个月即得无菌苗。
【文档编号】A01H4/00GK103461133SQ201310429510
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】张焕仕, 燕志, 钦佩, 潘少明 申请人:南京大学连云港高新技术研究院