一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法【专利摘要】本发明利用能在全身普遍启动表达的启动子驱动可变色光诱导荧光的表达，从而提供了一种能够全身表达可变色光诱导荧光观赏鱼的方法及其由此获得的可变色光诱导荧光观赏鱼，并进一步提供了一种针对体表色素较多的鱼种进行基因改造，将其转化为一种能够全身表达可变色光诱导荧光的观赏鱼的方法以及由此获得的产品，同时为了保证生物安全性，对该观赏鱼实现了绝育。本发明同时还提供了针对其他水生生物，如虾、水母构建全身发可变色光诱导荧光的观赏品种的方法。因此，本发明实现了通过人工改变激发波长，让鱼在数秒内从一个颜色变成另一个颜色，产生有趣的观赏效果，扩展传统的观赏鱼市场的格局。【专利说明】一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及生产荧光观赏鱼的方法，特别是涉及生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法。【
背景技术：
】[0002]观赏鱼是一个有全球市场的鱼类产业，而荧光鱼由于可以获得区别于传统鱼的引人注目的色彩、尤其在光线较暗的情况下有奇特的装饰效果，因此极大的改变了观赏鱼市场的格局。目前利用转基因技术可以在短时间内获得具有特定性状的鱼，而不需要通过传统的杂交技术来缓慢改变鱼的特性。利用转基因技术获得荧光观赏鱼已经取得了巨大的商业价值。[0003]现有技术中已存在多种将外源基因置入鱼中的技术，包括微注射、病毒介导的基因整合基因重组、基因敲除、以及转座子等技术。目前，已有一些利用转基因技术构建荧光观赏鱼的报道，如台湾邰港公司将荧光蛋白连接启动子转入鱼内基因组中，获得了多个观赏鱼种；新加坡国立大学将四种特异性的启动子连接单一荧光，在荧光鱼的特定部位表达突光基团。美国YorktownTechnology公司也通过特异性启动子驱动蓝色蛋白在鱼体内的表达。[0004]荧光观赏鱼的现有技术(例如CN1590548A、CN1647625A、US7135613、US8232450、US7700825等)均存在以下弊端。首先，现有的荧光观赏鱼构建技术中实现的均是荧光蛋白的组织特异性表达，即仅在鱼的特定组织出现荧光，由此构建的荧光鱼从视觉角度缺乏一定的观赏性。其次，实现的均是单色荧光的表达，不能在外界的刺激下改变颜色，由此获得的荧光观赏鱼缺乏一定的互动性或趣味性。此外，一些鱼体自身体表色素沉淀较多，导致鱼体表面透明度降低，这不但屏蔽了激发光对荧光基团的激发，导致荧光基团发光效率低，而且遮阻了荧光基团的发射光到达体外，从而进一步降低了观赏性。上述专利为了在一定程度上挽救这个缺点，不得不用很强的启动子来驱动荧光基团的表达，但代价却是荧光基团的光毒性造成鱼的健康受到影响，使得鱼的寿命大大缩短。[0005]此外，现有技术中所获得的荧光鱼均未实现绝育化，这样的转基因鱼种一旦进入自然环境，可能对自然界物种造成不可预知的潜在危害。【
发明内容】[0006]本发明的目的是要克服现有技术中的至少一个缺陷，提供一种生产荧光蛋白能够全身表达并且在光刺激下荧光颜色可变的观赏鱼的生产方法。在本发明中，将这种新的鱼种称为“可变色光诱导荧光观赏鱼”。[0007]进一步地，本发明还提供了生产可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体的方法，生产可变色光诱导荧光观赏鱼的绝育体的方法以及针对体表色素较多的鱼种进行基因改造使其适于用来生产可变色光诱导荧光观赏鱼或使得所生产的可变色光诱导荧光观赏鱼能够更佳地全身表达可变色光诱导荧光。[0008]本发明揭示的原理还可适用于其他水生生物(例如虾、水母等)，构建全身发可变色光诱导荧光的其他观赏性水生生物。[0009]本发明的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法，包括以下步骤:[0010]步骤A:构建可变色光诱导荧光蛋白的重组转座载体，其中所述可变色光诱导荧光蛋白选自PA-GFP、PA-RFP-1、PS-CFP2、Kaede,KiKGR,MonomericEos、Dendra-2,FP595、Dronpa、Padron及其衍生物，优选为Kaede；[0011]步骤B:将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；[0012]步骤C:筛选并鉴定出能够稳定表达可变色光诱导荧光蛋白的鱼种，以获得可变色光诱导荧光观赏鱼。[0013]进一步地，所述重组转座载体中的启动子为能在鱼全发育期以及全身稳定驱动表达的启动子，优选为Ubiquitin启动子。[0014]进一步地,所述重组转座载体为Ubiquitin启动子-Kaede-miniTol2载体,其序列结构如SEQIDNO:1所示。[0015]进一步地，在所述步骤C之后还包括如下获得所述可变色光诱导荧光鱼的纯合体F3的步骤:[0016]将所述步骤C中获得的所述可变色光诱导荧光观赏鱼与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F1，从所述杂合体Fl中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体Fl；[0017]选取单只全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体Fl与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F2，从所述杂合体F2中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；[0018]将筛选出的所述雌鱼和所述雄鱼进行交配，得到所述可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体F3从所述纯合体F3中筛选出含有可变色光诱导荧光蛋白的纯合可变色光诱导荧光观赏鱼。[0019]进一步地，本发明的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法还包括如下绝育步骤:[0020]通过温度物理绝育处理法、静水压物理绝育处理法、电休克物理绝育处理法、细胞松弛素B化学绝育处理法、秋水仙素化学绝育处理法、聚乙二醇化学绝育处理法、或6-二甲基氨基嘌呤化学绝育处理法对所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵进行处理，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体；[0021]将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的二倍体和所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体进行杂交，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的绝育的三倍体。[0022]进一步地，所述温度物理绝育处理法包括:将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵置于42°C的养鱼水中，热激10分钟。[0023]进一步地，本发明的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法还包括如下色素基因敲除步骤之一:[0024]在所述步骤A之前，通过基因敲除技术对所述待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者[0025]在获得所述可变色光诱导荧光观赏鱼之后，通过基因敲除技术对所述可变色光诱导荧光观赏鱼进行处理，敲除其中的鱼体色素基因。[0026]进一步地，所述待处理鱼种为斑马鱼，被敲除的所述鱼体色素基因是斑马鱼golden基因。[0027]进一步地，所述色素基因敲除步骤包括:[0028]在所述斑马鱼或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的golden基因组外显子区域中，寻找NGG的特征序列，其中紧邻NGG之前20bp序列即为候选的目标序列；[0029]将所述目标序列构建入pT7gRNA载体；[0030]将含有所述目标序列的pT7gRNA载体与Cas9mRNA共同注射入所述斑马鱼的单细胞期受精卵或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵中，并将其培养成幼鱼；[0031]根据所述幼鱼的鱼体颜色的深浅筛选出色素基因敲除成功的幼鱼作为之后繁殖的种鱼，以制备出敲除了鱼体色素基因的待处理鱼种或生产出敲除了鱼体色素基因的可变色光诱导荧光观赏鱼。[0032]本发明利用能在全身普遍表达的启动子驱动可变色光诱导荧光蛋白的表达，实现了通过人工改变激发波长，让鱼在数秒内从一个颜色变成另一个颜色的有趣的观赏效果；或者还可以让鱼体在某一种特定激发波长下，颜色还可以变回原来的颜色。这种加入了人为控制元素的荧光鱼能够更有效地装点所在的环境，增加人鱼互动，提高趣味性，极大地扩展了观赏鱼市场的格局。[0033]根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。【专利附图】【附图说明】[0034]后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例，附图中:[0035]图1是在根据本发明一个实施例的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法中构建的Ubiquitin启动子-Kaede-miniTol2载体的结构图。[0036]图2是根据本发明一个实施例生产的可变色光诱导荧光观赏鱼的嵌合体H)的PCR验证图，其中水平箭头所标示的条带在600bp左右，此为目的条带；竖直箭头所标示的是没有条带的组，这样的组是本发明所不期望的。[0037]图3A和图3B是根据本发明一个实施例生产的可变色光诱导荧光观赏鱼在激发光处理前后的荧光图，图中例示出的可变色光诱导荧光观赏鱼是同一条纯合子斑马鱼，其中图3A是没有发生光转换时，斑马鱼在450nm-550nm的激发光下的颜色，释放出绿色的发射光；图3B是用390nm左右的光照射斑马鱼Imin后，斑马鱼体内的Kaede蛋白发生构像变化,在550nm-600nm的激发光照射下,释放出橘黄色的发射光。[0038]图4是利用Realtime-PCR技术(实时荧光定量PCR技术)鉴定纯合子和杂合子的结果图。A组的两条线是杂合子和纯合子内参GAPDH的曲线，B组的三条线是实施例1步骤4中获得的纯合子Kaede的线，C组的三条线为实施例1步骤3中获得的杂合子Kaede曲线。A组的两条曲线起来的循环数都在10.5左右，说明内参GAPDH的表达量一致。B组比C组早起来一个循环左右，这说明B组Kaede的表达量高一倍。通过观察曲线起来数值的高低，可以判断纯合子B和杂合子C。[0039]图5A、图5B和图5C是通过流式细胞仪(FACS)检测鱼的红细胞相对DNA含量来鉴定和区分多倍体鱼的鉴定结果图，其中图5A是二倍体鱼的鉴定结果图，B图是三倍体鱼的鉴定结果图，C图是四倍体鱼的鉴定结果图。[0040]图6是golden基因敲除的分子生物学验证图。M表示标记(marker),Gl和G2分别是色素敲除的纯合子和杂合子鱼的部分组织提出的基因组DNA，经过基因型鉴定PCR，退火并T7E1酶处理后的产物。NC是野生型斑马鱼的鱼的部分组织提出的基因组DNA，经过基因型鉴定PCR，退火并T7E1酶处理后的产物。Gl-Gl表示Gl自己和自己退火，Gl-NC是纯合子和野生型退火。由于纯合子golden靶标区域被切割，所以Gl-NC退火后，可以形成错配，受到专门切割双链错配的酶T7E1切割，形成横向箭头所指部分的两条带。而纯合子本身不会形成错配，因此箭头所指区域没有带出现。G2-G2表示自己和自己退火，G2-NC是杂合子和野生型退火。由于杂合子本身既有被切割的golden靶标区域，也有未切割的靶标区域，所以可以形成错配，受到专门切割双链错配的酶T7E1切割，形成横向箭头所指部分的两条带。同理，G2-NC也出现切割的两条带。[0041]图7A和图7B是在本发明的实施例2中进行色素基因敲除步骤前后后的鱼体颜色的比较图，其中图7A示出的是正常的斑马鱼，图7B示出的是敲除了golden基因后的斑马鱼。图7B所示斑马鱼的体色明显变浅，体表相对而言较为透明。【具体实施方式】[0042]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将首先描述本发明中采用的主要技术，然后结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。[0043]一.可变色光诱导荧光蛋白的选择[0044]区别于普通的荧光蛋白(例如GFP，eGFP,RFP,DsRed等)，可变色光诱导荧光蛋白在特定激发波长的刺激下，可以更改自身的颜色。目前已有的可变色光诱导荧光蛋白分为以下三类:不可逆光激活突光蛋白(Irreversiblephotoactivatablefluorescentproteins),光变换突光蛋白(Photoshiftablefluorescentproteins)和可逆光激活突光蛋白(Reversiblephotoactivatablefluorescentproteins)。这三类光诱导变色蛋白的代表分别是PA-GFP、Kaede和Dronpa。[0045]在本发明的一些实施例中，主要采用Kaede可变色光诱导荧光蛋白来实现可变色光诱导突光观赏鱼的构建。Kaede是一种从脑珊瑚(Trachyphylliageoffroyi)中克隆出来的、能够在紫外线350-400nm的激发下快速从绿色变成橘黄色的荧光蛋白。Kaede所包含的His-Tyr-Gly三肽是变色的核心区域。在紫外线的照射下，绿色荧光蛋白会以一种渐变的方式变成橘黄色荧光蛋白，橘黄色/绿色荧光强度比率增强2000倍以上。被紫外激发为橘黄色的荧光蛋白可以在正常的细胞有氧状态下稳定存在。同时，实验表明这种蛋白可以自由分布在整个细胞质内，因此其最初是被用来标记细胞。[0046]此外，其他一些光诱导荧光蛋白，例如PA-GFP、Dronpa，也可作为可变色光诱导荧光蛋白应用于本发明的具体实施例中。[0047]二.质粒构建相关元件的选择[0048]本发明中实现转基因的技术包括病毒侵染法，Tol2技术和同源重组技术。上述转基因技术均可应用于本发明的具体实施例中。在本发明的实施例中，是将可变色光诱导荧光蛋白加入转座质粒，从而将特定的基因插入待处理鱼种例如斑马鱼的基因组中，实现稳定表达。[0049]此外，本发明所选取的启动子是可以在鱼种以及其他水生物品种的全发育时期、全身稳定普遍启动表达的启动子，由此来驱动可变色光诱导荧光蛋白在宿主中的表达，本发明所用的启动子被特别地优选为Ubiquitin启动子。将启动子和后续的可变色光诱导荧光蛋白编码基因连接在一起，整合入鱼及其他水生物基因组中。[0050]三.基因整合的方法及鉴定[0051]把不含内毒素的大提后的质粒，通过显微注射打入待处理鱼种的受精卵中，等待这些受精卵发育成幼鱼。鱼体透明，目的序列整合入基因组的鱼，会显示特定的变色荧光。将这些鱼收集并培育养大，得到可变色光诱导荧光观赏鱼(更具体地，此时得到的是可变色光诱导荧光观赏鱼的嵌合体H))。[0052]四.获得稳定表达的子代[0053]选择生殖细胞中表达荧光的嵌合体H)和野生型进行杂交，后代中如果仍然有可变色光诱导荧光的个体，属于杂合体Fl。将这些发荧光的杂合体Fl的单个个体和野生型再次进行杂交，它们的后代仍然有荧光的是杂合体F2。由于杂合体F2来源于同一个父母(杂合体Fl和野生型)，因此插入的荧光片段在基因组的位置是一样的。将杂合体F2内的雌鱼和雄鱼杂交，在杂交获得的后代中，有1/4概率得到可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体F3。纯合体由于带有两倍于杂合体的基因，因此荧光亮度高于后者，可以通过荧光强度的办法来区分开。为了进一步验证，在不伤害鱼的生存能力前提下，将候选的荧光鱼剪去部分组织，通过Realtime-PCR技术进行鉴定，可将纯合体与各代杂合体及嵌合体区分开。[0054]五.种鱼的多倍体化进行绝育[0055]对可变色光诱导荧光鱼纯合体的单细胞期受精卵进行42°C热激处理10分钟，诱导产生多倍体(其中包括三倍体和四倍体)的可变色光诱导荧光鱼纯合体。通过将二倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体和四倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体杂交产生三倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体，由于三倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体是不可育的。所以这种三倍体的可变色光诱导荧光鱼纯合体不会和野生鱼种进行生殖，不会对自然界造成影响。[0056]优选地，通过将生产出的可变色光诱导荧光鱼成鱼的尾巴减掉一些组织，从中提取相应基因，然后通过流式细胞仪(FACS)检测相对DNA含量，检测该基因的表达量，可以区分开二倍体、三倍体和四倍体。[0057]保存四倍体的纯合体种鱼，将四倍体的纯合体种鱼和普通的鱼杂交产生三倍体后代。由于三倍体无法和二倍体产生可育后代，由此获得的三倍体可变色光诱导荧光观赏鱼是不可育的，不会对自然界产生物种方面的危害。[0058]六.色素的清除[0059]一些鱼种体表色素沉淀比较多，如前所述，荧光效果大打折扣。因此，需要对这些鱼体进行改造。本发明采用基因敲除技术，优选Cas9系统，通过对特定序列的色素基因——如斑马鱼中的golden基因，nacre基因和roy基因-进行切割敲除，从而可以达到去除鱼体色素的目的。由于本技术很强的普遍适用性和应用价值，因此理论上，它可以广泛适用于任何一种体表有色素沉积不透明影响荧光效果的水生生物。[0060]具体地，在本发明中，可以在获得在可变色光诱导荧光观赏鱼之前，通过基因敲除技术对待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者也可以在获得所述可变色光诱导荧光观赏鱼之后，通过基因敲除技术对所述可变色光诱导荧光观赏鱼进行处理，敲除其中的鱼体色素基因。[0061]七.鱼种的选择[0062]本发明优选采用Tol2转座技术。根据目前的文献报道和实验证据，该转座技术可以广泛地适用于鱼、两栖类动物以及鸡等多种动物，甚至在哺乳动物例如老鼠的细胞中也具有很高的转座效率。因此，本发明可以广泛地应用在各个鱼种，甚至在一些低等动物中也有潜在的应用价值。[0063]本发明适用于几乎所有的鱼种，包括斑马鱼、鏘鱼、鲶鱼、慈稠、斗鱼、鲤科和加拉辛科等。慈稠包括非洲慈稠、南美慈稠、短稠、神仙鱼和七彩神仙鱼。斗鱼包括斗鱼和彩兔。It鱼包括鼠鱼、琵琶鱼或者翼甲It(Pterygoplichthys)。加拉辛科包括灯鱼和斧头鱼。鲤科包括锦鲤和金鱼。鏘鱼包括青鏘鱼、卵生鏘鱼或卵胎生鏘鱼。[0064]同时，本发明还可适用于其它水生生物，包括虾，水母，乌贼，鱿鱼等。虾包括青虾、河虾、草虾、小龙虾、对虾、明虾、基围虾、琵琶虾、龙虾等。水母包括、钵水母纲和立方水母纲的200多种生物，也包含广义的具水母型(钟形或碟形)的刺胞动物，如水螅水母、管水母(包括僧帽水母)，不属钵水母纲的栉水母和海樽等。[0065]实施例1可变色光诱导荧光观赏鱼的构建[0066]步骤1:构建Ubiquitin启动子-Kaede-miniTol2载体[0067](I)目的片段的扩增和获取[0068]PCR扩增目的片段:用以下引物PCR出目的片段Kaede(52°C，30个循环):[0069]Kaede-F-Spe1:GGACTAGTATGAGTCTGATTAAAC；[0070]Kaede-R-Eag1:ATCGGCCGTTACTTGACGTTGTCC。[0071]配方如表1所示。[0072]表1[0073]【权利要求】1.一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法，包括以下步骤:步骤A:构建可变色光诱导荧光蛋白的重组转座载体，其中所述可变色光诱导荧光蛋白选自PA-GFP、PA-RFP-UPS-CFP2、Kaede,KiKGR,MonomericEos、Dendra-2、FP595、Dronpa、Padron及其衍生物，优选为Kaede；步骤B:将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；步骤C:筛选并鉴定出能够稳定表达可变色光诱导荧光蛋白的鱼种，以获得可变色光诱导突光观赏鱼。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组转座载体中的启动子为能在鱼全发育期以及全身稳定驱动表达的启动子，优选为Ubiquitin启动子。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组转座载体为Ubiquitin启动子-KaedeniniTol2载体，其序列结构如SEQIDNO:1所示。4.根据权利要求1所述的方法，在所述步骤C之后还包括如下获得所述可变色光诱导荧光鱼的纯合体F3的步骤:将所述步骤C中获得的所述可变色光诱导荧光观赏鱼与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F1，从所述杂合体Fl中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体Fl；选取单只全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体Fl与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F2，从所述杂合体F2中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；将筛选出的所述雌鱼和所述雄鱼进行交配，得到所述可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体F3从所述纯合体F3中筛选出含有可变色光诱导荧光蛋白的纯合可变色光诱导荧光观赏鱼。5.根据权利要求4所述的方法，还包括如下绝育步骤:通过温度物理绝育处理法、静水压物理绝育处理法、电休克物理绝育处理法、细胞松弛素B化学绝育处理法、秋水仙素化学绝育处理法、聚乙二醇化学绝育处理法、或6-二甲基氨基嘌呤化学绝育处理法对所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵进行处理，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体；将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的二倍体和所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体进行杂交，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的绝育的三倍体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述温度物理绝育处理法包括:将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵置于42°C的养鱼水中，热激10分钟。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括如下色素基因敲除步骤之一:在所述步骤A之前，通过基因敲除技术对所述待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者在获得所述可变色光诱导荧光观赏鱼之后，通过基因敲除技术对所述可变色光诱导荧光观赏鱼进行处理，敲除其中的鱼体色素基因。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述待处理鱼种为斑马鱼，被敲除的所述鱼体色素基因是斑马鱼golden基因。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述色素基因敲除步骤包括:在所述斑马鱼或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的golden基因组外显子区域中，寻找NGG的特征序列，其中紧邻NGG之前20bp序列即为候选的目标序列；将所述目标序列构建入pT7gRNA载体；将含有所述目标序列的pT7gRNA载体与Cas9mRNA共同注射入所述斑马鱼的单细胞期受精卵或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵中，并将其培养成幼鱼；根据所述幼鱼的鱼体颜色的深浅筛选出色素基因敲除成功的幼鱼作为之后繁殖的种鱼，以制备出敲除了鱼体色素基因的待处理鱼种或生产出敲除了鱼体色素基因的可变色光诱导荧光观赏鱼。【文档编号】A01K67/027GK103540611SQ201310446742【公开日】2014年1月29日申请日期:2013年9月26日优先权日:2013年9月26日【发明者】马明,李冰峰,唐力,史文天申请人:马明,李冰峰