大鼠脊髓全横断损伤模型及其建立方法

大鼠脊髓全横断损伤模型及其建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种大鼠脊髓全横断损伤模型及其建立方法，包括：（1）注射麻醉剂，固定大鼠四肢；（2）备皮，纵行切开背部皮肤，钝性分离背部皮下组织，暴露相应节段脊柱；（3）行椎板切除术充分暴露脊髓，挑起脊髓，完全横行截断；（4）逐层缝合创口、创面消毒、包扎并立刻后腿肌注青霉素；（5）术后护理。与现有大鼠脊髓损伤造模方法相比，本发明所述造模方法从损伤节段的选择、手术操作方法、所使用器械的选择以及术后护理都有突破和改进，通过此方法得到的模型具有可靠性高、重复性好、损伤标准一致的特点，对研究脊髓损伤的病理机制以及探讨新的治疗方案尤为重要。
【专利说明】大鼠脊髓全横断损伤模型及其建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医疗动物的模型【技术领域】，尤其是一种大鼠脊髓全横断损伤模型及其建立方法。
【背景技术】
[0002]脊髓损伤(spinal cord injury)是指由于外界直接或间接因素导致脊髓损伤,在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍、肌张力异常及病理反射等的相应改变，是目前公认的世界性疑难病之一。脊髓损伤成为亟待解决的问题，呈现高发生率、高致残率、高耗费及低死亡率的特点，严重影响人们的生活质量。到目前为止，治疗并促进脊髓损伤康复的方法主要是靠药物治疗和外科手术治疗。由于脊髓损伤疾病的病理复杂，这些方法在不同程度上缓解了脊髓损伤的病理改变，但均未取得令人满意的临床疗效。
[0003]脊髓损伤后常为两种损伤机制，一种是原发性脊髓损伤，临床表现为急性瘫痪，为急性脊髓损伤后，脊髓发生一系列的病理变化，包括出血、水肿、轴突及神经元的坏死和脱髓鞘，以及梗塞和囊肿的形成；另一种为继发性损伤，为损伤后发生一系列损伤激活的自身破坏过程，如水肿的扩展，能量代谢的改变，儿茶酚胺和兴奋性氨基酸的释放，花生四烯酸、自由基等的产生使神经损伤程度逐渐加重。但实际两种病变过程相互重叠，难以划分明确的界限。
[0004]由于脊髓损伤的病理生理机制非常复杂，目前对该机制的认识还不够深入和透彻，为了探索关于脊髓损伤的新的、有效的治疗方式，如干细胞的移植治疗，必须进一步研究脊髓损伤所涉及的病理机制及治疗方案的修复机制，进而评估治疗方案的有效性。这就需要建立一个有效的、可靠性和重复性好的以及损伤标准一致并易于操作推广的动物模型。
[0005]Allen(1911年)采用重物坠落撞击脊髓背侧，开创脊髓损伤的标准化实验。但Alien法尚存在一些问题，如挫伤脊髓的瞬间脊髓的侧向偏移，导致脊髓损伤不对称，损伤区大小不恒定。动物的瘫痪程度和持续时间出现较大的差异，从而导致损伤程度难以保持—致。
[0006]脊髓缺血再灌注损伤模型多通过阻断腹主动脉或经腹膜后左肾动脉下腹主动脉阻断造成，这种模型存在的不足之处是同时导致了腹腔及下肢等组织的广泛性缺血损伤，这无疑影响了脊髓损伤及治疗后的行为及功能的评估。
[0007]钳夹压迫性脊髓损伤模型主要是通过动脉钳夹压等压迫力造成急性或慢性压迫损伤，例如以动脉瘤夹夹持脊髓，以夹持时间长短和夹持力轻重来制造损伤程度不同的脊髓损伤模型。这种模型的缺点是钳夹夹持的部位及夹持力大小难以保持一致，从而难以控制和评估。
[0008]综上所述，建立一种条件可靠性高和重复性好的脊髓损伤模型对于研究脊髓损伤所涉及的病理机制及治疗后的修复机制以及对行为功能学的评估有着重要的意义。
【发明内容】

[0009]针对以上不足，本发明的目的是提供一种大鼠脊髓全横断损伤模型及其建立方法。
[0010]一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法，包括以下步骤:
(1)注射麻醉剂，固定大鼠四肢；
(2)备皮，纵行切开背部皮肤，钝性分离背部皮下组织，暴露相应节段脊柱；
(3)行椎板切除术充分暴露脊髓，挑起脊髓，完全横行截断；
(4)逐层缝合创口、创面消毒、包扎并立刻后腿肌注青霉素；
(5)术后护理。[0011]其中，上述术后护理包括以下步骤:
a.加强营养供给，每天更换垫料；
b.为帮助排尿及恢复排尿反射，每天按摩耻骨联合区直至大鼠自行排尿；
c.每天清洗大鼠腹部残尿，吹干后消毒。
[0012]—种优选的大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法，包括:
(1)腹腔注射水合氯醛麻醉，固定大鼠四肢于板上，水合氯醛质量百分比浓度优选为10%，剂量优选为0.3 ml/100g大鼠体重，大鼠体重优选为250_300g ；
(2)将胸椎对应部位备皮，纵行切开背部皮肤，钝性分离背部皮下组织，暴露相应节段脊柱；
(3)行椎板切除术充分暴露脊髓，挑起脊髓，完全横行截断；
(4)逐层缝合创口、创面以聚维酮碘溶液擦净消毒、辅以敷料包扎伤口并立刻后腿肌注青霉素，聚维酮碘溶液优选为质量体积百分比为2.5%的聚维酮碘溶液，敷料优选为医用脱脂纱布；
(5)术后护理；
其中，术后护理步骤包括:
a.加强营养供给，每天更换垫料，垫料一般为天然木屑；
b.每天按摩耻骨联合区直至大鼠自行排尿；
c.每天用肥皂水清洗大鼠腹部残尿，吹干后用聚维酮碘溶液擦拭消毒，肥皂水质量体积百分比浓度优选为0.8-2%，聚维酮碘溶液质量体积百分比浓度优选为2.5%。
[0013]上述步骤(3)的椎板切除术是利用乳突牵开器将皮下组织牵开，再用乳突咬骨钳咬除相应节段椎板，充分暴露相应节段脊髓同时保证硬脊膜的完整，优选的，上述乳突牵开器的长度为14cm、固定式3X4钩、钝把；上述乳突咬骨钳的长度为9cm、枪形、头宽3mm ;如果椎板切除术中出现小量出血，优选使用沾有冰冻生理盐水或1:10000肾上腺素稀释液的无菌棉签或医用脱脂纱布压迫止血；上述步骤(3)中椎板切除术后使用探针挑起脊髓，锐利手术刀片在指定节段完全横行截断脊髓。
[0014]由于T5-T6节段棘突有大血管进入脊髓，故损伤T4-T7节段容易引起大出血且不易止血，导致大鼠术中死亡，故步骤(2)和步骤(3)中暴露的相应节段脊柱优选为T8-T11节段，更优选的选取T8-T11节段中的三段，尽量不影响大鼠摄食等日常活动，造模更易成功。步骤(3)中的指定节段优选为相应节段的中点位置，优选为T8-T11节段，进一步优选为T9-T10节段。[0015]其中，术后护理的步骤a的加强营养供给是指在大鼠的饲料中加入牛奶、鸡蛋、花生中的一种或多种，由于大鼠行脊髓全横断手术后下肢瘫痪导致行动受限，因此，优选将食物和饮水放置在大鼠可及的范围内。由于大鼠行脊髓全横断手术后，导致尿液滁留于膀胱内，因此步骤b优选还包括进行挤压膀胱被动排尿，膀胱位于耻骨联合区上方，两者按摩并行相辅，具体为:手指按住膀胱底，自上而下轻度挤压，持续至大鼠排尿反射恢复可自行排尿为止。
[0016]由于大鼠行脊髓全横断手术后，自横断平面以下完全瘫痪，后肢易水肿，导致擦伤及感染，因此，本建模方法还包括d:，将鼠尾两侧各贴一条医用胶布，悬吊于鼠笼顶部，长度以大鼠后肢不受压为度，每日解下悬吊3次，每次2小时以便大鼠休息。优选的，在将鼠尾两侧各贴一条医用胶布之前用温肥皂水清洁鼠尾后晾干或用吸水纸巾擦干，温肥皂水优选为 30-37 °C。
[0017]以上方法建立的大鼠脊髓全横断损伤模型可应用于研究脊髓损伤所涉及的病理机制及治疗后的修复机制和对行为功能学的评估。
[0018]本发明的损伤模型建立方法，双后肢瘫痪率约为100%，感觉、运动、括约肌功能全部丧失，成功率约为100%，而重力打击法，钳压迫法以及脊髓半横断法等，虽能较好的模拟临床脊髓损伤发生的优点，但是由于本身设计缺陷，导致手术中无法排除人为因素导致的误差，为模型建立后的评估带来重重困难，从而无法得到可靠的实验结果，同时实验重复性无法得到保障。
[0019]与现有大鼠脊髓损伤造模方法相比，本发明所述的大鼠脊髓全横断损伤模型的造模方法从损伤节段的选择、手术操作方法、所使用的器械的选择以及术后护理都有所突破和改进，通过此方法得到的大鼠模型具有可靠性高、重复性好、损伤标准一致的特点，对研究脊髓损伤的病理机制以及探讨新的治疗方案尤为重要。与传统方法相比，其有益效果在于:
1、解决了重物坠落撞击脊髓易发生偏移，髓损伤不对称，损伤区大小不恒定，瘫痪程度和持续时间出现较大的差异，损伤程度难以保持一致的问题；
2、解决了脊髓缺血再关注损伤模型导致的腹腔及下肢等组织的广泛性缺血损伤而影响脊髓损伤及治疗后的行为及功能评估的问题；
3、解决了钳夹压迫性脊髓损伤模型中夹持时间长短和夹持力轻重难以保持一致的问
题；
4、统一了实验模型损伤的标准，具有可靠性高、重复性好、损伤标准一致的特点；
5、术后完善的护理方案极大地降低了大鼠脊髓损伤后由于尿滁留、营养不良、感染等造成的动物模型死亡比率。
[0020]因此，通过本方法能得到一个标准的、有效的、重复性好、可靠性高的大鼠脊髓损伤模型。
【专利附图】

【附图说明】
[0021]本发明将通过 例子并参照附图的方式说明，其中:
图1是实施例3中实验组的脊髓冰冻切片HE染色结果。
[0022]图2是实施例3中对照组的脊髓冰冻切片HE染色结果。[0023]图3是实施例3中实验组的脊髓冰冻切片免疫组化染色结果。
[0024]图4是实施例3中对照组的脊髓冰冻切片免疫组化染色结果。
【具体实施方式】
[0025]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0026]本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
[0027]实施例1大鼠脊髓全横断损伤模型的建模
SD大鼠(Sprague Dawley Rat),雌雄均可,体重250_300g,随机分成实验组和对照组，将实验组大鼠按体积质量比0.3 ml/ 100 g大鼠体重进行腹腔注射质量百分比10%的水合氯醛进行麻醉，固定大鼠四肢于两侧有4个钉子的方木板上，将对应胸椎7-12节段备皮后以质量体积百分比2.5%聚维酮碘消毒，纵行切开背部皮肤，切口长度约为4厘米，钝性分离背部皮下组织，用乳突牵开器(14cm，固定式3 X 4钩，钝把)将皮下组织牵开，以乳突咬骨钳(9cm，枪形，头宽3mm行椎板切除术充分暴露T9-T11节段脊髓，确保硬脊膜完整的情况下用探针挑起脊髓，用锐利刀片在TlO处彻底横行截断脊髓，然后逐层缝合创口，并以医用脱脂纱布为敷料以防止感染及促进伤口愈合。对照组为假手术组，行椎板切除术前操作与实验组相同，但不进行脊髓横断术。
[0028]之后，在大鼠的饲料中加入牛奶、鸡蛋，将食物和饮水放置在大鼠可及的范围内，每天更换垫料；每天按摩耻骨联合区直至大鼠可自行排尿，每天先用肥皂水清洗大鼠腹部残尿，用电吹风机吹干后用聚维酮碘擦拭；将鼠尾两侧各粘贴一条医用胶布，悬挂于鼠笼顶部，长度以大鼠后肢不受压为度，每日解下悬吊3次，每次2小时以便大鼠休息即完成实验组的建模过程，对照组大鼠用于后续测试的对照。
[0029]实施例2实施例1的大鼠脊髓全横断损伤模型的运动功能测试 1、方法
1.1观察实施例1的模型动物的情况
1.2对实施例1的模型动物进行BBB评分
评估大鼠后肢运动功能的恢复情况，将动物放置于平台上，观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分为三部分，第一部分为0-7分，评判动物后肢各关节活动，第二部分为8-13分，评判后肢的步态及协调功能，第三部分为14-21分，评判运动中爪的精细动作，三项满分为21分。具体为:
O分:无可见后肢运动；
1分:一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节；
2分:一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动；
3分:两个关节广泛活动；
4分:后肢全部三个关节可轻微活动；
5分:两个关节轻微活动,第三个关节可广泛活动；
6分:两个关节广泛活动,第三个关节可轻微活动；7分:后肢全部三个关节可广泛活动；
8分:非承重情况下可以爪掌面着地；
9分:间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动；
10分:偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作；
11分:可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作；
12分:可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作；
13分:常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作；
14分:有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动；
15分:持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或偶有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行；
16分:步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转；
17分:步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行；
18分:步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转；
19分:步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂；
20分:持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起；
21分:持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。
[0030]1.3对实施例1的模型动物进行斜板试验
总体评估四肢肌力，斜板表面垫以6mm厚的橡胶垫，按大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直的方向放置大鼠，逐渐增加斜板与水平面间的角度，直至大鼠刚好可在板上停留5秒，记录这一角度。每只大鼠测3次，取平均值，所有行为学评估均在单盲情况下进行。
[0031]2、结果
2.1模型动物一般情况观察
实施例1的实验组大鼠实施脊髓全横断手术麻醉苏醒后，双前肢可进行爬行活动，但双后肢完全不能自主活动，肌力感觉消失。实验组大鼠术后活动减少，饮食减少。术后护理始于大鼠苏醒后第2天。第2天部分大鼠出现少量血尿伴有尿滁留现象，第3-7天大部分大鼠出现严重血尿和尿滁留且出现部分大鼠出现后肢水肿情况，第7-14天部分大鼠血尿和尿滁留现象逐渐消失，但后肢水肿无明显改善，采用鼠尾悬吊法后，后肢水肿逐渐改善。第4周尿滁留情况基本消失，排尿基本正常，尿色转为正常，后肢水肿有所改善。实验组部分大鼠还出现后肢脚趾脱落情况，后肢肌肉萎缩，大便困难伴硬结等情况。实施例1的对照组大鼠功能正常，后肢肌力正常，大小便正常。
[0032]2.2运动功能测定结果:
实验组大鼠在术后4周内虽有一定的代偿性恢复，但BBB评分显示均在2分以下；对照组大鼠BBB评分为20-21分，对照组与未损伤大鼠无异。实验组大鼠斜板实验肌力测试鼠刚好可在板上停留5秒角度为20-22°，而对照组大鼠为30-34°，对照组与未损伤大鼠差异不显著。
[0033]3、结论:
模型动物实施脊髓全横断手术后，从行为学上分析，其功能丧失差异具有统计学意义，且在同组各个体之间差异无统计学意义，即可得到稳定的急性脊髓损伤模型。经特殊护理存活的模型动物则是所需的脊髓全横断损伤模型。
[0034]实施例3实施例1的大鼠脊髓全横断损伤模型的脊髓组织学变化
1、脊髓标本的制备
实施例1的实验组和对照组，每组各取大鼠5只，分别于手术后I周，以质量百分比10%水合氯醛腹腔麻醉后，仰卧固定，剪开胸腔，暴露心脏，自左心室通过静脉导管快速灌注生理盐水，待右心耳流出液体基本无色，用质量百分比4%的多聚甲醛灌注固定。30分钟后分离脊髓组织，取出损伤和相邻约I厘米的节段。4°C质量百分比4%的多聚甲醛固定24小时，移入质量百分比30%的蔗糖溶液中待其沉入底部，然后行冰冻切片，HE染色(苏木精-伊红染色法hematoxylin-eosin staining )厚度为8微米,免疫组织化学为14微米。
[0035]2、脊髓冰冻切片HE染色结果
实验组大鼠可见脊髓完全横断且有瘢痕形成。4周后，取实验组和对照组大鼠脊髓行HE染色，实验组HE染色显示整个损伤去接穗断端灰白质界限不清，排列紊乱，灰质中胶质细胞增多，脊髓大部分坏死，被纤维组织替代，神经元数量明显减少、固缩形成空洞，如图1所示。而对照组大鼠横切HE染色显示脊髓结构完整，灰白质界限清晰，如图2所示。
[0036]3、脊髓冰冻切片免疫组化染色结果
因白介素-1和免疫应答及炎症反应息息相关，是T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤细胞的激活因子。因此我们测定了实验组大鼠急性期(术后1-7天)脊髓炎症反应情况。取术后I周实验组大鼠14微米冰冻切片行IL-1 β免疫组化染色。与未损伤大鼠脊髓切片相比，实验组免疫组化染色显示IL-1 β表达为阳性，且在灰质区集中，如图3所示，对照组IL-1 β表达为阴性或为弱阳性，如图4所示。
[0037]4、结论:
模型动物实施脊髓全横断手术后，从组织学上分析，实验组相对于假手术对照组而言，发生了严重的病理变化，如灰白质界限不清，排列紊乱；神经元固缩，胶质细胞及纤维组织增生明显；并发生了严重的炎症反应，而仅咬除椎板的假手术对照组未出现类似病理变化，说明实验组术后得到的模型动物即为所需的脊髓全横断模型。
[0038]实施例4关于脊髓损伤模型建立的死亡率的对比
申请人:比较了几种常见大鼠脊髓损伤模型的建立方法，包括:重力打击法、钳压迫法、脊髓半横断法、不进行术后护理的本发明的全横断模型建立方法、以及本发明的全横断模型建立方法。统计结果如表1所示:
表1:各建模方法的死亡率结果
【权利要求】
1.一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)注射麻醉剂，固定大鼠四肢； (2)备皮，纵行切开背部皮肤，钝性分离背部皮下组织，暴露相应节段脊柱； (3)行椎板切除术充分暴露脊髓，挑起脊髓，完全横行截断； (4)逐层缝合创口、创面消毒、包扎并立刻后腿肌注青霉素； (5)术后护理。
2.如权利要求1所述的一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(5)的术后护理包括以下步骤: a.加强营养供给，每天更换垫料； b.每天按摩耻骨联合区直至大鼠自行排尿； c.每天清洗大鼠腹部残尿，吹干后消毒。
3.如权利要求2所述的一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)腹腔注射水合氯醛麻醉，固定大鼠四肢于板上，水合氯醛质量百分比浓度优选为10%，剂量优选为0.3 ml/ 100 g大鼠体重，大鼠体重优选为250_300g ； (2)将胸椎对应部位备皮，纵行切开 背部皮肤，钝性分离背部皮下组织，暴露相应节段脊柱； (3)行椎板切除术充分暴露脊髓，挑起脊髓，完全横行截断； (4)逐层缝合创口、创面以聚维酮碘溶液擦净消毒、辅以敷料包扎伤口并立刻后腿肌注青霉素，聚维酮碘溶液优选为质量体积百分比为2.5%的聚维酮碘溶液，敷料优选为医用脱脂纱布； (5)术后护理； 所述步骤(5)的术后护理步骤包括: a.加强营养供给，每天更换垫料； b.每天按摩耻骨联合区直至大鼠自行排尿； c.每天用肥皂水清洗大鼠腹部残尿，吹干后用聚维酮碘溶液擦拭消毒，聚维酮碘溶液优选为质量体积百分比为2.5%的聚维酮碘溶液。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)的椎板切除术是利用乳突牵开器将皮下组织牵开，再用乳突咬骨钳咬除相应节段椎板，充分暴露相应节段脊髓同时保证硬脊膜的完整，优选的，所述乳突牵开器的长度为14cm、固定式3X4钩、钝把；所述乳突咬骨钳的长度为9cm、枪形、头宽3mm。
5.如权利要求4中任一权利要求所述的一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法,其特征在于，所述步骤(3)中使用探针挑起脊髓，锐利手术刀片在指定节段完全横行截断脊髓。
6.如权利要求5中任一权利要求所述的一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法,其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)的相应节段脊柱为T8-T11节段，所述步骤(3)的指定节段为T8-T11节段，优选为相应节段的中点位置。
7.如权利要求1-3中任一权利要求所述的一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法，其特征在于，当椎板切除术中出现小量出血时，使用沾有冰冻生理盐水或1:10000肾上腺素稀释液的无菌棉签或纱布压迫止血。
8.如权利要求2-3中任一权利要求所述的一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法，其特征在于，所述步骤a的加强营养供给是指在大鼠的饲料中加入牛奶、鸡蛋、花生中的一种或多种，将食物和饮水放置在大鼠可及的范围内；所述步骤b进一步包括手指按住膀胱底，自上而下轻度挤压，持续至大鼠排尿反射恢复可自行排尿为止。
9.如权利要求2-3中任一权利要求所述的一种大鼠脊髓全横断损伤模型的建立方法，其特征在于，还包括d:将鼠尾两侧各贴一条医用胶布，悬吊于鼠笼顶部，长度以大鼠后肢不受压为度，每日解下悬吊3次，每次2小时以便大鼠休息，优选的，在将鼠尾两侧各贴一条医用胶布之前用温肥皂水清洁鼠尾后晾干或用吸水纸巾擦干。
10.一种大鼠脊髓全横断损伤模型，其特征在于，所述大鼠脊髓全横断损伤模型是通过权利要求1-9中任一权利要`求所述的方法建立而得。
【文档编号】A61D1/00GK103505301SQ201310471323
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】田卫东, 郭维华, 杨超, 李星翰, 孙亮 申请人:四川大学