一种桦褐孔菌人工栽培方法
【专利摘要】本发明公开了一种桦褐孔菌人工栽培方法，1)桦褐孔菌菌株的分离、纯化；2)选用无碳基础培养基、无氮基础培养基，以麦芽糖为碳源的培养基，以蔗糖为碳源的培养基，黄豆粉为氮源，碳氮比20：1，pH为7，温度为30℃；3)桦褐孔菌人工驯化栽培。本发明可形成桦褐孔菌子实体。
【专利说明】一种枠褐孔菌人工栽培方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种桦褐孔菌人工栽培方法。
【背景技术】
[0002]桦褐孔菌具有很高的药用价值。(1)抗肿瘤、抗癌作用:桦褐孔菌的提取物对肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌等均有治疗效果，其多糖与氨基酸对机体免疫系统可以起到保护与促进的作用，提高人体的免疫力，维持人体正常细胞的生命活力与新陈代谢。(2)防治糖尿病:其多糖类产物葡聚糖、杂多糖和蛋白复合物)可以增强胰岛细胞的功能、平衡人体内的糖代谢过程，从而降低血糖，并可以维持3~48小时。(3)防治艾滋病、抗病毒作用:提取物组分中β，3-D-葡聚糖对SARS类传染性病毒有明显的抑制作用，而水溶性成分中的高相对分子质量的木质素衍生物可以阻抗HIV-1蛋白酶的活性进而用于治疗艾滋病。(4)抗氧化抗衰老:桦褐孔菌中的儿茶酚具有强抗氧化作用，并对基因有保护作用。(5)其他作用:芬兰、加拿大等欧美国家应用桦褐孔菌醇高标准提取物具备增强肌体免疫的功效来治疗流行性感冒。桦褐孔菌是血液的清洁剂，对食物中毒、胃肠功能紊乱、肝炎、肾炎、高血压有明显的治疗作用，还能增加食欲、缓解疼痛和改善过敏性体质，市场上一直都有桦褐孔菌特制的茶和药用酒，还把它制成气雾剂用于治疗各种疾病。
[0003]随着对大型药食同源真菌中活性物质研究的深入，桦褐孔菌的药用价值、营养价值和经济价值已经引起人民的广泛关注，成为各个行业的热门开发领域。多学科综合开发应在基础理论、临床应用、开发产品等不同领域同时进行研究。桦褐孔菌多糖、三萜、多酚类天然抗癌药物物质可以作为保健药品、健康食品、保健饮料、微胶囊的主要原料，其天然色素可在食品添加剂、茶叶的深加工、化妆品行业中应用，另外，桦褐孔菌在烟草行业、纺织行业、饲料行业等边缘学科的研究及产品开发也将具有十分广阔的应用前景。
[0004]野生桦褐孔菌价格极为昂贵缘于桦树林中此木腐菌的比例大约只有万分之一，由于大量的采集，使野生桦褐孔菌资源日趋枯竭，因此桦褐孔菌的栽培技术成为重要的研究领域。
[0005]目前，由于人们对桦褐孔菌的子实体的生长发育机制认识不足，人工创造的条件与微生物在大自然中的环境差别很大，因此造成了人工驯化和栽培的一定困难，关于桦褐孔菌菌核的人工驯化已经具有一定的成果与规模。但迄今为止，尚无形成子实体的先例，桦褐孔菌栽培技术还存在一些急需要攻克的难题，现有技术只能促进菌核的产生，而不形成子实体。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种桦褐孔菌人工栽培方法，优化了栽培配方，根据野生桦褐孔菌的生物性特特性，利用变温处理，成功促进子实体的形成。其具体技术方案为:
[0007]一种桦褐孔菌人工栽培方法，包括如下步骤:[0008]1)桦褐孔菌菌株的分离、纯化:先用1: 14的次氯酸钙上清液对子实体进行表面消毒，再用高温灭菌的镊子取中间5mm左右小方块组织，将其移接于PDA培养基平板的中央，切取组织时，接种Id后置于25°C恒温暗室中培养，随时检查菌株生长情况，及时排除被污染的平板，待菌丝长满平板后，再转入PDA斜面试管培养基上保存纯种，长满后然后置于4°C的冰箱中保存备用；
[0009]2)选用无碳基础培养基、无氮基础培养基，以麦芽糖为碳源的培养基，以鹿糖为碳源的培养基，黄豆粉为氮源，碳氮比20: 1，ρΗ为7，温度为30°C ;
[0010]3)桦褐孔菌人工驯化栽培:PDA培养基上，所述培养基为桦树木屑78%、黄豆粉20%、石膏1%、蔗糖I %及65 %水，在35°C条件下培养15d，将其放在室温条件下培养20d，培养基上中心偏右部位长出了桦褐孔菌子实体。同栽培培养料配方中，在35°C温箱下培养30天，室温下不开口放置20-50d，在培养袋口及基部同样产生了子实体。
[0011]进一步优选，所述桦褐孔菌菌株的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明可形成桦褐孔菌子实体，规模化生产后，将产生明显的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是不同氮源对桦褐孔菌生长情况，图1a为黄豆粉、图1b为酵母粉、图1c为蛋白胨、图1d为甘氨酸、图1e为硫酸铵、图1f为无氮对桦褐孔菌生长的影响；
[0014]图2是不同碳氮比对桦褐孔菌生长情况，图2a为碳氮比5: 1、图2b为10: 1、图2c为20: 1、图2d为30: 1、图2e为40: 1、图2f为50: I对桦褐孔菌生长的影响；
[0015]图3是不同酸碱度对桦褐孔菌生长情况；图3a_图3f依次为pH3、8、5、6、7及4对桦褐孔菌生长的影响；
[0016]图4是人工培养基上产生的子实体。图4a-图4c依次为子实体形成情况、子实体形成情况、菌丝生长情况。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0018]试验材料于2011年与2012年5月采自于黑龙江省大兴安岭呼中自然保护区野生桦褐孔菌子实体呈黑褐色不规则瘤状，表面坚硬，质地硬脆，子实体外部较干，用斧子砍开切面处手感湿润。菌肉木栓质，有模糊不清的环纹，淡黄褐色。PDA固体平板中培养7天的菌落上的菌丝浓厚、整齐，从中心向四周生长；菌落中心颜色呈黄褐色，从中心至边缘黄色逐渐变淡，外围纯白色；平板背面菌落有明显的浅褐色环纹。如图3f所示；经分离纯化的菌种转至PDA斜面上,培养5天满管,菌落初期纯白色,后逐渐变为浅黄色,逐渐变黄褐色。菌种接到PDA液体培养基，在柜式恒温摇床中转速120rpm，28°C下培养7天，菌球边缘呈尖刺状；摇瓶壁上的菌丝带变粗，部分被摇落到液体中；摇瓶中液体颜色由淡黄逐渐变为深褐色，脱落的菌丝结合为圆形或卵形菌丝球。挑取平板的营养菌丝体压片后在光学显微镜下观察，菌丝呈半弧形，透明，丝状。营养菌丝多分枝，可见菌丝横隔，无锁状联合。野生菌株的ITS-rDNA经测序获得的目的片段长度为761bp，包含18S rDNA部分序列，306bp ITSl序列全长，160bp5.8S rDNA全长，243bp ITS2全长，以及部分28S rDNA序列。在GeneBank上经BLAST比对,与Inonotus obliquus的ITS-rDNA序列有99%的相似性，结合形态观察，确定所采的野生菌种为桦褐孔菌。序列已提交NCBI上的EST库，其在GenBank上的登陆号为:KC312697(G1:461725870)。
[0019]通过BLAST软件的分析，对桦褐孔菌菌株测得的序列和GenBank中下载的ITS-rDNA序列进行聚类分析，本发明采集的菌种(targeted sequence)与Inonotusobliquus isolate FS656163 以及 Inonotus obliquus strain MDJCBS88 同源性最近，这两个为样褐孔菌不同菌株，而与 Inonotus linteus strainPL08121 和 Inonotus rickiiisolate PF241亲缘性最远，都属于纤孔菌属。)桦褐孔菌采样地点为白桦天然成、过熟林内，在东北林业大学森林病理实验室分离获得。菌种分离采用常规组织分离技术，先用I: 14的次氯酸钙上清液对子实体进行表面消毒。再用高温灭菌的镊子取中间5_左右小方块组织，将其移接于PDA培养基平板的中央。切取组织时，接种Id后置于25°C恒温暗室中培养，随时检查菌株生长情况，及时排除被污染的平板。待菌丝长满平板后，再转入PDA斜面试管培养基上保存纯种，长满后然后置于4°C的冰箱中保存备用。
[0020]无碳基础培养基:甘氨酸lg，KH2PO40.5g，硫酸镁0.25g，琼脂10g，水500ml。
[0021]无氮基础培养基:葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂10g，水500ml。
[0022]碳源:根据所购买实验药品说明书上得知葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉含碳量分别为40%、42.1 %、40%、42.1 %、44.4%。用葡萄糖，麦芽糖，果糖，蔗糖，可溶性淀粉作为碳源，分别IOg,9.5g, IOg,9.5g,9.0lg加入无碳基础培养基中，另设一个无糖作对照，重复6次共36处理，在25°C，黑暗条件下，采用平板培养法，在培养皿中央用0.5mm打孔器定量接种，在25°C恒温箱中倒置培养。接种后第3天，用十字交叉法每24个小时记录菌落生长直径，并注意菌丝颜色、菌苔厚度、菌落边缘特征，此后对菌丝生长速度采用Spssll.5软件中Dunca检验进行差异显著性分析，见表1_2.[0023]氮源:根据所购买实验药品说明书上得知甘氨酸、酵母浸粉、蛋白胨、硫酸铵的含氮量分别为18.65%、8~9%、14.5%、21%。黄豆粉和玉米粉蛋白质含量为32.7%和8.7%。根据凯氏定氮法，在任何生物样品中，每克氮相当于6.25g蛋白质，可以计算出黄豆粉与玉米粉的氮含量为5.232%与1.392%。在25°C，黑暗条件下，用分析天平分别称取酵母粉1.1Og,黄豆粉1.7823g,蛋白胨0.6431g,甘氨酸0.5g,硫酸铵0.444g,加入无氮基础培养基中，另设一个无氮作对照。接种与测量方法同上文碳源处理实验，实验结果见表1-3。
[0024]碳氮比:在25°C、无光条件下，固定基础培养基中葡萄糖的含量，变换黄豆粉的含量，配制成C/N比分别为5: 1,10: 1,20: 1,30: 1,40: 1,50: I的培养基。每处理用0.5mm打孔器定量分别接种接于不同碳氮比的培养基中，重复6次共36个处理，接种与测量方法同上文碳源处理实验，实验结果见表1-4。
[0025]pH值:在培养基PDA上，用磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液调节培养基的pH值分别为:3、4、5、6、7、8，重复6次共36个处理，接种与测量方法同上文碳源处理实验，实验结果见表 1-5。
[0026]温度:在培 养基PDA上，接入桦褐孔菌，分别设5°C，10°C，15°C，20 V，25°C，30 V，35°C，重复7次共42个处理，接种与测量方法同上文碳源处理实验，实验结果见表1-6。
[0027]筛选母种:将不同采集地点或不同采集时间的菌株进行纯化、扩大培养以备用。在PDA培养基上进行接种，方法同上文碳源处理实验，结果测量也如上文碳源处理实验，实验结果见表1-6。
[0028]培养料筛选:母种、原种培养基均采用常规PDA培养基；栽培种使用筛选母种实验中得到的活性好的两个菌株，取l_2cm长的其PDA斜面作为栽培种，以白桦树木屑为主料，黄豆粉、玉米粉、白砂糖、石膏、石灰等为辅料按不同配比成栽培种培养料，进行栽培袋培养料配方筛选，各配方组成和编号见表1-1。将主料和辅料常规拌料装袋，选用规格为17X33cm的聚乙烯折角袋，装袋后置于高压灭菌锅(121°C )中灭菌120min。每个菌株的每个配方30个处理，共计180个菌袋。接种后置于25°C恒温培养箱中暗培养，定时观察菌袋情况，随时清理出被污染的菌袋，待菌丝定殖后观察菌丝生长情况，菌核出现大小、密度、个数。按数据分析及长势情况选择最好的培养料配方进行下一步驯化研究。
[0029]表1培养料组分(干料％ )
[0030]
【权利要求】
1.一种桦褐孔菌人工栽培方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)桦褐孔菌菌株的分离、纯化:先用1:14的次氯酸钙上清液对子实体进行表面消毒，再用高温灭菌的镊子取中间5_左右小方块组织，将其移接于PDA培养基平板的中央，切取组织时，接种I1d后置于25°C恒温暗室中培养，随时检查菌株生长情况，及时排除被污染的平板，待菌丝长满平板后，再转入PDA斜面试管培养基上保存纯种，长满后然后置于4°C的冰箱中保存备用； 2)选用无碳基础培养基、无氮基础培养基，以麦芽糖为碳源的培养基，以鹿糖为碳源的培养基，黄豆粉为氮源，碳氮比20:1，pH为7，温度为30°C ； 3)桦褐孔菌人工驯化栽培:PDA培养基上，所述培养基为桦树木屑78%、黄豆粉20%、石膏1 %、蔗糖1 %及65%水，在35°C条件下培养15d，将其放在室温条件下培养20d，培养基上中心偏右部位长出了桦褐孔菌子实体，在35°C温箱下培养30天，室温下不开口放置20-50d,在培养袋口及基部产生了子实体。
2.根据权利要求1所述的桦褐孔菌人工栽培方法，其特征在于，所述桦褐孔菌菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【文档编号】A01G1/04GK103891523SQ201310595655
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年11月16日 优先权日:2013年11月16日
【发明者】董爱荣, 刘雪峰 申请人:东北林业大学