以花柄为外植体的虎眼万年青离体快繁方法
【专利摘要】本发明属于花卉繁殖方法，具体涉及花卉的无性快速繁殖方法。以虎眼万年青幼嫩的花柄为外植体，脱分化率及分化率均可达70％～75％以上。由一块外植体诱导的愈伤组织经反复继代可分化出300多株丛生芽。丛生芽生根率可达90％以上，在适宜环境下移栽成活率达95％以上。使虎眼万年青在相对短的时间内大规模繁殖出外观整齐的植株，再生植株变异低；再生体系非常高效；平均单株再生苗的成本极低，适合虎眼万年青的大批量高效快速繁殖，非常适用于工厂化生产。
【专利说明】以花柄为外植体的虎眼万年青离体快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明属于花卉繁殖方法，具体涉及花卉的无性快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]虎眼万年青，别名海葱、鸟乳花。是百合科万年青属的一种多年生草本植物，原产于非洲南部。鳞茎卵球形，绿色，直径可达10厘米。叶5-6枚，带状或长条状披针形，长30-60厘米，宽2.5-5厘米，作为一种观赏花卉也具有很高的观赏价值。虎眼万年青中含有虎眼万年青皂甙(简称0SW-1)，经前人在生理活性筛选实验中发现其体外抗癌活性比临床使用的紫杉醇、阿霉素、喜树碱等抗癌药物强十倍甚至百倍。而且对正常细胞没有毒性。从虎眼万年青中分离出的皂甙0SW-1对肺癌、乳腺癌有明显的抗癌活性，是常见抗癌药物喜树碱、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10~100倍。这一惊人发现将意味着虎眼万年青有可能取代紫杉醇、阿霉素、喜树碱等药物，经济价值十分巨大。目前虎眼万年青的繁殖方法主要以分球和播种繁殖为主，虽然较易成活，但是一个成熟种球，每年分球不到10个，繁殖效率很低，播种繁殖出苗率不高，繁殖周期长，大约3年左右，极大地影响了生产效率。植物组织培养即植物离体培养技术，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根、形成完整的植株或产生具有经济价值的其它产品的技术。由植物组织培养所产生的再生植株除了极低的变异外基本都能保持亲本(外植体来源植株)的优良性状。植物组织培养技术发明以来已经取得了很大的进展。利用植物组织培养技术离体快速繁殖虎眼万年青可以大规模产生株型统一的植株，快速繁殖虎眼万年青，进一步满足国内国际市场的需求。前人所做的虎眼万年青组织培养实验虽然已经初步获得成功，通常采用鳞茎为外植体进行诱导愈伤，由于使用鳞茎为外植体生`叶生根较快，不利于继代培养，繁殖系数较低。这就限制了虎眼万年青组织培养技术在实际生产中的应用。而本发明可使虎眼万年青在一年以内实现快速繁殖，非常适合工厂化生产。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为克服虎眼万年青的传统繁殖方法，依靠自然分球繁殖，繁殖速度慢的缺点；克服前人虎眼万年青组织培养实验中分化率低、再生系数小、不适合工厂化生产的缺点。提供一种以虎眼万年青花柄为外植体的离体快速繁殖技术。
[0004]本发明所采用的技术方案是:
[0005]1.外植体接种及愈伤组织诱导:将虎眼万年青花絮下端幼嫩的花柄剪断取下，将幼嫩的花柄放入无菌超净台中，用75 % (体积/体积)酒精浸泡I~2分钟，用0.1~0.2 %(质量/体积)的升汞溶液浸泡5~10分钟，无菌水冲洗3~5遍。将幼嫩的花柄切为长度3~5mm的小块，接种在含6-BA2~2.5mg / L、IBA0.1~0.2mg / L、鹿糖3.0~4.5%(质量/体积)，pH值为5.5~6.5的MS培养基上，20°C~30°C每天日光灯照射4~6小时，光照强度1500~2000Lux。25~30天继代一次，待长出黄绿色愈伤时即便可诱导分化。
[0006]2.不定芽的诱导:将黄绿色的愈伤转接到含NAA(0.1~0.5mg / L) +KT(1.5~
2.5mg / L) +琼脂(5~7g / L) +3.5~4.5%蔗糖(质量/体积)的MS诱导分化培养基，pH值为5.5~6.5，40~45天继代一次，20°C~30°C每天日光灯光照8~10小时，光照强度1500~2000LUX。该愈伤分化能力可持续一年以上，从一块愈伤经反复继代可分化出300多株的再生苗。
[0007]3.根的诱导:再生植物转到I / 2MS+NAA(1~2mg / L) +琼脂(5~7g / L) +蔗糖2% (质量/体积)，pH值为5.5~6.5的生根培养基上，20°C~30°C每天日光灯光照12小时左右，光照强度1500~2000Lux。
[0008]4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:细沙=3:1:1的种植基质中，移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净，种植基质121°C灭菌30~45分钟，8~12天烧一次透水便可成活。
[0009]本发明的有益效果是:以虎眼万年青幼嫩的花柄为外植体，脱分化率及分化率均可达70%~75%以上。由一块外植体诱导的愈伤组织经反复继代可分化出300多株丛生芽。丛生芽生根率可达90%以上，在适宜环境下移栽成活率达95%以上。使虎眼万年青在相对短的时间内大规模繁殖出外观整齐的植株，再生植株变异低；再生体系非常高效；平均单株再生苗的成本极低，适合虎眼万年青的大批量高效快速繁殖，非常适用于工厂化生产。
【具体实施方式】
[0010] 下面将结合实例对本发明做进一步的说明，但本发明的内容不仅限于以下2个实施例:
[0011]实施例一:
[0012]1.外植体接种及愈伤组织诱导:将虎眼万年青花絮下端幼嫩的花柄剪断取下，将幼嫩的花柄放入无菌超净台中，用75% (体积/体积)酒精浸泡I分钟，用0.2% (质量/体积)的升汞溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗5遍。将幼嫩的花柄切为长度3~5mm的小块，接种在含6-BA2mg / L、IBA0.15mg / L、蔗糖3.5% (质量/体积)，pH值为6.2的MS培养基上，20°C~30°C每天日光灯照射4~6小时，光照强度1500~2000Lux。25天继代一次，待长出黄绿色愈伤时即便可诱导分化。
[0013]2.不定芽的诱导:将黄绿色的愈伤转接到含NAA(0.15mg / L)+KT(2.0mg / L) +琼脂(7g / L) +4.0 %蔗糖(质量/体积)的MS诱导分化培养基，pH值为6.1，40天继代一次，20°C~30°C每天日光灯光照8~10小时，光照强度1500~2000Lux。该愈伤分化能力可持续一年以上，从一块愈伤经反复继代可分化出315株的再生苗。
[0014]3.根的诱导:再生植物转到I / 2MS+NAA(2mg / L) +琼脂(6g / L) +蔗糖2% (质量/体积)，PH值为6.0的生根培养基上，20°C~30°C每天日光灯光照12小时左右，光照强度 1500 ~2000Lux。
[0015]4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:细沙=3:1:1的种植基质中，移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净，种植基质121°C灭菌40分钟，12天浇一次透水便可成活。[0016]实施例二:
[0017]1.外植体接种及愈伤组织诱导:将虎眼万年青花絮下端幼嫩的花柄剪断取下，将幼嫩的花柄放入无菌超净台中，用75% (体积/体积)酒精浸泡2分钟，用0.1% (质量/体积)的升汞溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗5遍。将幼嫩的花柄切为长度3~5mm的小块，接种在含6-BA2.2mg / L、IBA0.1mg / L、蔗糖3.8% (质量/体积)，pH值为5.8的MS培养基上，20°C~30°C每天日光灯照射4~6小时，光照强度1500~2000Lux。28天继代一次，待长出黄绿色愈伤时即便可诱导分化。
[0018]2.不定芽的诱导:将黄绿色的愈伤转接到含NAA (0.4mg / L)+KT(2.0mg / L) +琼脂(5g / L)+3.5%蔗糖(质量/体积)的MS诱导分化培养基，pH值为5.5，45天继代一次，20°C~30°C每天日光灯光照8~10小时，光照强度1500~2000Lux。该愈伤分化能力可持续一年以上，从一块愈伤经反复继代可分化出358株的再生苗。
[0019]3.根的诱导:再生植物转到I / 2MS+NAA(1.5mg / L) +琼脂(5g / L) +蔗糖2%(质量/体积)，pH值为5.6的生根培养基上，20°C~30°C每天日光灯光照12小时左右，光照强度1500~2000Lux。
[0020]4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:细沙=3:1:1的种植基质中，移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净，种植基质121°C灭菌35分钟，10天浇一次透水便可成 活。
【权利要求】
1.以花柄为外植体的虎眼万年青离体快繁方法，其特征在于包括下列步骤: 1)外植体接种及愈伤组织诱导:将虎眼万年青花絮下端幼嫩的花柄剪断取下，将幼嫩的花柄放入无菌超净台中，用75% (体积/体积)酒精浸泡I~2分钟，用0.1~0.2%(质量/体积)的升汞溶液浸泡5~10分钟，无菌水冲洗3~5遍。将幼嫩的花柄切为长度3~5mm的小块，接种在含6-BA2~2.5mg / L、IBA0.1~0.2mg / L、鹿糖3.0~4.5%(质量/体积)，pH值为5.5~6.5的MS培养基上，20°C~30°C每天日光灯照射4~6小时，光照强度1500~2000Lux。25~30天继代一次，待长出黄绿色愈伤时即便可诱导分化。 2)不定芽的诱导:将黄绿色的愈伤转接到含ΝΑΑ(0.1~0.5mg / L)+KT(1.5~，2.5mg / L) +琼脂(5~7g / L) +3.5~4.5%蔗糖(质量/体积)的MS诱导分化培养基，pH值为5.5~6.5,40~45天继代一次，20°C~30°C每天日光灯光照8~10小时，光照强度1500~2000LUX。该愈伤分化能力可持续一年以上，从一块愈伤经反复继代可分化出300多株的再生苗。 3)根的诱导:再生植物转到I/ 2MS+NAA(1~2mg / L) +琼脂(5~7g / L) +蔗糖2%(质量/体积)，pH值为5.5~6.5的生根培养基上，20°C~30°C每天日光灯光照12小时左右，光照强度1500~2000Lux。 4)再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:细沙=3: I: I的种植基质中 ，移栽前将植株上的琼脂等杂物冲洗干净，种植基质121 °C灭菌30~45分钟，8~12天浇一次透水便可 成活。
【文档编号】A01H4/00GK103858773SQ201410143767
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】赵和文, 崔金腾, 张克中, 李月华, 王杰, 陈建梅 申请人:北京农学院