一种来源于虎眼万年青的4-香豆酸辅酶a连接酶，其核苷酸序列及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种来源于虎眼万年青的4香豆酸辅酶A连接酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；还提供了编码4香豆酸辅酶A连接酶基因的核苷酸序列，如SEQIDNO.2所示，以及含有该编码核苷酸序列的载体和宿主细胞。本发明还提供了4香豆酸辅酶A连接酶或含有4香豆酸辅酶A连接酶的细胞在催化底物对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸为相应硫酯化合物中的应用。
【专利说明】-种来源于虎眼万年青的4-香豆酸辅酶A连接酶，其核苷 酸序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种4-香豆酸辅酶A连接酶，其编码基因及其在催化底物对香豆酸、 咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸为相应硫酯化合物中的应用，属于基因工程领域。特别涉及虎眼万 年青4-香豆酸辅酶A连接酶，其编码基因及其在催化底物对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂 酸为相应硫酯化合物中的应用
【背景技术】
[0002] 黄酮类天然产物是一类种类繁多，活性显著，结构复杂的化合物，是许多临床药物 的直接或间接来源，在工农业生产中也有广泛应用。面临资源紧张，化学合成环境污染严 重，产率低等问题，不利于社会医药卫生事业的发展以及人们健康水平的提高，因此，建立 一种基于合成生物学理念的高效绿色合成黄酮类天然药物的人工合成体系对创新药物可 持续发展至关重要。
[0003] 天然药物合成生物学是在基因组解析技术和化学合成技术为核心的现代生物技 术基础上，将工程学和系统生物学相结合，综合生物信息学、结构生物学、药学等学科，建立 起来的以规模化和程序化制备天然药物为目的的集成学科，是一种采用绿色、可持续发展 方式规模化制备天然药物的工程化生物合成技术。其研究内容目前主要包括两个方面，一 是天然药物固有代谢途径的解析，重构与工程化；二是全新天然药物合成途径的设计、筛 选、组装与程序化。不仅可以在微生物中从头设计和构建重要天然药物的人工合成途径，获 得一些能够生产合成生物技术药物的"细胞工厂"，而且还可以通过对天然产物生物合成途 径的遗传操作来生产基于天然产物的创新药物分子。
[0004] 合成生物学的物质基础是核酸，克隆途径酶基因并对其进行功能鉴定是进行天然 产物合成物生物学研究的关键一步。作为黄酮类天然产物生物合成途径中的一个关键酶， 4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate:CoA-ligase, 4CL;EC6. 2. 1. 12)在苯丙烷类代谢途径 中发挥重要作用，它可以催化肉桂酸以及多种肉桂酸衍生物生成相应的硫酯化合物。而这 些辅酶A酯在植物苯丙烷类代谢途径中再经过短短几个反应即可得到有功能的次级代谢 产物，如香豆酰辅酶A可直接进入黄酮类化合物生物合成途径。因此，克隆4-香豆酸辅酶A 连接酶基因并对其进行功能鉴定是黄酮类天然药物合成生物学研究的基础之一。本发明通 过对虎眼万年青（Ornithogalum saundersiae)进行转录组测序，获得了虎眼万年青4-香 豆酸辅酶A连接酶序列信息。通过提取虎眼万年青RNA，利用RT-PCR，从虎眼万年青无菌鳞 茎中克隆得到一个4-香豆酸辅酶A连接酶基因，命名为0sa4CL，并对其进行了功能鉴定，这 是首次从虎眼万年青植物中克隆得到这个基因。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的是提供一种4-香豆酸辅酶A连接酶。
[0006] 本发明的第二目的是提供编码该酶的核苷酸序列。
[0007] 本发明的第三目的是提供含有该核苷酸序列的表达载体。
[0008] 本发明的第四目的是提供含有该表达载体的宿主细胞。
[0009] 本发明的第五目的是提供4-香豆酸辅酶A连接酶的应用。
[0010] 为了实现本发明之目的，采用的技术方案为：
[0011] 本发明提供一种来源于虎眼万年青的4-香豆酸辅酶A连接酶，其特征在于：
[0012] a) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0013] b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经替换，缺失或添加1-110个氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。
[0014] 本发明还提供一种编码所述4-香豆酸辅酶A连接酶的基因序列，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0015] 本发明还提供一种含有所述核苷酸序列的表达载体。
[0016] 本发明还提供一种所述表达载体的宿主细胞。其中所选宿主细胞优选大肠杆菌， 酿酒酵母，毕赤酵母，链霉菌和植物细胞，更优选的宿主细胞选自大肠杆菌。
[0017] 本发明还提供了 4-香豆酸辅酶A连接酶或含有4香豆酸辅酶A连接酶的细胞在 催化底物对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸为相应硫酯化合物中的应用。其中4-香豆酸 辅酶A连接酶的底物包括对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸，形成的产物分别为对香豆酰 辅酶A，咖啡酰辅酶A、阿魏酰辅酶A和肉桂酰辅酶A。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图I :0sa4CL基因的PCR分析结果，其中M是DNA分子量标准；1是0sa4CL基因 PCR结果。
[0019] 图2 :重组质粒pET28a0sa4CL示意图
[0020] 图3 :重组0sa4CL蛋白的SDS-PAGE电泳结果，其中1是空载体对照；2是重组 0sa4CL蛋白；M是蛋白质分子量标准。
[0021] 图4 :重组0sa4CL蛋白的Western blotting分析结果，其中1是0sa4CL蛋白；2 是对照。
[0022] 图5 :底物的结构式，其中R1, R2, R3=H为肉桂酸J1=OH, R2, R3=H为对香豆酸； R1, R2=OH, R3=H 为咖啡酸 J1=OH, R2=OCH3, R3=H 为阿魏酸 J1=OH, R2, R3=OCH3 为芥子酸。
[0023] 图6 :硫酯类产物的结构式，其中R1, R2, R3=H为肉桂酰辅酶A J1=OH, R2, R3=H为 对香豆酰辅酶A成，R2=OH, R3=H为咖啡酰辅酶A J1=OH, R2=OCH3, R3=H为阿魏酰辅酶A ; R1=OH, R2, R3=OCH3为芥子酰辅酶A。
[0024] 图7 :0sa4CL粗蛋白以对香豆酸为底物的HPLC结果，其中1是对照组1 (空载体 组）；2是对照组2 (灭活蛋白组）；3是实验组。
[0025] 图8 :0sa4CL粗蛋白以阿魏酸为底物的HPLC结果，其中1是对照组1 (空载体组)； 2是对照组2 (灭活蛋白组）；3是实验组。
[0026] 图9 :0sa4CL粗蛋白以咖啡酸为底物的HPLC结果，其中1是照组1 (空载体组）；2 是对照组2 (灭活蛋白组）；3是实验组。
[0027] 图10 :0sa4CL粗蛋白以肉桂酸为底物的HPLC结果，其中1是对照组1(空载体组)； 2是对照组2 (灭活蛋白组）；3是实验组。
[0028] 图11 :化合物Xl的HPLC-MS结果。
[0029] 图12 :化合物X2的HPLC-MS结果。
[0030] 图13 :化合物Al的HPLC-MS结果。
[0031] 图14 :化合物A2的HPLC-MS结果。
[0032] 图15 :化合物Cl的HPLC-MS结果。
[0033] 图16 :化合物C2的HPLC-MS结果。
[0034] 图17 :化合物Rl的HPLC-MS结果。
[0035] 图18 :化合物R2的HPLC-MS结果。
[0036] 图19 :化合物Xl1H NMR结果。
[0037] 图20 :化合物Xl13C NMR结果。
[0038] 图21 :化合物Al1H NMR结果。
[0039] 图22 :化合物Al13C NMR结果。
[0040] 图23 :化合物Cl1H NMR结果。
[0041] 图24 :化合物Cl13C NMR结果。
[0042] 图25 :化合物Rl1H NMR结果。
[0043] 图26 :化合物Rl13C NMR结果。
[0044] 图27 :0sa4CL咪唑洗脱组分的SDS-PAGE电泳结果，其中M是蛋白分子量标准；1是 菌体破碎的粗蛋白；2是含25mM咪唑elution buffer洗脱组分；3是含50mM咪唑elution buffer洗脱组分；4是含IOOmM咪唑elution buffer洗脱组分；5是含150mM咪唑elution buffer洗脱组分。
[0045] 图28 :温度对0sa4CL酶酶活力的影响（以对香豆酸为底物)。
[0046] 图29 :pH对0sa4CL酶酶活力的影响（以对香豆酸为底物)。
[0047] 图30 :0sa4CLl和其他4CLs氨基酸序列的系统进化树分析。
【具体实施方式】
[0048] 本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是 以任何方式限制本发明权利要求的范围。
[0049] 实施例1虎眼万年青转录组测序及序列分析
[0050] 提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA后，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合 成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、 加poly (A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩 增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序。
[0051] 测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。对raw reads进行数据过滤，去掉带接头的，重复的，测序质量很低的reads,得到 clean reads。使用短reads组装软件Trinity将具有一定长度overlap的clean reads连 成更长的片段，即Contig。然后，将clean reads比对回Contig，通过paired-end reads能 确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，Trinity将这些Contig 连在一起，得到两端不能再延长的序列，这些序列称之为Unigene。通过blastx将Unigene 序列比对到蛋白数据库nr、Swiss_Prot、KEGG和COG (evalue〈0. 00001)，并通过blastn将 Unigene比对到核酸数据库nt(evalue〈0. 00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似 性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。
[0052] 通过功能注释，从虎眼万年青转录组序列中发现一个具有4-香豆酸辅酶A连接酶 保守序列的 Unigene (SEQ ID NO. 3)。
[0053] 实施例20sa4CL生物信息学分析
[0054] 利用 NCBI 的 ORF Finder (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/orfig. cgi)软件 对SEQ ID NO. 3进行ORF分析，结果发现，其中含有1个长为1638bp的4-香豆酸辅酶A连接 酶 0RF，命名为 0sa4CL，序列如 SEQ ID NO. 2 所示。用 Expasy 中的工具 ProtParanKhttp:// web. expasy. org/protparam/)预测0sa4CL编码蛋白的理化性质，结果表明，0sa4CL蛋白 编码545个氨基酸，分子质量为59. 5332kDa，理论的等电点为5. 37。通过TMpred(http:// www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html)分析，结果显不该蛋白具有 2 个跨膜结 构域，分别是由82位?107位的26个氨基酸组成的膜内到膜外的结构域和232位?257 位组成的由膜外到膜内的结构域。由此认为该编码蛋白很可能是一个跨膜蛋白，提示它可 能为膜受体，也可能是定位于膜的锚定蛋白或者离子通道蛋白等。
[0055] 通过 Signal P4. I (http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)对蛋白信号肤 预测，结果显示（图3)，该蛋白没有信号肽，因此该蛋白不是一种分泌蛋白，综合TMpred分 析，该蛋白应为膜结合蛋白。
[0056] 米用 TargetPL I (http://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/)预测 0sa4CL 的 细胞定位，结果显示，该蛋白定位于线粒体或分泌途径的可能性很少(得分分别为〇. 126和 0. 068)，可能定位在其他的细胞位置(得分为0. 865)，这和前面预测该蛋白为膜结合蛋白的 结论一致。
[0057] 实施例30sa4CL基因克隆
[0058] 取IOOmg虎眼万年青无菌鳞茎于液氮中速冻，研钵研成细粉状，按RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)使用说明，提取虎眼万年青愈伤组织总RNA。使用RT-PCR Kit (ReverTra-Plus-，Τ0Υ0Β0)将虎眼万年青愈伤组织总RNA反转录成cDNA。反转录体系和 程序如下：在 20 μ L 体系中加入总 RNAl μ g，RNase Free H2CM μ L，01ig(dT)2(lly L，65 °C 保温5min后，立刻置于冰上冷却，然后在上述管中再依次加入5XRT buffer4yL，RNase Inhibitor (10U/μι) 1 μ L，dNTP Mixture (IOmM)和 ReverTra Acel μ L，3CTC 保温 10min， 42°C温育60min，85°C变性5min，冰上5min，完成cDNA的合成。cDNA置于-20°C备用。
[0059] 以虎眼万年青愈伤组织cDNA为模板，设计两对0sa4CL特异引物，通过巢式PCR的 方法扩增0sa4CL基因。
[0060] 第一轮 PCR，50y L 体系中含 10XPCR buffer5y L，2mM dNTPs5y L， 25mMMgS043 μ L，10 μ M 的引物 FCLl-I (5, -TTAATTAGAAGCAAGCAAGC-3'）和 RCLl-I (5, -CTTT TCGACGGTCAGATCGAG-3,）各 I. 5 μ L，KOD-Plus-Neol μ L，cDNA2 μ L，ddH20
[0061] 补足。PCR 程序：94°C预变性 5min ;98°C变性 30s，36°C复性 45s，68°C延伸 90s，共 30 个循环；68°C 延伸 7min，4°C 保温。第二轮 PCR，50y L 体系中含 10XPCR buffer5y L，2mM dNTPs5 μ L，25mM MgS043 μ L，10 μ M 的引物 FCL1-2 (5, -ATGGGCTCCATCCCGTCGG-3'）和 RCL l-2(5，-TCACTGCTGAGGGCCGTTAG-3，）各 I. 5μ L，K0D-Plus-Neol μ L，第一轮 PCR 产物 2μ L， ddH20 补足。PCR 程序：94°C预变性 5min ;98°C变性 30s，47°C复性 45s，68°C延伸 90s，共 30 个循环；68°C延伸7min，4°C保温。0. 8%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果表明，扩增得到 了一条长约为I. 7kb的条带（图1)。
[0062] PCR 产物与 pEASY-Blunt (Transgen)载体连接，转化到 Transl-Tl (Transgen)菌 株，在含有100 μ g/mL羧苄青霉素的LB平板上培养，挑取单克隆进行菌落PCR，筛选阳性克 隆送样测序。结果表明，扩增得到的PCR产物与转录组测序结果完全一样，长为1638bp，含 有该基因的载体命名为pEASY-0sa4CL。
[0063] 实施例40sa4CL表达载体的构建
[0064] 根据In-Fusion(Clontech)同源重组的原理，以测序正确的质粒pEASY_0sa4CL为 模板，FET28aCLl (5, -TCGCGGATCCGAATTCATGGGCTCCATCCCGTCGG-3，）和 RET28aCLl(5, -GT GCGGCCGCAAGCTTTCACTGCTGAGGGCCGTTAG-3'）为引物，通过如下程序和体系进行 PCR，50 μ L 体系中含 IOXPCR buffer5yL，2mMdNTPs5yL，25mM MgS043 yL，10y]\^3$*FET28aCLl (5, -TCGCGGATCCGAATTCATGGGCTCCATCCCGTCGG-3'）和 RET28aCLl (5, -GTGCGGCCGCAAGCTTTC ACTGCTGAGGGCCGTTAG-3'）各 I. 5 μ L，KOD-Plus-Neol μ L，cDNA2 μ L，ddH20 补足。PCR 程序： 94°C预变性5min ;98°C变性30s，74°C延伸90s，共5个循环；98°C变性30s，72°C延伸90s， 共5个循环；98°C变性90s，70°C延伸90s，共5个循环；98°C变性30s，68°C延伸90s，共20 个循环；68°C延伸7min，4°C保温。扩增得到长为1638bp的OsaCLl基因。将该基因通过 In-Fusion的方法克隆到EcoR I和Hind III双酶切处理的pET-28a(+)中，重组产物转化 到Transl-Tl菌株，在含有100 μ g/mL的卡那霉素的LB平板上培养，挑取单克隆进行菌落 PCR，筛选阳性克隆进行测序。结果表明载体构建正确，命名为PET28a0sa4CL (图2)。
[0065] 实施例50sa4CL蛋白表达及免疫印迹
[0066] 将测序正确的重组质粒pET28a0sa4CL转入大肠杆菌Transetta (DE3)感受态细 胞，涂于100 μ g/mL卡那霉素和氯霉素的LB固体平板上筛选，获得的阳性重组克隆命名为 E. coli [pET28a0sa4CL]。挑取单克隆于含100 μ g/mL卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基 37°C /250rpm，培养至OD值为L 0。取ImL至IOOmL含100 μ g/mL卡那霉素和氯霉素的LB 液体培养基37°C /250rmp扩大培养，至OD值为0. 6时，加入IPTG使其终浓度为0. 3mM，27°C 诱导8h。
[0067] IPTG诱导8h后，取I. 5mL菌体，12, 000rpm/min，离心2min。弃上清，加入裂解液 A(50mM Tris-HCl pH8.0,50mM EDTA，50mM NaCl，5% 甘油，0· ImM DTT)300yL，置冰上超声 破碎至澄清，于4°C离心机13, OOOg离心15min，即得到粗蛋白。取上清15 μ L，SDS-PAGE电 泳，银染法检测蛋白表达。结果表明，和对照相比，经过诱导的重组菌株中产生了一条大小 为59kDa的特异条带，与理论值符合（图3)。
[0068] 为进一步确证0sa4CL基因的表达，进行了免疫印迹分析。离心收集 E. coli [pET28a0sa4CL]的菌体，用超声破碎液进行SDS-PAGE电泳，采用Western blot进 行检测。所用一抗为抗His-Tag的小鼠（1:5000)单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG (1 : 5000)单克隆抗体。结果表明，与对照相比，E. coli[pET28a0sa4CL]经免疫印迹后，在相应 的位置上出现了一条相应的杂交带（图4)。因此，确认重组的0sa4CL蛋白具有特异的免疫 活性，表明0sa4CL基因在E. coli中得到了表达。
[0069] 实施例60sa4CL的功能鉴定
[0070] 目前文献报道的不同植物来源的4-香豆酸辅酶A连接酶具有催化对香豆酸、肉桂 酸、阿魏酸、咖啡酸为相应硫酯化合物的能力，也有少部分具有催化芥子酸形成芥子酰辅酶 A的能力。本实验同样选择了对香豆酸、肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸以及芥子酸（图5)5个底物， 按如下体系进行酶促反应。酶促体系如下：Tris-HCl (200mM，pH7. 90)1000yL中含20μΜ 底物，2. 5mM ATP，2. 5mM MgCl2,0. 2mM CoA，100μ L粗蛋白（菌体裂解液，约Iml菌液所得)。 30°C孵育15min后（加入CoA开始计时)，加入40 μ L乙酸终止反应。12, 000rpm/min离心 2min，取上清过0. 22 μ m的滤膜即为样品。进25 μ L样品通过反相HPLC分析，硫酯酶和底 物通过如下液相条件分离(表1 )，香豆酰辅酶Α、阿魏酰辅酶Α、咖啡酰辅酶Α、芥子酰辅酶A 均在320nm处检测，肉桂酰辅酶A在270nm处检测（图6)。
[0071] 表 1
[0072]
【权利要求】
1. 一种来源于虎眼万年青的4-香豆酸辅酶A连接酶，其特征在于： a) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列； b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经替换，缺失或添加1-110个氨基酸形成的具有同等 功能的氨基酸序列。
2. -种编码权利要求1所述4-香豆酸辅酶A连接酶的基因序列。
3. 根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 一种含有权利要求2或权利要求3所述核苷酸序列的表达载体。
5. -种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。
6. 根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，其宿主细胞包括但不限于大肠杆菌， 酿酒酵母，毕赤酵母，链霉菌，植物细胞。
7. 根据权利要求1所述的4-香豆酸辅酶A连接酶或含有4-香豆酸辅酶A连接酶的细 胞在催化底物对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸为相应硫酯化合物中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述4-香豆酸辅酶A连接酶的底物包括 对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述4-香豆酸辅酶A连接酶在催化底物 对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸后，形成的产物分别为对香豆酰辅酶A，咖啡酰辅酶A、 阿魏酰辅酶A和肉桂酰辅酶A。
【文档编号】C12N15/63GK104212772SQ201310207333
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月29日 优先权日:2013年5月29日
【发明者】孔建强, 陈茜, 王志标, 李丽娜, 王伟, 郭嘉, 程克様 申请人:中国医学科学院药物研究所