一种受机械损伤诱导表达的水稻启动子的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程【技术领域】，特别是涉及到一种受机械损伤或者虫害时特异性表达的启动子、含有该启动子的植物表达载体和转化子，本发明还涉及上述启动子在植物转基因工程中的应用。本发明提供一种受机械损伤或者虫害时诱导表达的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。发明人将含有该启动子DNA序列和GUS基因的植物表达载体，经农杆菌介导的方法转化水稻，获得转基因植株，经染色鉴定，GUS基因在水稻损伤部位表达，因此本发明提供的启动子能够驱动外源基因在植物受到创伤时诱导表达，可以用来培育抗虫品种。
【专利说明】一种受机械损伤诱导表达的水稻启动子
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】，具体涉及一种水稻启动子OsffI (Wound Induce),该启动子受机械损伤的诱导,可应用于抗虫、抗病或抗逆境伤害的抗性基因工程和分子育种途径。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上的最重要农作物之一。因此如何改进稻米的品质，提高水稻的抗病虫害能力，增加稻米产量已成为育种学家和植物病理学家研究的共同课题。水稻在生长过程中要经受多种病虫害的威胁:我国1991年由于稻飞虱的大发生造成稻谷损失约166万吨；此外病害造成水稻减产可高达30%。因此，要使稻米达到高产和稳产就必须控制水稻病虫害。
[0003]植物体因为不能自主移动，只能被动地适应环境。经过长期的进化，植物体建立了一套保护机制，以抵御不利因子如病虫害的侵害，与此同时，人们也通过选择、杂交等传统的方法培育抗病虫品种，随着分子生物学的发展，植物抗病虫机制得以在分子水平上进行描述，分子育种得以实现。
[0004]利用基因工程的方法，人们将特定的基因导入植物中，提高植物的抗虫能力。如孟山都公司将CaMV35S启动子驱动的Bt基因导入棉花，实现了棉花对棉铃虫的有效控制。近年转基因植物产业化步伐不断加快，尤其发展中国家转基因作物种植面积增幅较快，例如印度2005年的转基因棉花面积比2004年增加260%，达到130多万公顷；巴西的转基因大豆面积比2004年增加88%，达到930多万公顷。2010年，我国种植转基因棉花300多万公顷，占全球总面积的4%。目前，全世界已有21个国家种植转基因作物。20多年来，植物基因工程中较为广泛使用的启动 子有来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子和来自植物本身的Adhl、Actl、UbiI等启动子，这些均是组成型启动子。
[0005]由于组成型启动子驱动的基因在植物不同组织器官中均有不同程度的表达，在多数情况下，人们并不希望外源基因在转基因植物整个植株、整个生育期中广泛表达，因为一方面会增加植株的代谢负担，另一方面，有些外源蛋白对植物并非必需甚至有毒，不利于植物正常生长；另外，在一些植物器官中，组成型启动子的表达活性不强。
[0006]植物诱导型启动子的研究是植物生物【技术领域】的一个热点。研究内容主要集中在两个方面，一是天然的诱导型启动子的研究，包括对光、温、水、盐、创伤、病原菌侵袭等应答的启动子。二是关于人工诱导型启动子的研究，即利用对天然启动子的研究成果，构建外源基因可诱导表达系统。具体而言，例如Ni等分析了 Ti质粒上甘露碱合成酶基因启动子的创伤诱导要素，Devoto等，Xu等分别研究了马铃薯基因、水稻几丁质酶基因、大麦脂肪氧合酶基因等启动子序列与创伤或诱导的关系。
[0007]本发明的研究人员已经注意到启动子OsWIl正常情况下保持沉默，但遇到创伤、虫食侵袭，就会迅速强劲地启动表达，其结构特征决定它在植物病虫防御系统中具独特作用。用该启动子与外源基因所连接成的表达载体转化植物，其外源基因受创伤的诱导表达，例如当转化植物受到虫害时能够诱导表达所述抗虫基因以获得对虫害的抗性。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种驱动外源基因在水稻受机械损伤或者虫害时特异性表达的启动子、含有该启动子序列的植物表达载体以及二者的应用。
[0009]—方面，本发明提供一种受机械损伤诱导表达的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1 所示。
[0010]另一方面，本发明还提供一种受机械损伤诱导表达的启动子OsWIl，其核苷酸序列为下述之一:
[0011]具有序列表SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列；
[0012]具有在所述序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加或取代或插入或缺失一个或一个以上的核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物，以及在高严谨条件下与所述序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
[0013]本发明的特异性表达启动子OsWI I来 源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.NipponbareX
[0014]另一方面，本发明还提供一种植物表达载体，其包括上述启动子的全部或部分序列，且所述植物表达载体被导入宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为农杆菌宿主细胞。优选地，所述植物表达载体由上述特异性启动子与载体结合而构成。
[0015]另一方面，本发明提供一种转化子，其特征是所述转化子含有上述水稻特异性表达启动子或植物表达载体及宿主。
[0016]优选地，本发明的所述转化子为细胞系，愈伤组织或转基因植株，所述宿主为根癌农杆菌。
[0017]优选地，本发明的植物特异性表达启动子OsWIl应用在培育转基因植物中，所述转基因植物优选为水稻。
[0018]另一方面，本发明提供上述受机械损伤诱导表达的启动子的应用，其中，所述启动子与目标基因融合，转化到植物细胞、植物组织或植物器官被培育成植株，实现目标基因在植物受机械损伤或者虫害时特异性表达，从而达到对植物的遗传改良。优选地，所述植物为水稻。
[0019]需要说明的是在本文中提到机械损伤时，其可以包括各种形式的物理损伤，包括因病虫害带来的损伤。
[0020]本发明的具体内容是:
[0021]从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到基因启动子序列，我们称之为OsWI I，其结构包括转录起始位点在内的1699bp的DNA序列，该序列经酶切后连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，利用所得到的重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织⑶S染色，发现转基因植株整体上的Gus基因表达水平相对较低，仅在损伤处显蓝色，证明该1699bp启动子序列启动子具有驱动基因在创伤部位表达的活性。
[0022]本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后可驱动靶标基因的特异表达，从而减轻外源基因由于过量表达而对作物的影响。
[0023]本发明的技术效果表明，所克隆的水稻启动子OsWIl能够调控基因在受机械损伤或者虫害时集中表达，在实际应用中具有一定的价值。利用该启动子与外源基因连接构成的重组表达载体转化植物，外源基因表达受创伤的强烈诱导，例如当转化植物受到虫害损伤时能够诱导表达所述启动子驱动的抗虫基因，以获得对虫害的抗性。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]下面，结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步的详细说明，附图中:
[0025]图1A为植物双元表达载体PCAMBIA1391的示意图；
[0026]图1B为利用OsWIl启动子驱动⑶S表达的载体pCAMBIA1391_0sWIl的示意图；
[0027]图2A-2B为利用OsWIl启动子驱动Gus基因表达情况的分析，其中，图2A为OsffIl-1391转基因水稻各部位Gus染色结果及35S染色结果，图2B为0sWIl_1391转基因水稻叶片受机械性损伤后Gus染色结果。
【具体实施方式】
[0028]下面，结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步的详细说明，下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
[0029]实施例1、含有酶切位点的OsWIl启动子的获得
[0030]步骤1、引物的设计
[0031 ] 根据美国国立生物技术信息 中心(NCBI)中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativaL cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsWIl基因的上游1699bp序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点，在本实施例中以水稻双元表达载体PCAMBIA1391 (来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为:正向引物5’端带PstI，酶切位点(CTGCAG)，反向引物5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下:
[0032]正向引物:CTGCAGCCTGGCACGACCTGACAACCTCPstI
[0033]反向引物:GGATCCTTGTTTCTCTCTCTAGCACTGCBamHI
[0034]由深圳华大基因公司合成。
[0035]步骤2、启动子OsWIl的获得
[0036]以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、正向引物扩增启动子OsWI I，按常规PCR体系，扩增程序采用如下:
[0037]95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s, 72°C延伸 2min30s，35 个循环；最后 72°C延伸 IOmin0
[0038]回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1699bp，并连接到T载体上，按照热激法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经菌落PCR筛选获得阳性克隆后，挑取单克隆摇菌液提质粒，用PstI (上游)和BamHI (下游)进行双酶切验证。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsWII，其核酸序列如序列图1所示。
[0039]实施例2、植物表达载体的构建和农杆菌的转化[0040]将实施例1获得的TA克隆中提取质粒，用PstI (上游)和BamHI (下游)双酶切，回收启动子OsWIl片段。同时PstI和BamHI线性化处理回收pCAMBIA1391，将上述的两个片段用T4连接酶进行连接，得到启动子OsWIl与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-0sWIl (如图1所示)，利用冻融法将该植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105,提取阳性质粒，用 PstI 和 BamHI 进行酶切验证。
[0041]实施例3、利用启动子OsWIl驱动Gus报告基因在水稻中表达
[0042]步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0043]将成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有I滴Tween20的50%次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4%)溶液浸泡种子40min (150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗若干遍(优选5遍以上)至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C暗培养Ild后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5d后用于农杆菌转化。农杆菌介导的遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan (Yongbo Duan,Chenguang Zhai,et al.An efficient and high-throughputprotocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannoseisomerase positive selection in Japonica rice (Oryza sativa L.)[J].Plant CellReport, 2012.D0I10.1007/s00299-012-1275_3.)等中所描述的方法。
[0044]共获得36 株 OsWI 1-1391 植株，32 株 35S-1391 植株和 28 株 Tnos_1391 植株。
[0045]步骤2、⑶S组织 化学染色
[0046]参照Jefferson (Jefferson RA et al.GUS fusion: β -Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6:3901-3907)等中所描述的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37°C染色24h。脱色时在37°C条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。
[0047]通过⑶S组织染色，检测启动子OsWIl在水稻转基因植株中对⑶S的启动活性。结果显示:在没有外界刺激性损伤或胁迫条件下OsWIl-1391转基因水稻各部位Gus染色呈白色，而与此对照的35S水稻植株染色结果为明显的蓝色(如图2A所示)；本实验在OsffIl-1391转基因水稻叶片上用铅笔书写“WOUND”字迹后，30分钟内快速染色，结果⑶S基因在水稻损伤部位表达且效果很明显(如图2B所示)，该结果表明启动子OsWIl能够驱动外源基因在创伤诱导时表达，可以用于培育抗虫品种。
【权利要求】
1.一种受机械损伤诱导表达的启动子，其特征在于:其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:1所示。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于:所述启动子是从水稻分离得到的，所述启动子还包括在高严谨条件下可与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于:所述启动子为:具有序列表SEQID NO:I所述的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列；或者，具有在所述序列表SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列中添加或取代或插入或缺失一个或一个以上的核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物。
4.一种植物表达载体,其特征在于,其包括根据权利要求1-3中任意一项所述的启动子的全部或部分序列，且所述植物表达载体被导入宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌宿主细胞。
6.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于:所述植物表达载体为将序列表SEQ ID NO:1的第I至1699位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA1391的PstI和BamHI酶切识别位点间得到的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的植物表达载体，所述植物表达载体用于导入目的植物，从而在所述目的植物中用根据权利要求1所述的DNA片段启动GUS基因的表达，其特征在于:所述目的植物为水稻。
8.根据权利要求7所述 的植物表达载体，其特征在于，所述水稻的品种为日本晴；其目的基因为⑶S基因。
9.一种转化子，其特征在于:所述转化子含有根据权利要求1-3中的任意一项所述的启动子、根据权利要求4-8中的任意一项所述的植物表达载体。
10.根据权利要求1-3中的任意一项所述的启动子、根据权利要求4-8中的任意一项所述的植物表达载体、根据权利要求9所述的转化子在构建转基因水稻中的应用。
【文档编号】C12N15/84GK103540594SQ201310205188
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年5月28日 优先权日:2013年5月28日
【发明者】杨剑波, 魏鹏程, 李春荣, 张银萍, 李 浩, 李莉 申请人:安徽省农业科学院水稻所