降解纤维素的酶及其构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及纤维素酶，具体的说是一种降解纤维素的酶及其构建和应用。降解纤维素的酶为序列表SEQ?ID?NO：1或序列表SEQ?ID?NO：2中氨基酸所示。本发明可以快速表达得到来源于热解纤维素菌的纤维素的生物转化的酶，且具有高的热稳定性、高的比酶活以及长的半衰期。
【专利说明】降解纤维素的酶及其构建和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及纤维素酶，具体的说是一种降解纤维素的酶及其构建和应用。
【背景技术】
[0002]纤维素酶在造纸、食品、饲料、纺织和能源等工业领域都有着广泛的应用价值。纤维素酶可以将纤维素降解为寡糖或单糖。纤维素酶可以分为内切纤维素酶、外切纤维素酶、和葡萄糖苷酶。内切纤维素酶又称内切-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，专一性切断纤维素的葡聚糖链中β-1.4-糖苷连键，产生低聚合度的葡聚糖或纤维寡糖。地衣聚糖酶，又称1，3-1，4-β -葡聚糖酶(EC3.2.1.73)，具有严格的底物专一性，它专一性切断1，3-1，4-β -葡聚糖中与3-0-吡喃葡萄糖基团相连接的β -1, 4-糖苷键。
[0003]I, 3-1，4-β -葡聚糖是禾本科植物细胞壁的组成成分，尤其在谷类植物(如小麦、大麦、玉米、水稻等)胚乳细胞壁中大量存在。嗜热的地衣聚糖酶，在工业生产中拥有巨大优势，比如在酿造和动物饲料工业中。在啤酒发酵过程中，禾本科植物内源的地衣聚糖酶是热失活的；因此，添加外源地衣聚糖酶可以酶解混合连键的高分子量的β_葡聚糖，从而降低发酵液的黏度，提高过滤速度及提取产率，同时也会避免啤酒成熟过程中产生沉淀。在动物饲料工业，特别是肉鸡以及猪的饲料工业生产中，添加外源地衣聚糖酶可以促进动物消化，降低卫生清洁。
[0004]木质纤维素主要由纤维素和半纤维素构成，是地球上最丰富的纤维素来源。在木质纤维素的生物转化及加工过程中，往往需要高温条件，耐高温纤维素酶可以直接用于高温条件下的生物质加工与转化。并且，由于这些耐高温的酶具有热稳定性好，半衰期长等优点，因此可以提高酶的使用效率，在生产上降低酶的用量，减少生产成本。所以，耐高温纤维素酶受到越来越广泛的重视。
[0005] 极端嗜热厌氧菌解糖热解纤维素菌属于木质纤维素降解菌，无纤维小体结构，具有游离作用的木质纤维素酶系，可作为耐热纤维素酶的产酶菌株。同时，产生耐高温纤维素酶的微生物在培养过程中具有不易受其他微生物污染、高温条件可以降低发酵液粘度而易于搅拌、底物和产物都有较高的可溶性并能降低冷却费用等优点。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种降解纤维素的酶及其构建和应用。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0008]一种降解纤维素的酶，降解纤维素的酶为序列表SEQ ID NO:1或序列表SEQ IDNO:2中氨基酸所示。
[0009]所述降解纤维素的酶为内切纤维素酶和地衣聚糖酶；其中，内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氣基酸序列为，序列表SEQ ID NO:1或序列表SEQ ID NO:2中所不。
[0010]所述内切纤维素酶和地衣聚糖酶为与序列表SEQ ID NO:1或序列表SEQ ID NO:2中所示氨基酸具有80%以上同源性的片段。
[0011]降解纤维素的酶的构建方法，将含有内切纤维素酶或地衣多糖酶基因的重组表达载体分别导入宿主细胞，表达得到序列表SEQ ID NO:1或序列表SEQ ID NO:2中所示的内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氨基酸序列。
[0012]所述作为重组表达载体的出发载体为pEASY-El、pET-22b、pET28、pET32、pQE_30、PGEX-4T-2、pBR322 或 pUC18。
[0013]降解纤维素的酶的应用，所述序列表SEQ ID NO:1或序列表SEQ ID NO:2中氨基酸所示酶可作为用于纤维素的生物转化。所述内切纤维素酶可作为外切酶。
[0014]本发明所具有的优点:本发明可以快速表达得到来源于热解纤维素菌的纤维素的生物转化的酶，且具有高的热稳定性、高的比酶活以及长的半衰期。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例提供的SDS-PAGE检测纯化蛋白的分子量大小电泳图谱。
【具体实施方式】
[0016]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0017]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0018]实施例1、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的获得及其原核表达载体的构建
[0019]该基因的克隆过程及其原核表达载体的构建过程包括以下步骤:
[0020]一、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的克隆
[0021]经过全基因组测序，内切纤维素酶设计如下引物:
[0022]C-F:ATGAAGAAAGAATGTCTTAGAGTTTTTGC
[0023]C-R:TTACATCTTTCCTGTAAGTTCTAAAATTTTG
[0024]根据地衣聚糖酶的基因，设计如下引物:
[0025]E-F:TCCAGTAACAGAGCCAAAATTCC
[0026]E-R:TGTTGCTACACACCTCCCTT
[0027]以提取的解糖热解纤维素菌，如解糖热解纤维素菌DSM8903 (德国微生物菌种保藏中心，German Collect1n of Microorganisms and Cell Cultures, DSMZ),解糖热解纤维素菌CGMCC1.5183 (中国普通微生物菌种保藏管理中心，China General Microb1logicalCulture Collect1n, CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，总基因组DNA为模板，分别以C-F与C-R ；E-F与E-R为引物对，通过PCR的方式扩增得到目的基因片段。
[0028]扩增内切纤维素酶的PCR反应体系为50μ 1，包括:细菌基因组DNA:1μ I ；10XPCR Buffer:5y I ；dNTP Mixture (各 2.5πιΜ):4μ I ;引物 C-F (20μΜ)，1μ I ;引物 C-R(20μΜ)，1μ I ；LA Taq polymerase (5U/y 1):0.5μ I ;加 ddH20 至总体系为 50 μ I。PCR 扩增条件如下:94° C预变性5min，94° C变性30sec，54° C退火45sec，72° C延伸150sec，循环30次，72° C延伸lOmin。
[0029]扩增地衣聚糖酶的PCR反应体系为50 μ 1，包括:细菌基因组DNA:1μ I ；10XPCRBuffer:5 μ I ；dNTP Mixture (各 2.5mM):4y I ;引物 E-F (20 μ M)，I μ I ;引物 E-R (20 μ Μ),I μ I ；LA Taq polymerase (5U/μ 1):0.5 μ I ;加 ddH20 至总体系为 50 μ I。PCR 扩增条件如下:94。C 预变性 5min，94。C 变性 30sec，56° C 退火 45sec，72° C 延伸 90sec，循环 30次，72° C 延伸 lOmin。
[0030]解糖热解纤维素菌来源的内切纤维素酶具有多个结构域，其催化结构域属于糖苷水解酶5家族，另外,还具有I个碳水化合物结合结构域和3个S-1ayer homology结构域。
[0031]解糖热解纤维素菌来源的地衣聚糖酶，属于糖苷水解酶5家族。
[0032]二、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因表达载体的构建
[0033]将步骤一经PCR获得的基因片段分别连接到表达载体pEASY-El中，将含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的连接产物分别转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)，经PCR和测序鉴定后将含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的阳性克隆质粒分别命名为PEASY-E1-JX030399和pEASY_El_KC958563，可用其进行内切纤维素酶和地衣聚糖酶的表达。
[0034]实施例2、内切纤维素酶和地衣聚糖酶的表达、纯化
[0035]将实施例1获得的含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的原核表达载体PEASY-E1-JX030399 和 pEASY_El_KC958563 分别转化大肠杆菌 Ε.coliBL21 (DE3)，挑选阳性单克隆在37° C下摇菌至OD6tltl为0.5后，加入ImMIPTG诱导，10小时后离心收集菌体，含有目的蛋白的菌体按Ig菌体加入4ml磷酸盐缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH8.0)，同时加入蛋白酶抑制剂，溶菌酶(10mg/ml)，细胞充分悬浮后采用超声波法破碎细胞。所得细胞破碎液经4° CUOOOOXg离心20min，所得上清经0.22 μ m滤膜过滤后即为粗酶液。
[0036]进行蛋白纯化，具体方法为=N1-NTA-Sefinose柱中的乙醇流出后，加入总体积为1ml的无菌水，每次加入2ml。加入总体积1ml的磷酸盐缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mMNaCl，pH8.0)，每次加入2ml。加入粗酶液，并穿透3次。加入磷酸缓冲液(50mMNaH2PO4, 300mM NaCl，pH8.0)，直至流出液中无蛋白。然后依次加入咪唑浓度逐渐升高的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，咪唑浓度分别为 25mM、50mM、100mM、250mM，ρΗ8.0)各5mL，并收集蛋白组分，每次收集lmL。将经纯化所得的内切纤维素酶和地衣聚糖酶进行SDS-PAGE电泳进行验证，纯化结果如图1所示，所获得的内切纤维素酶JX030399分子量为85kDa，地衣聚糖酶KC958563分子量为43.7kDa。
[0037]SEQ ID NO:1
[0038]MKKECLRVFAVFMVFTFLLSLFPFVTFAQNTAYEKDKYPHLIGNSLVKKPSVAGRLQIIKQNGRRILADQNGEPIQLRGMSTHGLQWFPQIINNNAFAALANDWGCNVIRLAMYIGEGGYATNPQVKDKVIEGIKLAIQNDMYVIVDWHVLNP⑶PNAEIYKGAKDFFKEIAQKFPNDFHIIYELCNEPNPTDPGVTNDEAGWKKVKAYAEPIIKMLRQMGNENIIIVGSPNWSQRPDFAIKDPIADDKVMYSVHFYTGTHKVDGYVFENMKMAIEAGVPVFVTEWGTSEASGDGGPYLDEADKWLEYLNANNISWVNWSLTNKNETSGAFVPYISGVSQATDLDPGSDQKWDISELSISGEYVRSRIKGIPYQPIERTLKISQDQVACAPIGQPILPSDFEDGTRQGWDWDGPSGVKGALTIEEANGSNALSWEVEYPEKKLQDGffASAPRLILRNINTTRGDCKYLCFDFYLKPKQATKGELAIFLAFAPPSLNYWAQAEDSFNIDLSNLSTLKKTPDDLYSFKISFDLDKIKEGKIIGPDTHLRDIIIVVADVNSDFKGRMYLDNVRFTNMLFEDVTPQTTGYEAISKLYSKKIVNGISTNLFGPEKAVTRAEVAAMAVRLLDLQEESYNGEFTDVSKNSWYANEVSTAYKAGIIL⑶GKYIKPEKAVTREEMAVFAMRIYRILTDEKAEATEEIAISDKNSISSWARQDVNAAISLGLMDVFTDGSFGPKAKVARAEATQIIYKILELTGKM
[0039](a)序列特征:
[0040]?长度:756
[0041]?类型:氨基酸序列
[0042]?链型:单链
[0043]?拓扑结构:线性
[0044](b)分子类型:蛋白质
[0045](C)假设:否
[0046](d)反义:否
[0047](e)最初来源:解糖热解纤维素菌
[0048]结构特点:69-325为糖苷水解酶5家族结构域，352-572为碳水化合物结合结构域，576-618,636-677,701-742 为 3 个 S-1ayer homology 结构域。
[0049]SEQ ID NO:2
[0050]SSNRAKIPEIKIASRKIPNNAALKFVKDMKIGWNLGNTFDAAFENPSFDDELLYETAWCGVKTTKQMIDTVKKAGFNTIRIPVSWHNHVTGSNFTISKRWLDRVQQVVDYAMKNKMYVIINIHHDIMPGYYYPNSQHLQTSIKYVKSIWTQVATRFKNYNDHLIFEAVNEPRLTGSRFEWWLDMNNPECRDAVEAINKLNQVFVDTVRSTGGNNVSRYLMVPGYAAAPEYVLIDEFKIPKDSSKYKNRIIISVHAYRPYNFALQAPNESGSVSEWSVNSEESRRDIDYFMDKLYDKFVSKGIPVVIGEFGARDKNGNLQSRVEFAAYYVRAARARGITCCWWDNNAFYGNGENFGLLDRKTLKWVYPEIVSAMMKYAR
[0051](a)序列特征:
[0052]?长度:378
[0053]?类型:氨基酸序列
[0054]籲链型:单链
[0055]?拓扑结构:线性
[0056](b)分子类型:蛋白质
[0057](C)假设:否
[0058](d)反义:否
[0059](e)最初来源:解糖热解纤维素菌
[0060]结构特点:54-347为糖苷水解酶5家族结构域
[0061]实施例3、酶学特性检测
[0062]按实施例2的方法纯化后分别得到内切纤维素酶和地衣聚糖酶，然后分别使用1kDa超滤管置换缓冲液(200mM乙酸-乙酸钠盐缓冲液，pH5.6)，以去除酶液中的咪唑，分别获得内切纤维素酶和地衣聚糖酶酶液。
[0063]利用上面获得内切纤维素酶和地衣聚糖酶，分别进行下述反应进行酶学特性鉴定:
[0064]以滤纸、羧甲基纤维素钠、木聚糖、微晶纤维素、地衣多糖和大麦葡聚糖为底物测定蛋白酶活时使用3.5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖的生成量。检测滤纸酶活时，150 μ I反应体系中加入5mg Whatman N0.1滤纸作为底物，其他底物的总添加量为1% (w/V)。
[0065]浓度为3.2μ g/ml的内切纤维素酶溶液和2 μ g/ml的地衣聚糖酶溶液各取50 μ 1，加入到乙酸-乙酸钠缓冲液(200mM乙酸-乙酸钠盐缓冲液，pH5.6)中，75° C反应30分钟后加入200 μ IDNS溶液，煮沸5分钟，冷却后加入650 μ I水并混匀，取200 μ I加入到酶标板中，测其在 540nm 的吸收值。以 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、lmg/ml 的葡萄糖或木糖为标准样品，以DNS法测得的吸光度值与糖浓度绘制标准曲线，根据标准曲线计算所得样品还原糖的量。
[0066]葡萄糖标准曲线:y=9.783χ+0.0009 R2=0.9978
[0067]木糖标准曲线:y=ll.406χ-0.0049 R2=0.9987
[0068]其中，X为葡萄糖或木糖浓度，mg/ml ；y为对应糖浓度下的540 nm的吸收值。
[0069]一个酶活单位定义为每分钟水解底物产生I μ mo I还原糖所需的酶量。比酶活力定义为酶活与对应蛋白量的比值。酶活反应体系如表1所示。
[0070]表1酶活反应体系
[0071]
【权利要求】
1.一种降解纤维素的酶，其特征在于:降解纤维素的酶为序列表SEQ ID N0:1或序列表SEQ ID NO: 2中氨基酸所示。
2.按权利要求1所述的降解纤维素的酶，其特征在于:所述降解纤维素的酶为内切纤维素酶和地衣聚糖酶；其中，内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氨基酸序列为，序列表SEQ IDNO:1或序列表SEQ ID NO:2中所示。
3.按权利要求1或2所述的降解纤维素的酶，其特征在于:所述内切纤维素酶和地衣聚糖酶为与序列表SEQ ID NO:1或序列表SEQ ID NO:2中所示氨基酸具有80%以上同源性的片段。
4.一种权利要求1所述的降解纤维素的酶的构建方法，其特征在于:将含有内切纤维素酶或地衣多糖酶基因的重组表达载体分别导入宿主细胞，表达得到序列表SEQ ID ΝΟ:1或序列表SEQ ID NO:2中所示的内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氨基酸序列。
5.按权利要求4所述的降解纤维素的酶的构建方法，其特征在于:所述作为重组表达载体的出发载体为 pEASY-El、pET-22b、pET28、pET32、pQE-30、pGEX-4T-2、pBR322 或 pUC18。
6.一种按权利要求1所述的降解纤维素的酶的应用，其特征在于:所述序列表SEQ IDNO:1或序列表SEQ ID NO:2中氨基酸所示酶可作为用于纤维素的生物转化。
7.按权利要求6所述的降解纤维素的酶的应用，其特征在于:所述内切纤维素酶可作为外切酶。
【文档编号】C12P19/14GK104178472SQ201310204308
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月28日 优先权日:2013年5月28日
【发明者】英瑜, 张英伟, 李福利, 孙长江, 孟冬冬, 杨雪岗 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 北京旭阳化工技术研究院有限公司