白血病融合基因的检测方法及其引物、探针和基因芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种多重RT-PCR联合基因芯片检测白血病融合基因的方法，步骤包括：1）抽提样本细胞总RNA；2）RNA特异性逆转录为cDNA；3）多重RT-PCR扩增cDNA；4）用含检测白血病融合基因的特异性探针的基因芯片检测PCR扩增产物。本发明还公开了上述方法所用的探针、引物和基因芯片。本发明采用一管巢式多重PCR，扩增样本中可能含有的特异性融合基因片段，再通过基因芯片杂交和芯片扫描图像分析，获得融合基因检测结果，如此实现了15个白血病融合基因的27种及以上不同融合形式的特异性片段的同时检测，从而大大提高了白血病融合基因的检测效率，有利于大规模的临床筛选。
【专利说明】白血病融合基因的检测方法及其引物、探针和基因芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因检测【技术领域】，特别是涉及一种多重RT-PCR联合基因芯片检测白血病融合基因的方法，以及该方法所用的特异性探针、引物和基因芯片。
【背景技术】
[0002]白血病是造血系统的一种恶性肿瘤，年发病率约为2.76人/10万人，占癌总发病数的5%，儿童及35岁以下成人恶性肿瘤死亡率排名第一位。白血病的发生发展是一个复杂的过程，往往涉及多个基因的改变，包括正常基因的突变或缺失、癌基因的异常扩增和表达以及多个基因的协同作用，加之基因本身多效性和免疫因素，最终决定肿瘤表型是否表达。
[0003]根据病程、临床表现白血病可分为两大类急性白血病和慢性白血病。根据母细胞来源又可将急性白血病分为急性淋巴性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL),急性髓性白血病(Acute Myelogenous Leukemia, AML);慢性白血病分为慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL),慢性髓性白血病(Chronic MyelogenousLeukemia, CML)0其中以急性白血病多见(70% )，各年龄均可发生，而且男性多于女性。成年人中最常见的是AML和CML，儿童中比较常见的是ALL。
[0004]部分白血病的发生可能与染色体易位所形成的融合基因有关，如染色体易位 t(9;22) (q34;qlI)BCR-ABL pl90、t(4;11) (q21;q23)MLL-AF4、t(12;21) (pl3;q22)TEL-AMLl、t(l; 19) (q23; pl3) E2A-PBX1 可能会与 ALL 相关；t(8;21) (q22; q22) AML1-ET0、inv(16)(pl3;q22)/t(16;16)(pl3;q22)CBFB-MYH11、 t(15;17)(q22;ql2)PML-RARA、t(9;ll) (p22;q23)MLL-AF9及其他一些llq23MLL基因重排可能会与AML相关。染色体异位形成的融合基因的检测，结合临床细胞形态学检查、骨髓象检查等，可进行白血病的诊断、预后和治疗方面的分析。
[0005]检测白血病染色体异常的方法主要有常规G显带染色体核型分析、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridizat1n, FISH)和 PCR 技术。常规 G 显带染色体核型分析依旧是染色体遗传病检查的重要手段，它能够可靠识别染色体数目和结构的变化，尽管在灵敏度和操作性上有局限，比如白血病细胞分裂指数低、染色体形态短小、常显带不清、隐匿型易位，使得一些结构复杂或细微的改变难以准确识别。FISH是利用荧光标记探针结合特定染色体序列，从而得以在显微镜下分析。通过探针荧光可以识别显微甚至亚显微的隐匿型结构异常和染色体数目变化。FISH相对于核型分析更能直接观察染色体异常，而且灵敏度更高，适用于分裂间期中期细胞，但其仅能对已知探针的基因位点进行分析。PCR检测急性白血病相当普遍，不仅对白血病的诊断有用，而且更适用于对白血病微小残留病灶的检测。这些方法都具有各自的优缺点，但是都不适合于多样本的白血病融合基因筛查。
[0006] 因此，出现了一些新型检测技术，尤其是基因芯片技术。基因芯片技术检测的最大优点是信息量大、操作自动化、智能化，能快速灵敏地检测出所需基因，不仅操作简便，耗费也不高，因此可能是一种很好的检测方法，应用于常规临床评估和疾病控制方面有很大的前景。国外有采用基因芯片的方法检测白血病融合基因的报道，而国内尚未有相关报道。但是国外主要的几款芯片局限性也相当明显，仅针对少数几种白血病类型的其中一种融合形式，并且涉及PCR部分都是采用多管巢式PCR，这不利于稍具规模的临床筛选。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题之一是提供一种多重RT-PCR联合基因芯片检测白血病融合基因的方法，它可以提高白血病融合基因的检测效率。
[0008]为解决上述技术问题，本发明的多重RT-PCR联合基因芯片检测白血病融合基因的方法，步骤包括:
[0009]I)抽提样本细胞总RNA ；
[0010]2)将步骤I)得到的RNA特异性逆转录为cDNA ；
[0011]3)以cDNA为模板，进行多重RT-PCR扩增反应；
[0012]4)用含有一条以上检测白血病融合基因的特异性探针的基因芯片检测PCR扩增产物中是否含有相应的白血病融合基因片段。
[0013]本发明要解决的技术问题之二是提供用于检测白血病融合基因的特异性探针，该探针的序列包括SEQ ID NO: 31~80所示的序列或其互补链,且探针5’端修饰有氨基。
[0014]本发明要解决的技术问题之三是提供用于检测白血病融合基因的基因芯片，该基因芯片含有一条以上上述检测白血病融合基因的特异性探针。
[0015]本发明要解决的技术问题之四是提供用于上述多重RT-PCR联合基因芯片检测白血病融合基因方法的RNA逆转录为cDNA的引物组合，所述引物组合具有如SEQ ID No:1~16所示的序列或其互补链。
[0016]本发明要解决的技术问题之五是提供多重RT-PCR扩增cDNA的引物组合，所述引物组合具有如SEQ ID No: 17~30所示的序列或其互补链。
[0017]本发明采用一管巢式多重PCR，扩增样本中可能含有的特异性融合基因片段，实现了 15个白血病融合基因的27种及以上不同融合形式的特异性片段的同时检测，包括:t(8;21) (q22;q22)AMLl-ET0, inv(16) (pl3q22)/t (16; 16) (pl3; q22) CBFB—MYH11，t(15; 17)(q22;q2I)PML-RARA, t(ll;17)(q23;ql2)PLZF-RARA, t(5;17)(q35;ql2)NPM1-RARA,t(9;11) (p22;q23)MLL-AF9, t(6;11)(q27;q23)MLL_AF6，t(ll;19) (q23;pl3.3)MLL_ENL，t (11 ; 19) (q23;pl3.1)MLL_ELL，t(10; 11) (pl2 ; q23) MLL-AF10, t(12;21) (pl3; q22)TEL-AMLl，t(l;19) (q23;pl3)E2A-PBX1，t(4;11) (q21;q23)MLL-AF4, del(I) (p32;p32)SIL-TALl，t (9; 22) (q34, qlI) BCR-ABL pl90，p210 和p230，后续借助基因芯片杂交和芯片扫描图像分析，就可以获得融合基因检测结果，从而大大提高了白血病融合基因的检测效率，可用于大规模的临床筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为基因芯片示意图，其中A为芯片各探针的位置图，B为整体芯片示意图。
[0019]图2为K-562细胞系的芯片杂交结果。其中A为K-562芯片杂交图；B为芯片上各探针的信号值分布图，虚线为阈值(背景信号和阴性信号平均值+3SD)。
[0020]图3为多重RT-PCR特异性凝胶电泳结果。其中，M泳道为DL2000DNA Marker ;泳道1-6为细胞系，分别为KASUM1-1、NB-4、ME-1、THP-1、K-562、REH ;泳道7-14为样本，分别为 PML-RARA S-form、MLL-AF4、MLL-ENL, MLL-ELL, MLL-AF6、MLL-AFlO, E2A-PBX1、BCR-ABLP190 ;泳道15为阴性对照；泳道16为H20。
[0021]图4为KASUM1-1细胞系不同稀释梯度的凝胶电泳图和芯片杂交结果。其中A为KASUM1-1不同稀释梯度的凝胶电泳结果；B为KASUM1-1各稀释梯度对应的芯片杂交图；C为KASUM1-1稀释梯度10_3和10_4对应各探针的信号值分布图，虚线为阈值(背景信号和阴性信号平均值+3SD)。
[0022]图5为用本发明的多重RT-PCR联合基因芯片检测部分白血病临床样本的结果。
【具体实施方式】
[0023]下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明作进一步详细说明。下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
[0024]实施例1多重RT-PCR联合基因芯片检测K-562细胞系的白血病融合基因
[0025]1.细胞总RNA抽提
[0026]取K-562细胞系，采用Trizol的方法,按照Invitrogen公司Trizol说明书提取细胞总RNA，提取的具体步骤如下:
[0027](I)取保存在Trizol里的标本400 μ 1，加入400 μ I氯仿，混匀，室温放置5分钟；
[0028](2) 15000rpm离心10分钟，离心后吸取无色上清液；
[0029](3)在上述上清中加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟；
[0030] (4) 15000rpm离心10分钟，吸弃上清；
[0031](5)在上述离心管中，加入300μ I预冷的70%乙醇，15000rpm离心5分钟，吸弃上清；室温放置10分钟，使乙醇挥发；
[0032](6)加入30-60 μ I DEPC (焦碳酸二乙酯)水混匀溶解，定量，RNA的0D26(l/0D28。在
1.8 ~2.0 ;
[0033](7)取2 μ g总RNA，用于下一步的特异性逆转录反应。
[0034]2.RNA特异性逆转录为cDNA
[0035]逆转录反应体系为25 μ 1，包括:2μ g总RNA、2.5~3pmol各种特异性逆转录引物(见表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成)、200U M-MLV逆转录酶、25U RNA酶抑制剂、ImMdNTPUOmM DTT (二硫苏糖醇)、50mM Tris-HCl (ρΗ8.3)、75mM KCl、3mM MgCl20
[0036]反应条件:RNA与逆转录引物先于70°C反应5分钟，置于冰上，混入其他反应成分于42°C孵育I小时。
[0037]表1逆转录引物序列
[0038]
【权利要求】
1.多重RT-PCR联合基因芯片检测白血病融合基因的方法，其特征在于，步骤包括: 1)抽提样本细胞总RNA； 2)将步骤I)得到的RNA特异性逆转录为cDNA； 3)以cDNA为模板，进行多重RT-PCR扩增反应； 4)用含有一条以上检测白血病融合基因的特异性探针的基因芯片检测PCR扩增产物中是否含有相应的白血病融合基因片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，RNA逆转录为cDNA的引物组合具有如SEQ ID No:1~16所示的序列或其互补链。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，进行两轮巢式多重RT-PCR扩增反应。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)，第一轮PCR体系20μ 1，包括:.1μ I cDNA、3pmol 各种 PCR 弓丨物、4pmol SP6、llmM Tris_HCl、55mM KCl、1.5mM MgCl2,15%DMS0、0.4mM dNTP 和 1.25U ExTaq HS 酶；第二轮 PCR 体系 20 μ 1，包括:1 μ I 第一轮 PCR产物、1mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、2pmol T7和2pmol标记生物素的SP6和IU ExTaq HS酶；第一轮PCR程序包括25圈循环，第二轮PCR程序包括30圈循环，每圈循环包括:95°C变性30秒，55°C退火40秒，72°C延伸I分钟；循环结束后，均在72°C延伸7分钟。
5.根据权利要求1或3或4所述的方法，其特征在于，步骤3)，PCR引物组合具有如SEQID No: 17~30所示的序列或其互补链。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)，所述特异性探针的序列包括SEQID NO:31~80所示的序列或其互补链，探针5’端修饰有氨基。
7.用于检测白血病融合基因的特异性探针，其特征在于，探针的序列包括SEQIDNO: 31~80所示的序列或其互补链，且探针5’端修饰有氨基。
8.用于检测白血病融合基因的基因芯片，其特征在于，含有一条以上权利要求7所述的探针。
9.RNA逆转录为cDNA的引物组合，其特征在于，具有如SEQ ID No:l~16所示的序列或其互补链。
10. 多重RT-PCR扩增cDNA的引物组合，其特征在于，具有如SEQID No: 17~30所示的序列或其互补链。
【文档编号】C12Q1/68GK104178557SQ201310204497
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月28日 优先权日:2013年5月28日
【发明者】熊斐斐, 张春秀, 张庆华, 熊慧 申请人:上海生物芯片有限公司, 上海华盈生物医药科技有限公司