烟草遗传转化后的抑菌培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、筛选培养、生根培养和抗性苗检测。采用本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法，培养容器和培养基都无需进行高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了烟草遗传转化后的培养环节，降低了烟草遗传转化后的培养成本；本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配制后，再加上抑菌剂即可，实用性强，推广性好；本发明的烟草遗传转化后的抑菌培养方法与常规方法比较，可以降低成本10％以上。
【专利说明】烟草遗传转化后的抑菌培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物组培方法，具体涉及一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，属生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着生物技术和分子生物学的快速发展，烟草转基因的研究越来越深入和完善。目前，转基因烟草的研究提高了烟草抵抗病害、虫害、逆境、除草剂、重金属污染的能力，在提高烟草品质和安全上也发挥了重要作用。由于烟草易于进行组织培养、容易得到再生转化烟株，作为模式植物，烟草在生物功能基因组研究中，占有举足轻重的地位。
[0003]植物组织、细胞或原生质体经遗传转化后需进行筛选，将转化子和非转化子区分开来，并将非转化子淘汰。目前对烟草转化子的筛选主要采用抗生素筛选法。即在目的基因旁边融合一个编码转化或分解某种抗生素酶的报告基因。这种报告基因表达的产物(Enzyme)可使被转化的细胞或植株能抵抗某一特定的抗生素.而非转化细胞团不具有抗性基因而在筛选培养基中死亡。
[0004]在烟草遗传转化过程中，大量的工作都集中在培养基的配制和接种上，尤其是培养基的配制。在常规的农杆菌介导烟草转基因过程中，需要添加一些能抑制农杆菌生长的抗生素，这些抗生素不耐高温高压，只能通过过滤灭菌后才能加入培养基中。常规情况下是，培养容器和培养基经过高温高压灭菌后，冷却到40°C -50°C，再加入经过滤灭菌后的抗生素，然后分装到培养容器中，冷却凝固后备用。以上工作程序繁锁、工作量大。如果能找到一种无需高温高压、又能抑制农杆菌生长、同时还不影响烟草正常生长的培养基，就可以解决以上问题。因此，本发明将简化烟草由农杆菌介导后的筛选培养环节，人工操作的效率将大幅度提高，从而大幅度降低人工成本。不仅如此，由于培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，后期的组织培养过程的污染问题还能得到有效控制。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法。
[0006]本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0007]本发明的一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、筛选培养、生根培养、抗性苗检测，其特征在于:
[0008]1、抑菌剂的配制:称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解后，加20%的次氯酸钠溶液100ml，加20g山梨酸钾，再加2g乳酸链球菌素，用蒸馏水定容到200ml，即为抑菌剂；
[0009]2.培养容器消毒:将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为1%。~2%。( V / V )的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
[0010]3.农杆菌转化:选择携带hyg基因的植物表达载体，导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中，制成转化菌液,用转化菌液侵染烟草叶片；[0011 ] 4.培养基配制:共培养培养基为MS+0.5mg/L ΒΑ+100 μ mol/L乙酰丁香酮+0.4~
0.5ml/L抑菌剂+20.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8 ;筛选培养基为MS+0.1~0.5mg/L6-BA+30mg/L 潮霉素 +0.4 ~0.5ml/L 抑菌剂 +300mg/L Timentin+30.0g/L 蔗糖 +3.5g/L琼脂粉，pH5.8 ;生根培养基为 1/2MS+0.4 ~0.5ml/L 抑菌剂 +300mg/L Timentin+30g/L 蔗糖+3.5g/L琼脂粉，ρΗ5.8 ;所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-ΒΑ，指6-苄氨基嘌吟；配制培养基时，先不加抑菌剂，按各培养基配方配齐其他原料后，定容、加热至琼脂粉完全溶解，等温度降到40~50°C时，再按各培养基配方添加抑菌剂，用lmol/L的NaOH或lmol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒处理的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
[0012]5.共培养:将侵染后的材料从转化菌液中取出，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至共培养培养基中，在22°C黑暗条件下共培养3d ；
[0013]6.筛选培养:将共培养后的材料移至筛选培养基中，培养室温度为28°C,光照12h，光照强度为12001x ;15d后部分愈伤组织分化出小芽并形成小苗；选取高于2cm的小苗转生根培养；
[0014]7.生根培养:将筛选培养获得高于2cm的小苗，分成单株接种至生根培养基中，20~30d可形 成完整植株，即抑菌培养苗；培养室温度为28°C，光照12h，光照强度为15001x ；
[0015]8.抗性苗检测:取移栽成活的抑菌培养苗的叶片材料，进行DNA提取、PCR检测，呈现阳性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。
[0016]本发明的应用效果:
[0017]1、本发明培养基中不同抑菌剂浓度对农杆菌侵染后愈伤组织污染的影响:我们设计了 7种抑菌剂浓度的对比试验，结果如表1所示。试验结果表明，以抑菌剂浓度0.4~
1.0ml/L为佳，当抑菌剂浓度为0.4ml/L以上时，农杆菌污染率均为O ;抑菌剂浓度大于
1.0ml/L时，愈伤组织长势变弱，部分愈伤组织出现褐化现象。
[0018]表1本发明筛选培养基中不同抑菌剂浓度对农杆菌侵染后愈伤组织污染的影响
[0019]
【权利要求】
1.一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、农杆菌转化、培养基配制、共培养、筛选培养、生根培养、抗性苗检测，其特征在于: (1)抑菌剂的配制:称2.4g的富马酸二甲酯用20ml无水乙醇溶解后，加20%的次氯酸钠溶液100ml，加20g山梨酸钾，再加2g乳酸链球菌素，用蒸馏水定容到200ml ； (2)培养容器消毒:将培养瓶及瓶盖在抑菌剂与水的体积比为1%。~2%。的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用； (3)农杆菌转化:选择携带hyg基因的植物表达载体,导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105中，制成转化菌液，用转化菌液侵染烟草叶片； (4)培养基配制:共培养培养基为MS+0.5mg/L ΒΑ+100 μ mol/L乙酰丁香酮+0.4~ 0.5ml/L抑菌剂+20.0g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8 ;筛选培养基为MS+0.1~0.5mg/L6-BA+30mg/L 潮霉素 +0.4 ~0.5ml/L 抑菌剂 +300mg/L Timentin+30.0g/L 蔗糖 +3.5g/L琼脂粉，pH5.8 ;生根培养基为 1/2MS+0.4 ~0.5ml/L 抑菌剂 +300mg/L Timentin+30g/L 蔗糖+3.5g/L琼脂粉，ρΗ5.8 ;所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-ΒΑ，指6-苄氨基嘌吟；配制培养基时，先不加抑菌剂，按各培养基配方配齐其他原料后，定容、加热至琼脂粉完全溶解，等温度降到40~50°C时，再按各培养基配方添加抑菌剂，用lmol/L的NaOH或lmol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒处理的培养容器中，封口，冷却凝固后备用； (5)共培养:将侵染后的材料从转化菌液中取出，用灭菌滤纸吸干表面的转化菌液，然后转至共培养培养基中，在22°C黑暗条件下共培养3d ； (6)筛选培养:将共培养后的材料移至筛选培养基中，培养室温度为28°C,光照12h,光照强度为12001x ;15d后部分愈伤组织分化出小芽并形成小苗；选取高于2cm的小苗转生根培养； (7)生根培养:将筛选培养获得高于2cm的小苗，分成单株接种至生根培养基中，20~30d可形成完整植株，即抑菌培养苗；培养室温度为28°C，光照12h，光照强度为15001x ； (8)抗性苗检测:取移栽成活的抑菌培养苗的叶片材料，进行DNA提取、PCR检测，呈现阳性的植株为成功导入HYG基因的转基因植株。
2.根据权利要求1所述的一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，其特征在于共培养的培养基为 MS+0.5mg/L ΒΑ+100 μ mol/L 乙酰丁香酮 +0.5ml/L 抑菌剂 +20.0g/L 蔗糖 +3.5g/L琼脂粉，ρΗ5.8。
3.根据权利要求1所述的一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，其特征在于筛选培养的培养基为 MS+0.2mg/L6-BA+30mg/L 潮霉素 +0.5ml/L 抑菌剂 +300mg/L Timentin+30.0g/L鹿糖+3.5g/L琼脂粉，pH5.8。
4.根据权利要求1所述的一种烟草遗传转化后的抑菌培养方法，其特征在于生根培养的培养基为 1/2MS+0.5ml/L抑菌剂+300mg/L Timentin+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂粉，ρΗ5.8。
【文档编号】A01H5/00GK103952438SQ201410184021
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月4日 优先权日:2014年5月4日
【发明者】许莉萍, 林庆良, 高世武, 陈晓英 申请人:福建农林大学