百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法
【专利摘要】本发明公开了一种百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，包括如下步骤：1）胚性愈伤组织诱导：以无菌条件下培养的百合鳞片作为外植体，诱导培养出胚性愈伤组织。2）胚性愈伤组织的选择性继代培养：选择由胚性愈伤组织产生的新生球形体细胞胚胎作为继代材料。3）球形体细胞胚胎的继代培养：球形体细胞胚胎接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行继代培养，直到继代培养的体细胞胚胎中未检测出病毒为止。本发明操作方法简单，由普通实验员对拟脱毒材料进行多次继代即可，对试验条件和操作人员的要求不高。通过体细胞胚胎的快速繁殖，可彻底脱去病毒，脱毒效果较好。
【专利说明】百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及百合脱毒育种【技术领域】，具体涉及一种百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法。
【背景技术】
[0002]百合作为吉祥之花，素有百年好合之意而深受人们喜爱。香水百合为百合中的女王，因其香气宜人，更为鲜切花中之精品，送人之首选。近年来，百合切花是继世界五大切花(月季、香石竹、菊花、唐菖蒲、非洲菊)之后的一支新秀，也是目前世界上最受欢迎的切花之一。然而，百合种植过程中最大的问题就是百合的品种退化问题——病毒是其主因之一。在百合中，常见的病毒有黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)、郁金香碎锦病毒(Tulip Breaking Virus, TBV)、百合无症病毒(Lily Symptomless Virus, LSV)等十余种，这些病毒可通过蚜虫的叮咬或土壤线虫进行传播。受病毒感染的百合表现出生长势减弱，植株矮化，提早开花，花朵畸形、变小、花色减退，早春叶片出现花叶、皱缩、扭曲、顶斑、坏死等现象，严重影响了百合鲜切花的产量和品质，为百合鲜切花的生产、销售，尤其是出口带来很大的威胁。百合病毒在其组织体内的扩散速度非常快，百合一旦感染病毒，则终身带毒，长期受害；再加上蚜虫等昆虫介体传播，病毒在各植株之间迅速扩散侵染，扩大了危害范围。对于百合病毒，目前尚难以采用化学药剂或生物制剂进行直接有效的防治。因此，防止百合感染病毒病的应对策略是采用脱毒培养技术获得脱毒苗，隔离繁殖、生产健康种球。
[0003]目前，百合的脱毒方法主要有:茎尖培养、热处理和抗病毒药剂法等三种。茎尖培养脱毒原理是植物分生组织新产生的细胞不具有病毒，植物体内病毒只能通过维管束系统移动，分生组织中没有维管束，病毒只能靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。在利用茎尖培养进行百合脱毒时，只有在剥取大小为0.3^0.5mm的茎尖或茎尖分生组织时，才有可能获得脱毒苗。由于剥离的茎尖小，需要在解剖镜下操作，操作难度大，而且接种后微小茎尖由于受到剥离时的物理性损伤，难以成活，脱毒率也较低。热处理是依据在高温下病毒出现钝化，其复制明显减弱或不再繁殖。一般来说，温度越高、持续时间越长，脱毒效果越好，但同时植株的成活率也越低。抗病毒药剂法的作用原理是抗病毒药剂在三鳞酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构的形成。抗病毒抑制剂在早期破坏RNA聚合酶的形成，在后期破坏病毒外壳蛋白的形成，阻止病毒的繁殖，达到脱毒目的。热处理和抗病毒药剂法一般都需要与茎尖培养结合使用。茎尖培养操作复杂、接种后茎尖容易发生褐化，成活率低。因此，传统脱毒方法需要对试验材料进行物理或化学的抑制性处理，脱毒成功与否与人工切离的分生组织大小有关，受环境和人为因素的影响较大，存在脱毒不彻底的问题。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，简化了脱毒流程，减小操作人员和培养环境对脱毒结果的影响。[0005]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，包括如下步骤:
I)胚性愈伤组织诱导:以无菌条件下培养的百合鳞片作为外植体，接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，暗光培养28天，诱导培养出胚性愈伤组织。
[0006]2)胚性愈伤组织的筛选:对步骤I)中得到的胚性愈伤组织进行筛选，选择出新产生的球形体细胞胚胎作为继代材料。
[0007]3)球形体细胞胚胎的继代培养:将步骤2)中筛选出来的球形体细胞胚胎接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行第一代继代培养，温度保持在24±2°C，暗光培养14天，得到第一代继代培养体细胞胚胎。
[0008]在第一代继代培养体细胞胚胎中筛选出新产生的球形体细胞胚胎，将其接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行第二代继代培养，温度保持在24±2°C，暗光培养14天，得到第二代继 代培养体细胞胚胎；如此循环，直到继代培养的体细胞胚胎中未检测出病毒为止。
[0009]其中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组成为:MS培养基+ PIC r8mg.1+琼月旨78.171+蔗糖3(^.171，卩!1值为5.8。
[0010]所述固体增殖培养基的组成为:MS培养基+PIC I~4mg.L—1+琼脂 7g.L—1+蔗糖 3(^.?ΛΡΗ 值为 5.8。
[0011]所述液体增殖培养基的组成为:MS培养基+PIC r4mg.L—1+蔗糖30g.L—1，PH值为 5.8。
[0012]进一步，所述液体增殖培养基添加在生物反应器中，生物反应器的气流量保持在SOmlvmirf10
[0013]更进一步，所述球形体细胞胚胎的筛选采用孔径为0.5-1.0 mm的筛子进行筛选。
[0014]相对于现有技术，本发明具有如下有益效果:
1、本发明操作方法简单。在脱毒过程中，无需对试验材料进行高温或病毒唑的繁琐的前处理，无需切取体积为0.3^0.5 _微小分生组织等特定操作，由普通实验员对试验材料进行多次继代即可，对试验条件和操作人员的要求不高。通过体细胞胚胎的快速增殖，可彻底脱去病毒，脱毒效果较好。
[0015]2、缩短培养时间。传统方法中0.3~0.5 mm的拟脱毒材料必须经过长期培养方可达到病毒检测最少样本量，本发明体细胞胚胎发生途径脱毒方法通过体细胞胚胎的快速增殖在相对较短的时间内即可满足病毒检测最少量样本量的要求。
[0016]3、提高脱毒效率。传统脱毒方法的脱毒结果无保障，受人为和环境影响较大。每个分生组织切割的大小不同导致其脱毒效果不同，因此需要对每个分生组织进行病毒检测，如病毒检测发现仍含有病毒，则该分生组织无用，长期培养工作无效。体细胞胚胎脱毒方法中，可对不同继代次数的体细胞胚胎进行检测，如未脱去病毒，可继续进行增殖培养直至脱去病毒。如脱去病毒，亦可进行增殖培养，短期内实现脱毒材料的大量繁殖，不浪费材料。
[0017]4、脱毒效果好。传统脱毒方法受人为和环境影响较大，这取决于茎尖分生组织切取的大小，切取得大些，病毒不能彻底脱除；切取得小些，茎尖无法成活。往往存在脱去一种病毒，其他种病毒未脱去的现象。体细胞胚胎脱毒受人为和环境影响较小，脱毒效果较好，可同时脱去多种病毒。【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为胚性愈伤组织在含有PIC2 mg -L-1的液体培养条件下胚性愈伤组织的生长表现。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明。
[0021]实施例一:
百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，包括如下步骤:
I)胚性愈伤组织诱导:以无菌条件下培养的百合鳞片作为外植体，接种于胚性愈伤组织诱导固体培养基上，培养28天，诱导培养出胚性愈伤组织。
[0022]其中，胚性愈伤组织诱导培养基的组成为:MS培养基+PIC r3mg.L-1+琼月旨78*171+蔗糖3(^*171，？!1值为5.8。PIC为植物生长调节剂中的一种，其英文全称为Picloram,中文名称为毒莠定。
[0023]胚性愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基中加入7g.L-1琼脂和30g.L-1蔗糖，保持PH值为5.8，并加入以下配方的物质:
【权利要求】
1.百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)胚性愈伤组织诱导:以无菌条件下培养的百合鳞片作为外植体，接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，暗光培养28天，诱导培养出胚性愈伤组织； 2)胚性愈伤组织的筛选:对步骤I)中得到的胚性愈伤组织进行筛选，选择出球形体细胞胚胎作为继代材料； 3)球形体细胞胚胎的继代培养:将步骤2)中筛选出来的球形体细胞胚胎接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行第一代继代培养，温度保持在24±2°C，暗光培养14天，得到第一代继代培养体细胞胚胎； 在第一代继代培养体细胞胚胎中筛选出新产生的球形体细胞胚胎，将其接种于固体增殖培养基或液体增殖培养基中进行第二代继代培养，温度保持在24±2°C，暗光培养14天，得到第二代继代培养体细胞胚胎；如此循环，直到继代培养的体细胞胚胎中未检测出病毒为止； 其中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组成为:MS培养基+ PIC r8mg.L-1+琼脂7g.L-1+ 蔗糖 30g.L-1，PH 值为 5.8 ； 所述固体增殖培养基的组成为:MS培养基+PIC r4mg.L—1+琼脂 7g.L—1+蔗糖30g.ΙΛΡΗ 值为 5.8 ； 所述液体增殖培养基的组成为:MS培养基+PIC r4mg.L—1+蔗糖30g.L—1，PH值为5.8。
2.根据权利要求1所述的百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，其特征在于，所述液体增殖培养基添加在生物反应器中，生物反应器的气流量保持在ZOmPmin'
3.根据权利要求2所述的百合通过体细胞胚胎发生途径脱毒的方法，其特征在于，所述球形体细胞胚胎的筛选采用孔径为0.5-1.0 mm的筛子进行筛选。
【文档编号】A01H4/00GK103947554SQ201410183779
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月4日 优先权日:2014年5月4日
【发明者】李玲莉, 孔立生, 刘华敏 申请人:重庆市城口县景之源苗木发展有限公司, 孔立生