专利名称：一种茶籽饼粕的生物脱毒方法
技术领域：
本发明涉及一种茶籽饼粕的微生物和酶相结合的生物脱毒方法。
背景技术：
油茶是我国南方丘陵地区一种重要的油料作物，占全国木本食用油料作物的80% 以上。茶籽饼，又称茶粕，别名茶麸、茶枯，茶籽饼。呈紫褐色颗粒，是野山茶油果实榨油后剩下的残渣。茶籽经榨油后的饼粕中还含有大量的淀粉、蛋白质、粗脂肪、可溶性糖和茶皂素等，可以再提取利用。我国油茶林面积约400万公顷，是世界上油茶品种最多、分布最广、产量最多的国家。据统计，我国采摘茶园面积约为100万公顷，我国近年来年产油茶茶籽约55万吨，油茶茶籽含油率为沈% 39%，按机榨得油率70%计算，油茶饼粕年均产量约40 万吨。我国油茶林主要分布在湖南、江西、广西三省，三省油茶茶籽产量占全国的80%以上。我国油茶茶籽粕和茶叶茶籽粕产量约为70万吨，由此可见，我国潜在的可利用茶粕资源十分丰富。茶油茶饼粕一般含有7%的粗脂肪，149Γ15%的粗蛋白质，33%的粗纤维，40%多的糖类，茶皂素约129Γ18%，是潜在的可利用的茶籽残渣资源。因而，开发利用茶籽粕具有较高的经济效益。目前，茶籽主要采用传统的压榨法榨油工艺制油，所生产的茶粕中茶皂素、单宁等抗营养因子含量过高，不适宜直接用于动物饲料的生产，大部分被用作清塘剂、 肥料、燃料，少量用于茶皂素的提取。同时，因茶籽饼粕中含有109Γ15%溶血性茶皂素，而茶皂素的存在使饲料味苦且辛辣，并对鱼类等水生动物有很强的毒性，因此，限制了其在饲料工业中的应用。但是，如果茶粕去除了有毒物质茶皂素，其营养价值可与米糠媲美，且经过微生物发酵后，可得到较高的菌体蛋白，不仅可以提高茶粕的利用价值，且可通过降解菌发酵使之成为一种较好的饲料资源。目前对茶粕的研究报道，国内外大多专注于活性物质茶皂素的提取，而把茶粕发酵成饲料的报道较为少见。例如，专利KR20110090215公开了一种具有确保清净性能佳、起泡好、对皮肤刺激性小、保湿效果好的液体洗涤剂组合物，其中包括59Γ40%阴离子表面活性剂茶皂素，0. 59Γ20%非离子表面活性剂或两性表面活性剂，0. 01°/Γ10%乳酸和皂素，剩余的为水量。专利W02011113221公开了一种由70% 80%柠檬油精、2% 10%茶皂素、1% 10% 卵磷脂、29TlO%柠檬醛和0. 59Tl%柠檬酸组成的洗涤剂，该洗涤剂不损坏汽车、涂料膜和家电玻璃。专利CN1148598公开了一种提取精制茶皂素的方法，得到98%以上的固体茶皂素。美国专利US6007822公开了一种包含山茶属植物三萜皂苷的动物饲料组合物在人类和动物中具有提高免疫功能，增强抗菌和抗病毒活性，抗突变，抗氧化和清除自由基。关于茶籽饼粕脱毒的报道更少，如黄良柏先生的“脱毒茶粕残留茶皂素含量的测定方法比较”一文描述了一种茶籽饼粕脱毒的工艺，将脱脂茶粕浸提，固液分离，蒸发浓缩，喷雾干燥，分别获得饲料渣和茶皂素。该方法实质是提取茶皂素，附带性获得饲料渣，属于物理脱毒。由此看来，物理、化学溶剂浸出茶皂素法虽然可以将皂素降低，但将残渣用作饲料时，会导致大量营养成分流失，而且大大增加饲料成本。油茶籽壳中糠醛含量是所有农作物中最高的， 约为19%，接近或超过现今用于制糠醛的如玉米芯(19. 00% )、棉籽(17. 50% )和稻谷壳(12. 00%)等主要原料。因此，可以用油茶籽壳提取糠醛，油茶籽壳的糠醛理论产量约为 47%。目前，在湖南、江西、浙江和福建等省已有企业利用油茶籽壳生产糠醛，其得率为3% 10%。此外，油茶籽壳中含有的30%左右的多缩戊糖，是制取木糖醇的理想原料。如果能将油茶籽壳生产出高纯度的木糖醇，是高效利用油茶籽壳的良好思路。总之，在动物饲料生产中科学合理地使用茶粕发酵产品有利于缓解我国饲料资源紧缺的局面。。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种茶籽饼粕的生物脱毒方法，该方法工艺简单、成本和能耗低、适应性强、易于批量生产、脱毒效果稳定， 为微生物与酶学方法相结合的茶籽饼粕脱毒方法。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案，其特征为“一种茶籽饼粕的生物脱毒方法”，该方法包括以下几个步骤
(1)制备液体菌种将德氏乳杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于乳酸杆菌液体培养基中，在37、1°C厌氧培养6 12 h，使该种子培养液中菌体浓度分别达到10『109 cfu/mL ；将枯草芽孢杆菌1株分别接种一环斜面菌种细胞于液体扩大肉汤营养培养基中，在35 37°C， 200 r/min^300 r/min条件下，摇床振荡培养12 24 h，使该种子培养液中菌体浓度分别达到10『109 cfu/mL ；将1株酵母菌属酵母接种一环斜面菌种细胞于酵母液体培养基中，在 3(T34°C，150 r/min^250 r/min条件下，摇床振荡培养M 36 h，使该种子培养液中菌体浓度达到10『109 cfu/mL，将该三种种子培养液按1:1:1混合即得液体菌种，作为固体菌种的生产菌种；
(2)制备固体菌种按重量百分比取麦麸4.09Γ6. 0%、葡萄糖1. 09Γ2. 0%、磷酸氢二钾 1. 09Γ1. 5%、氯化镁0. 29Π). 3%、及茶籽饼粕50% 60%混勻，调节含水重量为35% 40%，制成固体菌种培养基，12(Tl3(TC灭菌3(T40 min，冷却至35 40°C，按1. 0% 1. 5%接种重量接入液体菌种，于35、0°C恒温堆积培养4飞天后于45飞5°C干燥制得；
⑶茶籽饼粕发酵脱毒按重量百分比取茶籽饼粕709Γ80%、麦麸5 9Γ10%、淀粉 1. 0°/Γ . 5%、硫酸铵0. 39ΓΟ. 5%、磷酸氢二钾1. 09Γ1. 5%、及浓度为200(T4000 U/g的酸性纤维素酶0. 059Γ0. 1%混勻后，再调节含水重量为209Γ30%，制成茶籽饼粕脱毒发酵培养基；再将发明内容步骤⑵制得的固体菌种以29Γ4%的接种重量接种到该茶籽饼粕脱毒发酵培养基中，混合均勻，堆积成高0.7 1.0 mX宽10.0 20.0 mX长20. 0 30. 0 m的茶籽饼粕堆陇，上面覆盖塑料或稻草，避雨，堆陇中心温度5(T70°C下发酵，当发酵7 10天、茶籽饼粕堆陇中心温度达60°C以上时，用人工或机械翻堆一次，当发酵1(Γ15天后，茶籽饼粕堆陇中心温度低于60°C以下时，干燥后即得脱毒茶籽饼粕。上述发明内容步骤⑴中的乳酸杆菌液体培养基为蛋白陈5. (Γ10. 0 g、牛肉膏 5. 0^10.0 g、酵母粉4.0 6.0 g、葡萄糖10.0 20.0 g、吐温80 0. 5 1. 0 mL、磷酸氢二钾 1·0 2·0 g、乙酸钠3.0 5.0 g、柠檬酸三铵2. (Γ5. 0 g、氯化镁0.2 0.4 g、硫酸锰0. 05 g、 蒸馏水1000 mL的比例混勻后，在115°C下灭菌15 20 min，冷却至室温而成。上述发明内容步骤⑴中的液体扩大肉汤营养培养基为葡萄糖10.(T20.0 g、蛋白胨5·0 8·0 g、3.0 5.0 g牛肉膏、及氯化钠3. (Γ5. 0 g、水1000 mL的比例混勻，在0. IMPa 压力下灭菌25 30 min，冷却至室温而成。
上述发明内容步骤⑴中的酵母液体培养基葡萄糖30. (Γ50. 0 g、酵母浸膏3. (Γ5. 0 g、氯化钠2. 0 3· 0 g、及磷酸二氢钾5. 0 8· 0 g、水1000 mL的比例混勻，在0. IMPa压力下灭菌25 30 min，冷却至室温而成。本发明中用到的菌种均为现有技术，德氏乳杆菌(L^tohciBM)可以选用已公开的保藏号分别为CGMCC 1.2142、CGMCC 1. 2625、或CGMCC 1. 2132的菌株、或使用实验室自行保藏的菌株；枯草芽孢杆菌OfeciBm subtilis)可以选用已公开的保藏号分别为CGMCC2492、CGMCC3877的菌株或购买商业化菌株，例如购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号分别为AS1. 108，或使用实验室自行保藏的菌株；酵母属酵母菌(5^4<3了0耶^>5):可以选用已公开的06110 1147、CGMCC 0702、或 CGMCC 0133 的菌株、或使用实验室自行保藏的菌株。本发明提及的斜面菌种细胞中的菌种分别是与本发明中用到的德氏乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌相对应的，即德氏乳杆菌所接种的斜面菌种细胞中的菌种为德氏乳杆菌，其它类推。与现有技术相比，本发明具有以下优点
(1)在本发明方法的处理过程中，选用芽孢杆菌作为主要发酵脱毒菌种。因为发酵脱毒菌种的芽孢具有极强的抗逆性，选用的菌种在生长过程中不仅可以降低茶籽饼粕中的茶皂素，还可产生蛋白酶，一般水解茶籽粕中蛋白类物质，产生游离氨基酸，乳酸杆菌和酵母菌在茶籽饼粕发酵中后期厌氧环境中能发挥益生菌的作用，可改善原有茶籽饼粕适口性不好的问题；
⑵本发明方法使用的酸性纤维素酶，能有效地水解茶籽饼粕中茶皂素的糖苷键，从而协同微生物进一步发酵茶籽饼粕，达到脱毒的目的；
(3)本发明是农产品下脚料废弃物深度利用，具有生产工艺简单、无三废、投资小、易于规模化生产等特点；
⑷以我国现有工艺生产的未脱毒茶籽饼粕为原料，采用本发明方法进行脱毒，其茶皂素含量可降低90%以上；产品蛋白质含量达到159Γ20%，提高5%以上；游离氨基酸含量大于 5%，提高了 25%以上；还原糖含量达5%以上，可直接作为饲料原料使用。
具体实施例方式
以下实施例对本发明作进一步说明。实施例1
所用的菌种为德氏乳酸杆菌1株、枯草芽孢杆菌1株、酵母属酵母菌1株。其步骤为 (1)液体菌种制备取蛋白陈5.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖10.0 g、吐温 80 0.5 mL、磷酸氢二钾1.0 g、乙酸钠3.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、氯化镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、蒸馏水1000 mL的比例混勻后，在115°C下灭菌15min，组成乳酸杆菌液体培养基，冷却至室温后，再接入培养成熟的斜面菌种，分别于41°C厌氧摇床培养12 h;取葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、牛肉膏3.0 g、及氯化钠3.0 g、水1000 mL的比例混勻，在0.1 MPa压力下灭菌 25 min，冷却至室温后接入培养的枯草杆菌斜面菌种，于35°C、200 r/min下，摇床培养Mh ； 取葡萄糖50. 0 g、酵母浸膏3.0 g、氯化钠2.0 g、及磷酸二氢钾5.0 g、水1000 mL的比例混勻，在0.1 MI^a压力下灭菌25 min，冷却至室温组成酵母菌培养基，冷却至室温后接种酵母菌，于30°C、150 r/min下，摇床培养M h ；取上述三种种子培养液按1 1 1混合得液体菌种，作为固体菌种的生产菌种；
⑵固体菌种制备取5 kg麦麸、2 kg淀粉、1.5 kg硫酸铵、200 kg茶籽饼粕混勻，用自来水调节含水重量为40%，制成茶籽饼粕发酵脱毒培养基，125°C灭菌30 min，冷却至37°C 后，按重量接入1. 5%的液体菌种(各菌种的比例为1:1:1)，37°C恒温培养7天，50°C条件下干燥，作为发酵脱毒固体菌种；
(3)取茶籽饼粕20000 kg、麦麸1000 kg、淀粉250 kg、硫酸铵0. 3%、磷酸氢二钾1. 0%、 及浓度为2000 U/g的酸性纤维素酶0. 1%混勻后，再调节含水重量为30%，制成茶籽饼粕脱毒发酵培养基；再将本实施案例步骤⑵制得的固体菌种以2、的接种重量接种到该茶籽饼粕脱毒发酵培养基中，混合均勻，堆积成高1. OmX宽10. OX长20. Om的茶籽饼粕堆陇，上面覆盖塑料或稻草，避雨，50°C下发酵，当发酵8天后、茶籽饼粕堆陇中心温度达60°C，用人工或机械翻堆一次，当发酵12天后，茶籽饼粕堆陇中心温度低于60°C，干燥后即得脱毒茶籽饼粕。取样分析茶籽饼粕中茶皂素含量为0.9%，脱毒率为92.2%，蛋白质含量18. 4% (提高5. 8%)，游离氨基酸含量5. 7% (提高30. 4%)。实施例2:
所用的菌种为德氏乳酸杆菌1株、枯草芽孢杆菌1株、酵母属酵母菌1株。其步骤为 (1)液体菌种制备取蛋白陈7.0 g、牛肉膏7.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖10.0 g、吐温 80 0. 8 mL、磷酸氢二钾1. 0 g、乙酸钠3. 0 g、柠檬酸三铵2. 0g、氯化镁0. 3 g、硫酸锰0. 06 g、蒸馏水1000 mL的比例混勻后，在115°C下灭菌20 min，组成乳酸杆菌液体培养基，冷却至室温后，再接入培养成熟的斜面菌种，分别于43°C厌氧摇床培养8 h;取葡萄糖15.0 g、 蛋白胨6.0 g、牛肉膏4.0 g、及氯化钠4.0 g、水1000 mL的比例混勻，在0.1 MPa压力下灭菌25 min，冷却至室温后接入培养的枯草杆菌斜面菌种，于37°C、200 r/min下，摇床培养 20 h;取葡萄糖60. 0 g、酵母浸膏4.0 g、氯化钠2. 5 g、及磷酸二氢钾6.0 g、水1000 mL的比例混勻，在0.1 MI^a压力下灭菌25 min，冷却至室温组成酵母菌培养基，冷却至室温后接种酵母菌，于32°C、150 r/min下，摇床培养20 h ；取上述三种种子培养液按1 1 1混合得液体菌种，作为固体菌种的生产菌种；
⑵固体菌种制备取15 kg麦麸、5 kg淀粉、3kg硫酸铵、300 kg茶籽饼粕混勻，用自来水调节含水重量为35%，制成茶籽饼粕发酵脱毒培养基，125°C灭菌30 min，冷却至37°C后， 按重量接入1%的液体菌种(各菌种的比例为1:1:1)，35°C恒温培养8天，50°C条件下干燥， 作为发酵脱毒固体菌种；
(3)取茶籽饼粕30000 kg、麦麸2000 kg、淀粉320 kg、硫酸铵0. 4%、磷酸氢二钾1. 5%、 及浓度为3000 U/g的酸性纤维素酶0. 1%混勻后，再调节含水重量为25%，制成茶籽饼粕脱毒发酵培养基；再将本实施案例步骤⑵制得的固体菌种以1%的接种重量接种到该茶籽饼粕脱毒发酵培养基中，混合均勻，堆积成高0. 8 mX宽15. OmX长27. Om的茶籽饼粕堆陇，上面覆盖塑料或稻草，避雨，50°C下发酵，当发酵7天后、茶籽饼粕堆陇中心温度达60°C，用人工或机械翻堆一次，当发酵15天后，茶籽饼粕堆陇中心温度低于60°C，干燥后即得脱毒茶籽饼粕。取样分析茶籽饼粕中茶皂素含量为1.0%，脱毒率为91.2%，蛋白质含量20. 1% (提高6. 5%)，游离氨基酸含量5. 3% (提高29. 3%)。实施例3:
所用的菌种为德氏乳酸杆菌1株、枯草芽孢杆菌1株、酵母属酵母菌1株。其步骤为(1)液体菌种制备取蛋白陈10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉3.0 g、葡萄糖12.0 g、吐温 80 0.5 mL、磷酸氢二钾1.0 g、乙酸钠3.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、氯化镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、蒸馏水1000 mL的比例混勻后，在115°C下灭菌15 min，组成乳酸杆菌液体培养基，冷却至室温后，后接入培养成熟的斜面菌种，分别于40°C厌氧摇床培养10 h;取葡萄糖12.0 g、 蛋白胨5.0 g、牛肉膏3.0 g、及氯化钠3.0 g、水1000 mL的比例混勻，在0.1 MPa压力下灭菌25 min，冷却至室温后接入培养的枯草杆菌斜面菌种，于35°C、200 r/min下，摇床培养 24 h;取葡萄糖60. 0 g、酵母浸膏4.0 g、氯化钠2.0 g、及磷酸二氢钾5.0 g、水1000 mL的比例混勻，在0.1 MI^a压力下灭菌25 min，冷却至室温组成酵母菌培养基，冷却至室温后，于 30°C、160 r/min下，摇床培养20 h ；取上述三种种子培养液按1 1 1混合得液体菌种，作为固体菌种的生产菌种；
⑵固体菌种制备取8 kg麦麸、1 kg淀粉、1.0 kg硫酸铵、150 kg茶籽饼粕混勻，用自来水调节含水重量为30%，制成茶籽饼粕发酵脱毒培养基，125°C灭菌25 min，冷却至37°C 后，按重量接入1. 5%的液体菌种(各菌种的比例为1:1:1)，37°C恒温培养6天，50°C条件下干燥，作为发酵脱毒固体菌种；
⑶取茶籽饼粕10000 kg、麦麸800 kg、淀粉100 kg、硫酸铵0.4%、磷酸氢二钾1.0%、及浓度为4000 U/g的酸性纤维素酶0. 1%混勻后，再调节含水重量为20%，制成茶籽饼粕脱毒发酵培养基；再将本实施案例步骤⑵制得的固体菌种以2、的接种重量接种到该茶籽饼粕脱毒发酵培养基中，混合均勻，堆积成高1. OmX宽12. OX长20. Om的茶籽饼粕堆陇，上面覆盖塑料或稻草，避雨，50°C下发酵，当发酵7天后、茶籽饼粕堆陇中心温度达60°C，用人工或机械翻堆一次，当发酵14天后，茶籽饼粕堆陇中心温度低于60°C，干燥后即得脱毒茶籽饼粕。取样分析茶籽饼粕中茶皂素含量为0. 85%，脱毒率为93. 3%，蛋白质含量17. 8%(提高 5. 1%)，游离氨基酸含量5. 0% (提高28. 5%)。
权利要求
1.一种茶籽饼粕的生物脱毒方法，其特征包括以下几个步骤(1)制备液体菌种将德氏乳杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于乳酸杆菌液体培养基中，在37、1°C厌氧培养6 12 h，使该种子培养液中菌体浓度分别达到1(Τ109 cfu/mL ；将枯草芽孢杆菌1株分别接种一环斜面菌种细胞于液体扩大肉汤营养培养基中，在35 37°C， 200 r/min^300 r/min条件下，摇床振荡培养12 24 h，使该种子培养液中菌体浓度分别达到10『109CfU/mL ；将1株酵母菌属酵母接种一环斜面菌种细胞于酵母液体培养基中，在 3(T34°C，150 r/min^250 r/min条件下，摇床振荡培养M 36 h，使该种子培养液中菌体浓度达到10『109cfU/mL，将该三种种子培养液按1:1:1混合即得液体菌种，作为固体菌种的生产菌种；(2)制备固体菌种按重量百分比取麦麸4.09Γ6. 0%、葡萄糖1. 09Γ2. 0%、磷酸氢二钾 1. 09Γ1. 5%、氯化镁0. 29Π). 3%、及茶籽饼粕50% 60%混勻，调节含水重量为35% 40%，制成固体菌种培养基，12(Tl3(TC灭菌3(T40 min，冷却至35 40°C，按1. 0% 1. 5%接种重量接入液体菌种，于35、0°C恒温堆积培养4飞天后于45飞5°C干燥制得；⑶茶籽饼粕发酵脱毒按重量百分比取茶籽饼粕709Γ80%、麦麸5 9Γ10%、淀粉 1. 0°/Γ . 5%、硫酸铵0. 39ΓΟ. 5%、磷酸氢二钾1. 09Γ1. 5%、及浓度为200(T4000 U/g的酸性纤维素酶0. 059Γ0. 1%混勻，调节含水重量为209Γ30%，制成茶籽饼粕脱毒发酵培养基；再将本项权利要求步骤⑵制得的固体菌种以29Γ4%的接种重量接种到该茶籽饼粕脱毒发酵培养基中，混合均勻，堆积成高0.7 1.0 mX宽10.0 20.0 mX长20. 0 30. 0 m的茶籽饼粕堆陇，上面覆盖塑料或稻草，避雨，堆陇中心温度5(T70°C下发酵，当发酵7 10天、茶籽饼粕堆陇中心温度达60°C以上时，用人工或机械翻堆一次，当发酵1(Γ15天后，茶籽饼粕堆陇中心温度低于60°C以下时，干燥后即得脱毒茶籽饼粕。
2.根据权利要求1所述的茶籽饼粕的生物脱毒方法，所述步骤⑴中的乳酸杆菌液体培养基为蛋白陈5.0 10.0 g、牛肉膏5.0 10.0 g、酵母粉4.0 6.0 g、葡萄糖10. 0 20. 0 g、吐温80为0. 5 1. 0 mL、磷酸氢二钾1. 0 2· 0 g、乙酸钠3. 0 5· 0 g、柠檬酸三铵2. 0 5· 0 g、 氯化镁0. 2^0. 4 g、硫酸锰0. 05 g、蒸馏水1000 mL的比例混勻后，在0. 1 MPa压力下灭菌 15 20 min，冷却至室温而成。
3.根据权利要求1所述的茶籽饼粕的生物脱毒方法，所述步骤⑴中的液体扩大肉汤营养培养基为葡萄糖10. (Γ20. 0 g、蛋白胨5.0 8.0 g、牛肉膏3.0 5.0 g、氯化钠3.0 5.0 g、 水1000 mL的比例混勻，在0.1 MPa压力下灭菌25 30 min，冷却至室温而成。
4.根据权利要求1所述的茶籽饼粕的生物脱毒方法，所述步骤⑴中的酵母液体培养基葡萄糖30.0 50.0 g、酵母浸膏3.0 5.0 g、氯化钠2.0 3.0 g、及磷酸二氢钾5. 0 8. 0 g、水 1000 mL的比例混勻，在0.1 MPa压力下灭菌25 30 min，冷却至室温而成。
全文摘要
一种茶籽饼粕的生物脱毒方法，该方法是在粉碎的茶籽饼粕中加入磷酸氢二钾、氯化镁、2000~4000U/g的酸性纤维素酶、及微生物菌种等，搅拌均匀后，在40~50℃下利用微生物和酸性纤维素酶的共同作用10~15天，然后烘干粉碎即为产品；所得产品茶皂素含量低于饲料规定的安全指标，其营养价值高于未经发酵的茶籽饼粕，产品蛋白质含量达到15%~20%，提高了5%以上；游离氨基酸含量高于5%，提高了25%以上；还原糖含量高于5%，皂素含量低于1.0%，脱毒率大于90%；可直接作为饲料原料使用，较好地解决了现有技术存在的茶籽饼粕中毒问题，是一种工艺简单、效果好、能提供达到饲料标准要求的无毒茶籽饼粕的生产方法。
文档编号A23L1/015GK102488087SQ201110441650
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者吴永尧, 李海翔, 林元山 申请人:林元山