梅山猪高产抗病新品系的培育方法

梅山猪高产抗病新品系的培育方法
【专利摘要】本发明涉及梅山猪高产抗病新品系的培育方法，其特点是：对梅山猪核心群进行F18大肠杆菌感染，根据表型鉴定结果组建梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群；对基础群中F18大肠杆菌抗性型群体细胞因子（IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α和IFN-γ）进行浓度测定；通过建立主成分综合评价模型，根据不同个体的综合得分来对一般抗病力进行综合指数选育，同时对繁殖性能等性状进行检测和选择，组建第一个世代；用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现育种目标，建立新品系核心群。新品系猪具有抗断奶仔猪腹泻和水肿病、抗应激、适应环境能力强、肉质优、饲料报酬高、产仔数多的优点。
【专利说明】梅山猪高产抗病新品系的培育方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及梅山猪高产抗病新品系的培育方法，属于动物遗传育种与繁殖、分子 生物学【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 我国养猪业具有强大的肉猪生产系统，也就是常说的"我国是养猪大国"，但是在 "金字塔"繁育体系中顶端核心种猪资源长期依赖进口。在很长的一段时间内，对于种猪，我 国都处于"引种一维持一退化一再引种"的恶性循环，在加入WT0后，这一状况更严重。总 之，明显的种猪引进依赖对我国养猪业的持久发展十分不利，从国家的长远利益考虑，此种 现象不宜再发展下去。面对这一状况，迫使我们必须变依赖进口为创造性地进行选育，寻求 适合我国国情、在国际种猪市场占有一席之地的特色种猪品系和繁育体系。
[0003] 猪病是养猪生产的大敌。育种实践中，单纯追求高产通常导致猪的抵抗力降低， 一些原有疾病未根除，又出现了新的疾病，严重制约了养猪业的发展。疾病可导致畜禽产品 低劣、产量下降，同时它还严重降低遗传进展，给养猪业造成的直接经济损失约占总产值的 12%?15%，因此，做好疾病预防是发展养猪业的前提。
[0004] 产肠毒素性大肠杆菌（ETEC)是初生和断奶仔猪腹泻和水肿病最常见和最重要的 病原菌，是养猪业中的重要威胁因素 （Boldin B，2008)，其中F18大肠杆菌又是目前在养猪 业中发生最普遍、危害最大的大肠杆菌病原之一（Van den Broeck W et al，2000)。尽管 当前对仔猪腹泻采取的一些预防性措施（如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物以及 亚单位疫苗接种等），在一定程度上减少了该病的发生，但并没有从根本上消除断奶仔猪腹 泻的发生与流行，大肠杆菌性仔猪腹泻仍然是引起仔猪高发病率和死亡率最主要的原因之 一。为进一步保障我国养猪业步入高产、高效和优质的新时期，非抗生素治疗、广谱、直接、 高效和全新的仔猪细菌性腹泻防治措施的研发是目前最迫切的攻关难题。从长远来看，采 用现代遗传学方法，提高猪对大肠杆菌的抗病力，进行抗病育种，才是治本的办法。
[0005] 为了获得更多的疾病防治方法，必须清楚地了解动物的免疫抗病系统及致病机 理。疾病的发生一般是动物的遗传背景与其所处环境之间相互作用的结果。若某一动物在 遗传上对一种疾病易感，则环境条件（包括常规疾病防治方法）可能仅对疾病的防治部分 有效。一个可取代疾病常规防治法是针对提高家畜抗病力进行选择性育种。遗传性抗病力 包括了机体免疫抗病系统及其相互作用的许多方面，因而极为复杂。目前从根本上开展猪 的抗性遗传机制研究，进行抗病育种，已引起了国内外学者的高度重视。
[0006] 病原体在传染过程中，会遇到3道防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制 和特异性防御机制。当个体受到病原体侵染时，会调动这3方面的防御机制加以抵抗。猪是 否发病取决于侵染和防御机能相互作用的结果，防御机能加强的猪便表现出自然抗病力。 抗病力按遗传基础的不同可分为特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指猪对某种特定 疾病或病原体的抗性，这种抗性主要受一个主基因位点控制，同时也可不同程度地受其它 位点（包括调控子）及环境因素影响。现有的研究结果表明，特殊抗病力的内在机理在于 宿主体内存在或缺少某种分子或其变体，这不仅能决定异体识别及特异性异体反应，还能 决定病原体的特殊附着力，病原体进入体内后在体内增殖，能否导致宿主发病。一般抗病力 不限于抗某一种病原体，它受多基因和环境的综合影响，病原体的抗原性差异对一般抗病 力影响极小，甚至根本没有影响，这种抗病力体现了机体对疾病的整体防御功能。
[0007] 研究发现，不少猪病的发病机制与猪本身的遗传背景有关，即猪可能对一些疾病 存在完全或部分抗性。广义上讲，任何疾病的发生都是遗传与环境因素共同作用的结果，几 乎所有疾病都与遗传有关。狭义上讲，遗传病是由于生殖细胞或受精卵中遗传物质发生了 结构或功能上的变异所致。因此，从长远角度来看，采用遗传学方法从遗传基础上提高猪对 疾病的一般抗性具有治本的功效。而一般抗性是维持猪在不良环境中生存和生产的必要条 件，因此培育具有一般抗性的猪种成为育种领域的主要课题之一。
[0008] 衡量动物机体对疾病抵抗能力大小的指标有很多，细胞因子（cytokines，CK)是 其中一项重要指标，其是由机体免疫细胞分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子多肽， 具有免疫调节、抗肿瘤、促进造血、参与炎症反应以及神经内分泌效应等多种生物学功能； 在动物体内，绝大多数细胞因子含量较低，其主要作用是提高动物的免疫功能。据报道，免 疫指标可代表机体的免疫功能状态，从而间接反映机体的抗病能力，因此可通过免疫指标 的测定来了解动物的一般抗病力。然而迄今为止，尚未建立对梅山猪一般抗病力的评价体 系，因而无法从众多的细胞因子测定指标中选择最佳数量指标，形成一套适用的综合评价 指标体系。
[0009] -般抗病力多个测量指标中需要构建一套适用的综合评价指标体系，在该体系中 指标模型的构建是关键问题之一，主成分分析法（principal component analysis, PCA)正 好科学地解决了这一问题。PCA是研究如何将多指标问题转化为较少的综合指标的一种重 要统计方法，能使问题变得比较简单、直观，近来已成为多指标综合评价和权重系数确定的 重要方法。
[0010] 梅山猪作为我省优良地方品种太湖猪的一个品系，以高繁殖力和肉质鲜美而著称 于世。作为世界产崽冠军的梅山猪，是遗传资源中经济杂交和培育新品种的优良亲本。国外 多个国家自上世纪八十年代起，先后从我国引进优良地方猪种一梅山猪，作为育种资源，改 良提高自身猪种的产仔与肉质性状等，并已取得显著成效。同样，在国内，以中梅山猪为代 表，以优良地方猪种为基础培育中国瘦肉型猪种也取得较大进展。梅山猪的优良特性主要 是高繁殖性能和优良的肉质，但是也存在瘦肉率不高、抗病力下降等问题和不足，尤其是近 年来仔猪腹泻水肿病及气喘病等疾病的发病率较高，直接和间接导致母猪受胎率、产活仔 数和断奶仔猪成活率下降，使梅山猪公认的高繁殖力不能得到充分发挥。本发明在组建梅 山猪抗大肠杆菌病群体的基础上，测定不同发育时期干扰素、白介素等细胞因子及主要抗 体水平等免疫应答指标，在分析免疫应答指标及其与生长发育关系的基础上，确定免疫应 答和一般抗病力的评价指标并纳入常规选种选育体系，筛选有效的一般抗病力分子标记并 进行育种效率评估。选留一般抗病力强的个体，同时对繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品 质等性状进行检测和选择，组建第一个世代；用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法， 经过4-5个世代，逐步实现既定育种目标，建立新品系核心群。有望降低气喘病等呼吸道疾 病的发病率，培育具有抗大肠杆菌病和一般抗病力强、生长速度快、适于相对粗放条件下饲 养的梅山猪高产抗病新品系，从根本上为实现梅山猪健康高效养殖奠定基础，取得可观的 社会效益、经济效益和社会效益。


【发明内容】

[0011] 本发明的目的是提供一种梅山猪中科学可行的抗F18大肠杆菌病新品系的培育 方法，新品系猪具有抗断奶仔猪腹泻和水肿病、抗应激、适应环境能力强、肉质优、饲料报酬 高、产仔数多的优点，该方法还可以为国内其他地方猪品种的抗病育种和新品系选育提供 指导。
[0012] 本发明的技术方案是：对梅山猪核心群采用饲料添加的方法进行F18大肠杆菌感 染试验,根据表型鉴定的结果，组建梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群；同时基于主成分 分析构建一般抗病力的评估模型，对梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群进行一般抗病力 综合指数选育，结合生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状进行检测和选择，运用最佳线性无 偏预测（Best Linear Unbiased Prediction, BLUP)模型进行种猪的遗传评估。运用群体 继代选育和分子标记辅助选择的方法，通过4-5个世代的培育，最终培育出梅山猪高产抗 病新品系。
[0013] 所述的新品系培育方法包括以下步骤：
[0014] (1)对梅山猪核心群采用饲料添加的方法进行F18大肠杆菌感染试验，根据表型 鉴定结果，组建梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群；
[0015] (2)对基础群中F18大肠杆菌抗性型群体细胞因子白介素2(IL-2)、白介素 6(IL_6)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL_12)、肿瘤坏死因子α (TNF-α )和γ干扰素 (IFN-γ)进行浓度测定；通过建立主成分综合评价模型，根据不同个体的综合得分来对梅 山猪一般抗病力进行综合指数选育，同时对繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状 进行检测和选择，组建第一个世代；
[0016] (3)用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定 育种目标，建立新品系核心群。
[0017] 所述抗F18大肠杆囷病新品系猪的性能指标为：
[0018] 抗病力：抗断奶仔猪腹泻和水肿病，并具有很强的抗应激能力和抗逆性。
[0019] 繁殖性能：新品系猪总产仔数达到21头以上，核心群经产母猪产仔在14. 5头以 上。
[0020] 生长性能：20kg?75kg育肥期间，平均日增重450g以上，料重比3.6 :1。
[0021] 屠宰性能及肉质：胴体屠宰率72%以上，瘦肉率，45%以上，肉质优良，肌内脂肪 6. 0%以上。
[0022] 本发明的有益技术效果主要体现在：
[0023] (1)从猪抗逆性入手开展抗病育种，提高猪的免疫应答能力和一般抗病力，可以更 有效地解决猪很多疾病如呼吸道疾病与环境相互作用的问题，从根本上降低诸多疾病的发 病率。
[0024] (2)传统的新品系培育技术，主要基于表型性状进行选择，存在周期长、遗传进展 缓慢等缺点，本发明将免疫学原理、分子育种技术及常规育种手段相结合，提高梅山猪的特 殊抗病力（抗F18大肠杆菌引起的断奶仔猪腹泻）和一般抗病力，尤其是先前的一般抗病 力评估还仅局限于研究少数几个参数进行判断，无法综合、准确地判断一般抗病力的强弱。 本发明则很好地解决了如何从众多指标中选择最佳数量指标的难题，最终达到科学评价猪 个体一般抗病力的目的。
[0025] (3)本发明培育的新品系猪不仅抗断奶仔猪腹泻和水肿病，还具有瘦肉率高、肉质 优、饲料报酬高、产仔数多、抗应激、适应环境能力强的优点，可以直接用于优质瘦肉型商品 猪生产，还可以组成杂交配套系的母系；本发明还可以为其他地方猪品种的抗病育种和新 品系选育提供技术支持和指导。

【具体实施方式】
[0026] 实施例：
[0027](一）对梅山猪核心群采用饲料添加的方法进行F18大肠杆菌（从中国兽医药品 监察所购买）感染试验，根据表型鉴定的结果，组建梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群；
[0028] 1)细菌培养将F18大肠杆菌的单个菌落接种到3?5mL的LB培养基中，并37°C 振荡培养过夜（约18h)，次日将细菌用PBS反复离心洗涤3次，并将大肠杆菌菌株与PBS按 照1:20的比例进行稀释，调整细菌浓度为4. 6 X 108CFU/L。
[0029] 2)饲料配制按照断奶仔猪的营养需求饲喂含有21. 7%粗蛋白的颗粒饲料，饲 料中不含有任何抗生素和微生态制剂，配制不含有抗生素和微生态制剂的饲料，主要是为 了避免饲料中抗生素等对试验产生的干扰和影响。
[0030] 3)E. coli F18菌株和轮状病毒的检测攻毒之前，检测所有个体粪便中是否含有 F18大肠杆菌和轮状病毒，采用棉花棒在肛门处采集少量粪便，每个肛拭子中加入800uL高 压双蒸水混匀，取其中的200uL到另外一个EP管中，取20uL涂布麦康凯平板，其余120°C 变性lOmin，12000r/minX lmin，取上清做DNA模板，用于检测F18大肠杆菌；剩余的600uL 反复冻融2次，用试剂盒提取RNA，反转成cDNA，-20°C冻存用于检测轮状病毒。粪便DNA的 PCR扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，只有粪便中均未发现F18大肠杆菌和轮状病毒 时，排除了攻毒个体自身携带轮状病毒和大肠杆菌导致腹泻的可能性，才可以进行下一步 的攻毒试验，。
[0031] F18 大肠杆菌检测：PCR 反应体系：模板 DNA5. 0μ L，10XBuffer5. 0μ L，MgCl22uL， dNTP混合物3. 0μ L，F18大肠杆菌（Sta和Stx2)上下游引物各1. 25μ L(引物见表1)，Taq 酶（5U/y L) 1. 0μ L，加双蒸水补足至50μ L。PCR扩增条件为：94°C预变性2min，94°C变性 30s，50°C退火45s，72°C延伸90s，共进行30个循环，然后72°C后延伸lOmin，最后放入4°C 保存备用。PCR扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0032] 轮状病毒检测：PCR 反应体系：模板 cDNA3. 0 μ L，10XBuffer2. 5 μ L，MgCl2l. OuL， dNTP混合物1. 0 μ L，RAV-VP7引物各1. 0 μ L (引物见表1)，Taq酶（5U/ μ L) 0· 5 μ L，加双蒸 水补足至25μ L。PCR扩增条件为：95°C预变性5min，95°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C 延伸lmin，共进行30个循环，然后72°C后延伸lOmin，最后放入4°C保存备用。PCR扩增产 物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0033] 表1 F18大肠杆菌和轮状病毒检测引物
[0034]

【权利要求】
1. 一种梅山猪高产抗病新品系的培育方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 采用饲料添加的方法对梅山猪核心群进行F18大肠杆菌感染试验，根据表型鉴定 的结果，组建梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群； (2) 对基础群中F18大肠杆菌抗性型群体细胞因子白介素2、白介素6、白介素10、白介 素12、肿瘤坏死因子α和γ干扰素进行浓度测定；通过建立主成分综合评价模型，根据不 同个体的综合得分来对梅山猪一般抗病力进行综合指数选育，同时对繁殖性能、生长速度、 瘦肉率、胴体品质性状进行检测和选择，组建第一个世代； (3) 用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定育种 目标，建立新品系核心群。
2. 根据权利要求1所述的梅山猪高产抗病新品系的培育方法，其特征在于： 步骤（1)所述的梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群的组建方法具体是： 1) 选取的健康的35日龄梅山仔猪自由饮水，按照断奶仔猪的营养需求饲喂含有21. 7% 粗蛋白的颗粒饲料，饲料中不含有任何抗生素和微生态制剂；每天喂料4次，一次饲料计量 50 g，连续饲喂3天； 2) 采用饲料添加的方法进行F18大肠杆菌感染试验，将F18大肠杆菌菌株与饲料混合 饲喂，每头猪每天接受F18菌株的平均剂量是4. 6 X 108 CFU，连续进行10天，每天对猪的粪 便采集进行检测，以"正常"、"糊状"、"水样"对粪便的粘稠度进行记录； 3) 对感染试验后个体的大肠杆菌F18抗性/易感性进行进一步验证，结合常规选种的 标准，选留感染试验后表型一直为"正常"的个体，并且在相同饲养管理环境条件下按家系 分开饲养，组建梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群。
3. 根据权利要求1所述的梅山猪高产抗病新品系的培育方法，其特征在于：步骤（2)第 一世代的组建具体是： 1) 将梅山猪F18大肠杆菌抗病育种基础群继续一般抗病力性状的检测和选择；对F18 大肠杆菌抗病育种基础群梅山仔猪在35日龄时采集前腔静脉血，获得血清样品后利用猪 多细胞因子检测试剂盒对细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α和IFN-γ进行浓度 测定；将上述6个指标数据转化为标准化Z分值，代入下述综合选择指数公式，计算每个个 体或者家系的综合选择指数值/7, /7值越大表示该个体或者家系的一般抗病力越强； /}=0·323Ζχ7+ 0.267?^ 0.318Zxj+ 0·379Ζα+ 0.285ZA+ 0·012Ζ々，其中 Ζχ7、Ζχ2、 2^、2^、2^、2&分别为11^-2、11^-6、11^-10、11^-12、正^〇和正^￥测定值的标准化数据； 结合其他性状的育种目标选留值高的个体； 2) 对一般抗病力强的个体实行五阶段选择，运用BLUP模型进行种猪的遗传评估：测定 的主要项目有生长速度、活体膘厚、体尺、体型外貌评定、繁殖性能，同时剔除出现遗传损征 的个体；通过测定和评定，选留符合育种目标的个体； 第一次选择阶段：仔公猪在25日龄前初选，仔母猪在40日龄左右，体重约8 - 9Kg ; 第二次选择阶段：公猪在体重约17 -18 Kg，进入测定站前选留，母猪在种猪出售前体 重约20- 25 Kg之间进行，选中母猪进入测定站； 第三次选择阶段：公猪达50 Kg，母猪达60 Kg体重时进行； 第四次选择阶段：公猪体重达80 Kg时； 第五次选择阶段：公母猪年龄一岁半，有2胎产仔成绩； 3)公母猪根据综合指数值及体质外貌鉴定选留，公猪留种率约30%，母猪留种率约 50%，即综合指数在平均数以上部分；个别数量性状表现很好，得分在单项总分的90%以上 种猪也可入选。
4.根据权利要求1所述的梅山猪高产抗病新品系的培育方法，其特征在于：步骤（3)群 体继代选育的方法是： 1) 运用BLUP模型进行种猪的遗传评估，结合在梅山猪群体中使用的高繁殖力ESR分子 标记信息，进行育种值估计； 2) 世代选育，不断稳定遗传性和主要性状的一致性，每个世代选留公猪20头，母猪100 头；用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定育种目 标。
【文档编号】A01K67/027GK104186423SQ201410480181
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】包文斌, 赵乔辉, 朱世平, 吴圣龙, 朱国强, 孙寿永, 华金第 申请人:扬州大学