链霉菌菌株及其防治番茄枯萎病联合应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了链霉菌菌株及其防治番茄枯萎病联合应用，涉及微生物【技术领域】，本发明所述的放线菌是从山东省泰安市郊区盐碱地采集的10~15cm深层土样中采用放线菌分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定，命名为龟裂链霉菌（ Streptomyces rimosus ）M527和球孢链霉菌（ Streptomyces globisporus ）M927， S.rimosus 2013已于2013年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2013270； S.globisporus M927已于2013年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2013709。两菌株均能发酵产生对番茄枯萎病菌（ Fusarium oxysporum f.sp.LycopersiciSnyderetHansen）具有较强拮抗作用的活性物质，可用于防治番茄枯萎病等植物病害。两菌株的发酵产物重量百分比为4:1—7:3混合时，生防效果较两种代谢产物分别作为单一制剂使用时尤为显著。CCTCC NO：M 20132702013.06.19CCTCC NO：M 20137092013.12.25
【专利说明】链霉菌菌株及其防治番茄枯萎病联合应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，涉及两株生防放线菌一龟裂链霉菌M527和球孢链 霉菌M927代谢产物在防治番茄枯萎病中的应用。 技术背景
[0002] 番爺應Mill)是一种世界性的蔬菜作物，也是我国的主 栽蔬菜之一。番爺枯萎病是番爺的主要病害之一，该病害传染性强，严重影响了番爺的产量 和品质。
[0003] 番爺枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌专化型f.sp. LycopersiciSnyderetHansen，番爺枯萎病菌的专化性极强，只危害番爺。病源为半知菌 亚门、镰孢属的番茄萎蔫病菌。病菌在土壤中越冬，笠年随雨水、灌溉水及土壤传播。病原菌 从幼根或伤口浸入，在植株维管柬中扩展蔓延，堵塞导管，并产生有毒的番爺凋萎素，随输 导组织扩展，致使维管束变褐、失去输导功能，从而引起植株枯萎。针对番茄枯萎病害目前 主要采用化学农药杀灭病原菌，这些药剂的大量长期使用不仅使得番茄植株产生抗药性， 农药残留也会影响番茄的品质，给农产品安全带来隐患。因此，生物防治引起人们的重视。 目前有研究表明植物提取物中的活性成分对有一定的抑制作用，但植物有效成分提取操作 步骤多，效率低；目前的研究主要集中在利用微生物的代谢产物防治番茄枯萎病菌，其中铜 绿假单胞菌、镰刀菌作为拮抗微生物具有潜在的致病性，分离筛选芽孢杆菌虽有广泛报道， 但菌株本身稳定性差，防治效果并不显著。放线菌因其易产生抗病原菌成分等活性物质，已 成为生物防治植物病虫害的主要资源和生物农药开发的主要来源。土壤是放线菌栖居的重 要场所，从土壤中获得具有高效抗菌活性的放线菌是目前世界范围内研制开发新医药和新 农药必不可少的基础工作，但从土壤中筛选拮抗放线菌对番茄枯萎病原菌的生物防治报道 还并不多见。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于通过筛选提供对番茄枯萎病 原菌具有较强拮抗作用的两株生防菌一菌龟裂链霉菌M527和球孢链霉菌M927。
[0005] 本发明的第二个目的是通过不同的比例混合两株生防链霉菌的发酵产物，提供上 述菌龟裂链霉菌和球孢链霉菌在番茄枯萎病防治中的联合应用。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术手段得以实现： 本发明首先以在山东省泰安市郊区盐碱地采集的土样为研究对象，经分离、发酵培养、 发酵液提取以及对植物病原真菌抑制活性检测等步骤获得两株对番茄枯萎病原菌具有较 强抑菌活性的链霉菌；其中一株经微生物分类学鉴定并命名为龟裂链霉菌 该菌已于2013年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2013270;另一株经微生物分类学鉴定并命名为球孢链霉菌(泣 ^7Mi5T7〇r^s)M927,该菌已于2013年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为CCTCCNO:M2013709。中国典型培养物保藏中心地址：武汉市武昌珞珈山，邮编： 430072。
[0007] 本发明所述的龟裂链霉菌M527在PDA固体培养基上培 养时气丝白色至灰色，基丝乳脂色。显微观察发现rifflosysM527孢子丝初 旋至螺旋形。孢子长圆形至柱形，表面光滑。本发明所述的5'&6?^0?_7<^? >5/^?05^>5]/[527， 发酵液经提取浓缩后可对番茄枯萎病病原真菌具有较强的抑制作用。
[0008] 本发明所述的球抱链霉菌M927在PDA固体培养基 上培养时气丝暗結草色，基丝无色。显微观察发现孢子丝 长枝条状，孢子卵圆形，表面光滑。本发明所述的M927，发酵液 经提取浓缩后可对番茄枯萎病病原真菌具有较强的抑制作用。
[0009] 所述的番茄枯萎病原菌拮抗放线菌的筛选和抑菌活性检测过程如下所述： (1) 从野外（山东省泰安市郊区盐碱地）采集土样，并进行晾干处理； (2) 从土样中分离放线菌，并利用番茄枯萎病原菌作为指示菌筛选具有拮抗作用的放 线菌； (3) 将长出的放线菌分别点种于混有番茄枯萎病原菌孢子悬液（1X106 的 PDA平板上，通过观察抑菌圈大小，挑选抑菌圈较明显的菌株进入复筛； (4) 将选取的菌株进行发酵培养，发酵结束后离心收集发酵液，用乙酸乙酯萃取，真空 减压浓缩后制备浸膏，用于番茄枯萎病的防效检测，由此筛选出防治效果较好的两株拮抗 微生物一龟裂链霉菌M527和球孢链霉菌M927。
[0010] 本发明的有益效果： 本发明从土壤中分离筛选出对番茄枯萎病原菌具有较强抑制作用的两株拮抗链霉菌M527 和M927,两株菌株的发酵产物按 重量百分比为4:1一7:3时时制成的混合制剂可用于番茄枯萎病病害的防治，为生物农药 的开发提供了新的途径。
【具体实施方式】
[0011] 实施例 1 : (5'tr<9/7tc?_7c<9>sM527 和 M927 的 分离与筛选） 按以下步骤进行： (1) 材料及培养基：用于分离龟裂链霉菌M527和球孢链霉菌M927的材料为采自山东 省泰安市郊区盐碱地的土样，用于放线菌分离所用的培养基为含重铬酸钾的PDA培养基 (配方为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加蒸馏水1L煮沸半小时，纱布过滤，再加20g葡 糖糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121°C，高压灭菌 20min;使用时添加重铬酸钾20iig?ml/1;以下试验中放线菌常规培养所用培养基均以蒸 馏水配置）； (2) 分离纯化：将上述新鲜采集的土样装于采样袋中，带回实验室后分装晾干一周左 右；瞭干后的土样每份称取5g，分别加入含有45ml无菌水的锥形瓶中，锥形瓶中加入3-5 粒无菌的玻璃珠，28°C摇床培养2h，使土样中的微生物充分进入水中；吸取培养后的样品 以10倍梯度稀释，分别取10' 10' 1(T4浓度稀释液200yL，涂布于含20yg?ml/1重铬酸 钾的PDA固体平板上，28°C培养72h;将平板上长出的放线菌分别挑取单菌落，接种于含重 铬酸钾的新鲜PDA平板上，28°C± 1°C条件下纯化培养72h，获得纯化后的放线菌； (3)初筛和复筛：将分离得到的放线菌分别点种于混有番茄枯萎病原菌孢子悬液 (1X106cfu^!/1)的PDA固体平板上，通过观察抑菌圈大小，挑选抑菌圈较明显的菌株进行 复筛； 复筛采用平板对峙法对初筛的放线菌进行抑菌活性测定，具体方法为：在PDA固体平 板上分别对称放置一个直径4_的放线菌菌饼和一个番茄枯萎病原菌菌饼，置培养箱中 28°C±1°C条件下培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直 径。抑菌率通过以下公式计算： 抑菌率（%) = (1-处理菌落生长半径/对照菌落生长半径）X100 根据结果获得抑菌活性较好的两株放线菌，对番茄枯萎病原菌的抑菌率均在75%以 上。综合16SrDNA序列的比对结果、形态特征、培养特征和生理生化特性，其中一株菌株鉴 定为龟裂链霉菌，命名为龟裂链霉菌M527 (泣另一株菌株鉴定 为球孢链霉菌，命名为球孢链霉菌M927 (Stre/?(officesM927);保存。
[0012] (4) M527 和 M929 抑菌 活性测定：将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的rifflosysM527和 M929 按 5% (v/v)分别接入发酵培养基中，28°C±1°C条件 下，180r/min，摇床培养120h后，7800r/min离心7min,用滤纸过滤得发酵滤液。取经 0. 22ym膜过滤的发酵上清液lmL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅 速混勻，冷却后在每个培养基平面中央分别放1个直径为4mm的番爺枯萎病菌 應f.sp.LycopersiciSnyderetHansen)菌饼，置培养箱中 28°C培养72h，以无 菌水处理作为对照，重复3次；待对照菌落直径长至平板直径的2/3左右时统计结果，采用 十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率： 菌丝生长抑制率（％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径）/(对照菌落直径-4)]X100 测定结果表明M527 和 M927 代 谢产物对番茄枯萎病菌菌丝生长抑制率分别为77. 1%和75.0%。
[0013]实概執2 ?人Streptomyces rimosus W>TI私Streptomyces globisporus WyXI发 酵代谢产物的制备方法） 按以下步骤进行： (1) 菌种的活化培养：将保存的 M527 和 M927孢子悬液（1X108cfu?ml/1)接入马铃薯葡萄糖液体培养基，在 28°C±1°C条件下培养48h供发酵使用； (2)发酵培养：发酵培养基每1 L中含有黄豆饼粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g， 葡萄糖5g，蛋白胨5g，CoCl2 0. 02g，牛肉膏5g，CaC03 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶装 发酵培养液50mL;配制后121°C灭菌20min，将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的 Streptomyces rimosus W、Tl私Streptomyces globisporus WyXl /n)後}\发 酵培养基中，在28°C±1°C条件下，摇床转速180r/min，发酵培养84h; (3) 发酵物提取：发酵完毕，离心，弃菌体，收集发酵液于分液漏斗中，将加入等体积的 乙酸乙酯萃取，充分混匀，待分层后，取上层液相至圆底烧瓶，利用旋转蒸发仪浓缩后获得 萃取物浸膏，用于测定抑菌活性。
[0014] 以下实施例 3 和试验例中所述的Stre/?(officesM527 和Stre/?(offices M927代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量/体积 百分比。
[0015]实"魏？> :{Streptomyces rimosus取Streptomyces globisporus W>2] W 谢产物对番茄枯萎病菌的抑制作用） (1) 分别准确称取Str印M527 和 M927 代谢产物〇.lg，并加入10mL体积的无菌水，超声波震荡充分溶解，分别配置终浓度为10g/ L的母液； (2) 抑菌活性测定：取上述母液分别稀释成浓度为lg/L和0. 5g/L的溶液，取各浓度溶 液lmL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速混勻 M527 和 #_/〇办i577(〇rasM927 代谢产物终浓度分别均为 0.lg/L和 0. 05g/L), 冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的番茄枯萎病菌菌饼，菌饼接于培养皿中 央（培养皿直径为9cm)，置培养箱中28°C培养36h，以常规化学药剂和无菌水处理作为对 照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率： 菌丝生长抑制率（％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径）/(对照菌落直径-4)]X100 试验例：(本发明产品与常规农药防治效果对比试验） 试验结果见表 1。从表 1 看出，M527 和 M927代谢产物抑制番茄枯萎病菌效果较常规化学药剂略优，当两者代谢产物 按照4:1一7:3质量百分比混合制成混合制剂时，防治番茄枯萎病原菌的效果较两者分别 作为单一制剂时更为显著。
[0016] 表 1 M527 和 M927 代谢产物 对供试的番茄枯萎病原菌的抑制效果及比较
【权利要求】
1. 一种链霉菌菌株，其特征在于：菌株M527分类命名为龟裂链霉菌 ^^^?/5^527,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日：2013年6月19日，保 藏登记号为CCTCC NO: M 2013270;另一种链霉菌菌株M927,分类命名为球孢链霉菌 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日：2013年 12月25日，保藏登记号为CCTCC NO: M 2013709。
2. -种如权利要求1所述的链霉菌菌株的应用，其特征在于：所述的龟裂链霉菌 M527和球孢链霉菌M927均能发酵产生对番爺枯萎病菌f. sp. Lycopersici Snyder et Hansen)具有拮抗作用的活性物质，可防治番爺枯萎病病害，M527 和M927两者的代谢产物重量百分比为4:1 一7:3时，效果显著。
3. 权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的M527和M927两者的代谢产物的制备 方法如下： (1) 将分离得到的龟裂链霉菌M527和球孢链霉菌M927涂布于甘露醇黄豆饼粉制成的 MS平板上，收集孢子接种于发酵培养基； (2) 发酵培养基为每1 L中含有黄豆饼粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g，葡萄糖5g，蛋 白胨5g，C〇Cl2 0? 02g，牛肉膏5g，CaC03 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶装发酵培养液50mL ; 配制后121°C灭菌20min，将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的 M527和M927分别按5%(v/v)接入发酵培养基中，在28°C ±1°C 条件下，摇床转速180 r/min，发酵培养84 h; (3) 发酵结束后离心收集发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，充分震荡混匀，取上层，在真 空条件下浓缩至浸膏； (4) 混合制剂配制：将 M527 和 M927代谢产物用水溶解，混合，配成终浓度为0. 08g/L泣M527代谢产 物和0. 02g/L M927代谢产物混合配方制剂。
【文档编号】A01N63/02GK104342388SQ201410509024
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】马正, 俞晓平, 路丹丹, 罗帅, 边亚琳, 王正亮, 申屠旭萍 申请人:中国计量学院