一种紫萍愈伤组织快速诱导、继代和再生的方法
【专利摘要】本发明提供了一种紫萍愈伤组织的快速诱导、继代培养及高效再生的方法，以浮萍科紫萍属紫萍为材料，通过紫萍愈伤组织的诱导和继代、紫萍愈伤组织的再生首创了紫萍快速再生体系；本发明能用无激素配方高效诱导紫萍再生植株的形成，并且再生时间缩短为两周，再生植株再生率和紫萍根再生率均达到100％；本发明建立的高效紫萍快速再生体系，能很好地应用到相关的研究和生产工作当中，也为转基因等研究提供了重要的技术平台和支持。
【专利说明】一种紫萍愈伤组织快速诱导、继代和再生的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物愈伤组织再生的方法，特别是一种用无激素配方诱导浮萍科 (Iemnaceae)多根紫萍属（Spirodela)水生漂浮植物紫萍快速高效再生的方法。
【背景技术】
[0002] 紫萍（Spirodela polyrrhiza，也称多根紫萍）是浮萍科（Iemnaceae)多根紫萍 属（Spirodela)水生漂浮植物，浮萍（Iemna)是浮萍科（Iemnaceae)浮萍属（Lemna)水生 漂浮植物。浮萍科不同属间植物最适生长所需的大量元素、微量元素和有机物以及植物激 素的量很不一致，导致它们愈伤组织的诱导、分化和叶状体的形成条件有别，而从进化关系 上来说，紫萍是浮萍科中最原始的类型，其基因组也比其他浮萍科植物小，这是浮萍和紫萍 再生体系差别大的主要原因，因而紫萍的愈伤组织的诱导、分化和叶状体的形成所需要的 生长条件大量元素、微量元素和有机物以及植物激素的量是有别于浮萍科的其他种属，事 实上目前38个种的浮萍科植物中，只有5种植物的再生体系获得成功，而且这5种植物再 生体系条件也是完全不一样的，紫萍的再生体系是完全有别于其他类型的浮萍科植物的。
[0003] 紫萍是最小的开花植物之一，完整植物都比较小；结构比较简单，仅由叶状体和根 系组成，主要进行无性繁殖。叶状体倒卵形或椭圆形，4?5. 5mm长，3?3. 5宽，表深绿色， 里紫红色，根5?11条。
[0004] 紫萍蛋白质含量高，生长速度快，成本低廉使其成为高通量外源蛋白表达乃至生 产药用蛋白的首选和理想材料。尽管专利CN 102487827 B公开了一种浮萍再生体系，但是 实验表明，该技术并不适用于紫萍再生体系的建立。紫萍再生体系成功的例子尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是解决紫萍尚未建立再生体系的问题，提供一种运用无激素配方， 快速高效地对浮萍科多根紫萍属紫萍愈伤组织诱导、继代和再生的方法，填补技术空白，应 用于相关的研究和生产工作中，并为转基因研究提供重要的技术平台和支持。
[0006] 为了实现上述目的，发明人通过探讨不同外植体种类、培养基、激素种类和浓度、 蔗糖浓度、暗培养时间等因素对紫萍愈伤组织和叶状体形成的影响，建立了紫萍高效快速 再生体系。
[0007] 本发明提供的紫萍愈伤组织诱导、继代和再生的方法包括如下步骤：
[0008] 1).紫萍愈伤组织的诱导和继代：取生长旺盛的紫萍植株，并对其叶基部横切，将 处理好的外植体置于紫萍诱导培养基中。在光照16h/黑暗8h，光照温度26°C /黑暗温度 24°C，光照强度70-80 y m〇l/m2s的培养条件下，10-15天后外植体开始膨大，两周后愈伤组 织开始形成，挑选绿色部分移至紫萍继代培养基上进行继代培养，4周后长出生长良好的的 愈伤组织，每两周继代一次愈伤组织；
[0009] 2).紫萍愈伤组织的再生：将紫萍愈伤组织移至再生培养基中，培养条件同第1) 步，14天以后，愈伤组织形成再生植株，20天后，再生植株再生率高达100%，再生植株移入 生根培基，6天后紫萍根再生率100% ;
[0010] 其中，在第1)步中所述紫萍诱导培养基的组成包括：
【权利要求】
1. 一种紫萍愈伤组织诱导、继代和再生的方法，其特征在于包括如下步骤： 1) .紫萍愈伤组织的诱导和继代：取生长旺盛的紫萍植株，并对其叶基部横切，将处理 好的外植体置于紫萍诱导培养基中，在光照16h/黑暗8h，光照温度26°C /黑暗温度24°C、 光照强度70-80 y m〇l/m2s的培养条件下，10-15天后外植体开始膨大，两周后愈伤组织开 始形成，挑选绿色部分移至紫萍继代培养基上进行继代培养，4周后长处生长良好的的愈伤 组织，每两周继代一次愈伤组织； 所述紫萍诱导培养基组成包括： a) ?大量元素，其中含有 1900mg/L KN03、1650mg/L NH4N03、370mg/L MgSO4 WH2CKnOmg/ L KH2PO4、440mg/L CaCl2 ? 2H20 ; b) ?微量元素，其中含有 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20、8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20、6. 2mg/L H3B03、 0? 83mg/L KI、0? 25mg/L Na2MoO4 ? 7H20、0. 025mg/L CuSO4 ? 5H204、0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20 ; c) ?铁盐，其中含有 37. 3mg/L Na2-EDTA ? 2H20、27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20 ; d) .有机物，其中含有2. Omg/L甘氨酸、0? 5mg/L盐酸吡哆醇、0? lmg/L盐酸硫铵素、 0? 5mg/L 烟酸、100mg/L 肌醇； e) ?激素成分，其中含有1.2mg/L萘乙酸、lmg/L赤霉素、2.5mg/L 6-BA、3.5mg/L 2, 4-D ； f) ?固化剂，其中含有1500mg/L的Gelrite和4000mg/L的琼脂； g) .碳源，其中含有30000mg/L的鹿糖； 铁盐配制方法为：将FeSO4 ? 7H20和Na2-EDTA ? 2H20分别溶于450mL蒸馏水中，两液混 合后作为母液贮存使用，调pH值至5. 5加水定容至IOOOmL,并于102. 9Pa，121 °C的条件下 20min高压灭菌后使用； 所述紫萍继代培养基组成以及铁盐配制方法均同于所述紫萍诱导培养基； 2) .紫萍愈伤组织的再生：将紫萍愈伤组织移至再生培养基中，培养条件同第1)步，14 天后，愈伤组织形成再生植株，20天后，再生植株再生率高达100 %，再生植株移入生根培 养基，6天后紫萍根再生率100% ; 所述紫萍再生培养基PH值为5. 7,组成包括：质量百分比为0. 8%的琼脂和超纯水； 所述紫萍生根培养基pH值为5. 7,组成包括： a) ?大量元素，其中含有 2495mg/L KN03、290mg/L NH4H2P04、400mg/L MgS04*7H20、 440mg/L CaCl2 ? 2H20 ; b) ?微量元素，其中含有 8. 45mg/L MnSO4 ? 4H20、4. 3mg/L ZnSO4 ? 7H20、3. lmg/L H3B03、 0? 4mg/L KI、0? 125mg/L Na2MoO4 ? 7H20、0. 125mg/L CuSO4 ? 5H204、0. 0125mg/L CoCl2 ? 6H20 ; c) ?铁盐，其中含有 18. 65mg/L Na2-EDTA ? 2H20 和 13. 9mg/L FeSO4. 7H20 ; d) .有机物，其中含有0. 08mg/L甘氨酸、0. 02mg/L盐酸吡哆醇、0. 004mg/L盐酸硫铵素、 0? 02mg/L 烟酸、4mg/L 肌醇； e) .碳源，其中含有12000mg/L的鹿糖； 铁盐配制方法为：将FeSO4 ? 7H20和Na2-EDTA ? 2H20分别溶于450mL蒸馏水中，两液混 合后作为母液贮存使用，调pH值至5. 5加水定容至IOOOmL,并于102. 9Pa，121 °C的条件下 20min高压灭菌后使用。
【文档编号】A01H4/00GK104304010SQ201410534187
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】王友如 申请人:湖北师范学院