一种诱导再分化提高南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量的方法
【专利摘要】本发明提供的是一种通过诱导南方红豆杉愈伤组织再分化来增强或保持其细胞代谢的遗传稳定性，提高其次生代谢产物紫杉醇含量的技术。包括外植体预处理、愈伤组织诱导培养、愈伤组织继代培养、愈伤组织再分化诱导培养4个步骤。诱导愈伤组织再分化是将继代培养4次，每次培养20～35天，颜色好、质地紧密的愈伤组织转接入增补0.05～0.20mg/L6-BA、0.2～2.0mg/LNAA、0.1mg/LKT、0.5mg/LCH的改良MS培养基中进行再分化诱导培养，诱导培养45～75天后，南方红豆杉愈伤组织会长出微小芽体，此时收获愈伤组织，样品经干燥称重和一系列预处理后，用HPLC进行紫杉醇含量检测，结果显示其紫杉醇含量比未分化愈伤组织要高近1倍。所述的改良MS培养基中的氨态氮为2000～2600mg/L，硝态为800～1000mg/L。
【专利说明】一种诱导再分化提高南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量的方法【技术领域】
[0001]本发明属于利用植物细胞培养生产药用次生代谢产物领域，具体地说，涉及一种通过诱导再分化提高南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量的方法，更具体地说本发明提供了一种在利用红豆杉愈伤组织生产紫杉醇技术中提高南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量的方法，成倍地提高了愈伤组织中紫杉醇的含量。
【背景技术】
[0002]紫杉醇(Paclitaxl)是1992年美国食品药品管理局(FDA)批准上市的治疗卵巢癌的药物。近年来临床研究发现紫杉醇对转移性乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、恶性黑色素瘤和淋巴肉瘤也有很好的疗效,且对其他疾病如类风湿性关节炎等也有一定疗效。
[0003]目前，紫杉醇主要从红豆杉属植物的树皮、枝叶、根等器官组织中提取分离获得。红豆杉属植物种群分布稀少，生长速度缓慢，再生能力差，我国已将其列为一级珍稀濒危保护植物，联合国也明令禁止采伐。红豆杉属植物在全世界共有十一种，我国有四个种和一个变种，即云南红豆杉(Taxus yunnanensis)、西藏红豆杉(T.Wallicana Iucc)、东北红豆杉(T.cuspidata)、中国红豆杉(T.chinensis)及南方红豆杉(T.chinensis var.mairei )。紫杉醇在红豆杉植物中含量低，最高的短叶红豆杉树皮中也只有0.069 %，树皮中平均为0.015 %，制取I kg紫杉醇需树皮约10吨，对资源和环境破坏非常严重，故国内外已禁止或限制用该方法来生产紫杉醇。
[0004]为了解决紫 杉醇的药源问题，国内外试图通过红豆杉细胞培养来生产获取紫杉醇。
[0005]国内外学者在红豆杉细胞培养技术、生物反应器的设计研制、产物生产的调控等方面进行了系统的研究。选用的基本培养基主要有B5、MS、White、WPM等，以及以这几种培养基为基础进行改良的基本培养基，大部分已建立了细胞悬浮培养体系。在植物生长调节剂应用方面，甘烦远等(1996)发现2，4-D浓度过高时，悬浮体系产生的紫杉醇较低。Goleniowski等(2000)在曼地亚红豆杉悬浮培养体系中添加I mg/L的2，4-D和0.1 mg/L的6-BA效果最好。为提高培养细胞中紫杉醇的含量，对乙酸钠、苯丙氨酸、苯甲酸钠、茉莉酸甲酯、甘露醇、花生四烯酸、水杨酸、硝酸银、氨基酸前体、D-果糖和硫酸镧、聚乙二醇、
3-甲基-2- 丁烯-1-醇、氯化胆碱、丝氨酸、甘氨酸、α -菔烯、松节油、丙酮酸钠、栊牛儿醇、高糖渗透胁迫剂(25 g/L蔗糖和25 g/L甘露醇)、桂皮酸、硫酸钒酰、硝酸亚铈、稀土、Ce4+等诱导因子进行了应用研究，其中花生四烯酸和水杨酸不仅使紫杉醇产量提高，而且使10-去乙酰基巴卡亭III的产量同步提高。但增补诱导剂会增加成本，有些会产生污染，影响产品质量，增加下游提取纯化成本。
[0006]外植体的选择、基本培养基的筛选、基本培养基组分的调配、植物生长调节剂的应用等方面对红豆杉细胞中紫杉醇及其类似物生物合成量影响的系统研究。
[0007]已选用的外植体有茎段、茎尖、芽、叶及成熟的种胚等。[0008]杨礼香(2001)等比较了芽和茎段，发现在相同培养条件下芽产生愈伤组织的时间早，生长迅速，诱导率高，污染率较低；
张宗勤等(1998)发现幼嫩茎段比成年老枝更易产生愈伤组织，快且诱导率高；
章国瑛等(1996)、刘丽萍等(1998)发现茎段在B5培养基上诱导愈伤组织比叶片高，在MS培养基上得到的结果则相反，东北红豆杉幼叶在MS培养基上的诱导率比较高，幼茎在B5培养基上的诱导率较高。
[0009]陈永勤等(2000)研究表明，愈伤组织形成的迟早和比例在不同种和同一种不同植株间的差异较大，春夏采取的外植体在暗培养下比较容易形成愈伤组织，东北红豆杉和云南红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量比较高。
[0010]李志良等(2007 )对中国红豆杉、云南红豆杉和东北红豆杉不同部位的愈伤组织进行培养研究发现，中国红豆杉愈伤组织生长较快，叶片诱导的愈伤组织中紫杉醇含量较高。南方红豆杉愈伤组织诱导已用的基本培养基有MS和B5。
[0011]Ketchum等(1996)通过对三个加拿大红豆杉和两个东北红豆杉细胞系的研究发现，没有一种培养基能够同时适合所有的细胞系。
[0012]王德强等(2005)利用南方红豆杉幼叶和幼茎，在MS、B5、N6及SH四种培养基上进行愈伤组织诱导实验发现，两种外植体在MS培养基上诱导速度最快，但愈伤组织易褐化，B5和N6上诱导慢,但愈伤组织褐化少。
[0013]培养基中氮源的选择。陈永勤等(2000)在进行云南红豆杉愈伤组织诱导研究时发现，培养基中的氮源会影响愈伤组织的生长和紫杉醇的含量，N03 —浓度高有利于愈伤组织生长，NH4 +浓度高则抑制愈伤组织的生长，但能提高紫杉醇的含量。
[0014]培养基pH值的影响。盛长忠等(2000,2001)、王森林等(2002)研究发现pH影响细胞质膜的渗透性，从而影响细胞内源物质的运输及多种酶活性和底物的利用率，较高的PH有利于东北红豆杉愈伤组织的生长，较低的pH有利于紫杉醇的积累，南方红豆杉则恰恰相反。梅兴国等(2001)研究发现，降低pH可以降低褐变。
[0015]培养基中天然有机物的添加。张秀清等(2001)发现20 g/L的蔗糖能够显著提高愈伤组织的生物量。李干雄等(2000)发现D-果糖和硫酸镧对中国红豆杉悬浮细胞中紫杉醇的积累具有促进作用。JHA等(1998)则发现不同氨基酸与激素一起使用的效果不一。甘烦远等(1996)研究表明，椰子汁(CM)可提高愈伤组织的诱导率和生长势，添加10 %的椰子汁或0.1 %的水解酪蛋白(CA)可使红豆杉愈伤组织更加快速稳定的生长。盛长忠等(2000)报道培养基中添加0.1 %的CA既能促进愈伤组织的生长，又不影响紫杉醇的合成积累。
[0016]已试用的植物生长调节剂主要有生长素类、细胞分裂素类及赤霉素类，生长素类有2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA);细胞分裂素类有6-苄氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、玉米素(ZT)，赤霉素类主要有GA3。章国瑛等(1996)在B5培养基中添加NAA和6-BA组合进行南方红豆杉愈伤组织诱导，诱导率达到100 %。
[0017]杨礼香等(2001)用芽外植体在添加2，4-D和NAA的培养基中诱导率也可达100%，且发现KT的作用比较复杂 ，0.2%~0.5%的KT会导致茎段延迟产生愈伤组织，降低诱导率，并有抑制芽外植体产生愈伤组织的倾向，杜亚填等(2006)发现2，4-D/NAA比值过高，不利于南方红豆杉愈伤组织的诱导，荣俊冬等(2007)发现较高浓度的2，4-D有利于愈伤组织的诱导。张宗勤等(1998)研究表明，适宜浓度的NAA可以替代2，4-D。陈永勤等(2000)发现云南红豆杉愈伤组织在黑暗条件下，0.1 !1^/1^4?和1.0 mg/L 2，4_D组合比较有利生长。苏应娟等(2001)研究认为，低浓度KT可使愈伤组织的质地变好。
[0018]盛长忠等(2000)报道用叶作为外植体时，使用低浓度的CH比高浓度有更好的效果，且低浓度的CH和GA3可明显抑制POD (过氧化物酶)和PPO (多酚氧化酶)的活性，从而缓解褐化现象，改善愈伤组织生长状况。
[0019]孙捃等(2000)发现不同浓度IAA、IBA、NAA,2, 4_D、和6-BA组合均可以诱导愈伤组织发生，而且不同浓度和植物生长调节剂种类的组合对愈伤组织中紫杉醇含量也有一定的影响。陈永勤等(2000)用(1.0~3.0)mg/L2, 4-D对各种红豆杉愈伤组织的诱导率都是(50~100)%，但愈伤组织中的紫杉醇含量有较大差异。杜亚填等(2006)研究发现单独使用2，4-D或者与适宜浓度的KT、6-BA、KT+GA3配合，对南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇的合成较有利，而NAA不利。盛长忠等(2000)报道在培养基中添加适当浓度的CA (水解酪蛋白)、Phe (苯丙氨酸)及乙酸钠对愈伤组织的生长和紫杉醇的积累均有较为显著的作用，而在东北红豆杉愈伤组织的诱导中，使用NAA比2，4-D要更好。
[0020] 毛状根培养生产紫杉醇方法的研究。1973年Ackemann首次报道发根农杆菌转化高等植物以来，已有160多种植物成功利用Ri质粒进行了转化。目前利用发根农杆菌侵染并得到典型转化性状的植物基本上集中在双子叶植物近30个科40个属中。1993年，Richard等报道了发根农杆菌的某种株系能转化短叶红豆杉(T.brevifolia)形成毛状根并能产生紫杉醇。1994年，han等利用短叶红豆杉和欧洲红豆杉成熟的的茎段作为材料，用根癌农杆菌(Bo542)转染，欧洲红豆杉冠瘿瘤形成率达到了 28.3%。1995年，Hamada等报道利用发根农杆菌A4U5834等菌株转化红豆杉和短叶红豆杉愈伤组织细胞，使其紫杉醇含量最多提高了 50倍，并申请了专利。黄遵锡等(1997)利用发根农杆菌A4 (ATCC 31789)转染短叶红豆杉芽外植体，30~35d左右可诱导出毛状根，40d左右转化率达到了 30 %，经过农杆碱单克隆抗体酶联免疫分析证明已被转化，且毛状根中紫杉醇的含量是愈伤组织中的1.3~8.0倍。盛长忠等(1999)采用土壤农杆菌C58转染东北红豆杉不同外植体和不同时期的愈伤组织，发现20 d的愈伤组织对C58菌比较敏感，转染5 min冠瘿诱导率达15.0%左右，在无激素B5培养基上培养得到的白色松软冠瘿组织经分析检测发现有特异的胭脂碱存在，并具有产生紫杉醇的能力。
[0021]为了实现红豆杉试管苗的快繁，国内外进行了离体胚培养、外植体直接诱导腋芽增殖、愈伤组织诱导再分化产生不定芽及试管芽生根诱导等方面的研究。
[0022]1968年Le Page-Degivry最早采用离体胚培养进行红豆杉芽诱导,他将休眠的欧洲红豆杉未成熟胚接种于Heller培养基中，滤去胚中脱落酸，30 d后胚的萌发率达28 %，后来又发现赤霉素对未成熟胚的萌发具有显著促进作用，在培养基中添加适量赤霉素后，促进了未成熟胚的萌发。Flores等(1991)将短叶红豆杉的未成熟胚接种在White和MS培养基上，发现种子越成熟，其胚的萌发率越低。Hu C-Y等(1992)研究发现，欧洲红豆杉与东北红豆杉的未成熟胚在B5培养基上生长良好，而短叶红豆杉的未成熟胚在MS培养基上生长较快，两种成熟胚在生长时出现了轻度休眠，杂种紫杉成熟胚未见胚生长，说明离体胚成熟度对其萌发影响较大。1994年，Zhiri等将9、10月欧洲红豆杉种子的胚接种于添加有水解酪蛋白(CH)、酵母浸膏(YE)、抗坏血酸(Vc)以及5 g/L活性炭(AC)的改良MS和改良Heller培养基上，7 d后可完全萌发，并且均可完全发育成苗。Chee (1994，1995)将短叶红豆杉和欧洲红豆杉较成熟离体胚接种在B5培养基上，通过调节光培养和暗培养的时间，可以使其36 %的萌发长成幼苗，将短叶红豆杉离体胚接种于添加10 μ M 6-BA的1/2B5培养基上，培养14 d后离体胚上诱导出了不定芽原基。梅兴国等(1998)采用BM+1 mg/L6-BA+0.1 mg/L2，4-D+4 g/LAC培养基使南方红豆杉离体胚的萌发率达到了 81 %。陈永勤等(1998)进一步研究使红豆杉离体胚的萌发率达97 %以上，并认为在离体条件下，红豆杉的成熟胚似乎没有休眠期，只要条件适宜，不需任何预处理就有很高的萌发率与成苗率，与Flores (1991)、Chee (1994)的研究基本一致。陈永勤等(1998)研究光照对红豆杉离体胚诱导的影响与Chee (1994)对欧洲红豆杉光照条件下的结果类似，而Flores等(1993)发现红豆杉属植物离体胚在光照下萌发的结果更好。曾余力等(2010)以南方红豆杉成熟胚为外植体进行芽诱导研究发现，萌动种胚产不定芽的效果优于未萌动种胚，与赵沛基等(2003)的研究结果类似。
[0023]外植体直接诱导腋芽增殖。1981年Amos等发现在WPM培养基中加入低浓度BA有利于嫩芽产生，高浓度BA则抑制嫩芽伸长。Barnes发现在含I mg/LBA的WPM培养基上，加拿大红豆杉的茎尖腋芽生长较好。Chee (1995)在1/2 B5+10 μ M 6-BA培养基上利用短叶红豆杉离体胚诱导不定芽的研究中，接种14 d后离体胚上诱导出了芽原基。杨振国等(1997)利用东北红豆杉幼枝顶芽作外植体，以MS为基本培养基，诱导出了丛生芽，后又发现东北红豆杉茎尖能诱导出不定芽与不定根，不定芽的形成与BA/ IBA比值和母树龄有关，不定根的形成主要取决于IBA的质量浓度与母树树龄。浩仁塔本等(2004)研究发现6-BA较有利于东北红豆杉茎尖芽的诱导，KT有利愈伤组织产生。马均等(2007)以曼地亚红豆杉带芽茎段为外植体，在MS+0.05 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA上芽诱导率最高，达89.55 %，且低浓度6-BA更有利于芽的启动。唐道方等(2008)采用南方红豆杉带芽茎段为外植体，研究芽增殖和植株再生的条件，结果发现以春季生长旺盛期的嫩枝最适合腋芽的增殖，其最佳培养基为 DCR+0.1 mg/LIBA+0.05 mg/L6_BA。张圣喜等(2010)则报道 DCR+ 0.5 mg/L6-BA+0.8 mg/LNAA较适合直接诱导南方红豆杉出芽。
[0024]诱导愈伤组织再分化产生不定芽。王水等(1997)为了获得云南红豆杉试管苗，将云南红豆杉嫩枝外植体接种在增补2，4-D、NAA和KT的6，7- V和White培养基上诱导产生愈伤组织，结果6，7- V培养基中的愈伤组织再分化产生出了芽，White培养基中则未产生，之后诱导芽的生根率达85%。叶添谋等(2008)为了获得南方红豆杉试管苗，以南方红豆杉茎段为外植体在增补6-BA、2，4- D的MS培养基中诱导获得了愈伤组织，之后在增补6-BA、ZT、KT的MS培养基中诱导愈伤组织再分化产生了不定芽，且以0.1 mg/L ZT效果最好，诱导率达到58 %，再用1/2MS基本培养基增补NAA诱导不定芽的生根率可达96%。
[0025]综上所述，已有报道公开的培养基基本组成、增补的植物生长调节剂、诱导子和前体物等对红豆杉细胞悬浮体系、愈伤组织培养及其中紫杉醇合成积累的影响作用，红豆杉毛状根培养生产紫杉醇技术及红豆杉组织培养试管苗快速繁殖技术等，虽与本发明具有一定相关性，但到目前为止，红豆杉愈伤组织、细胞悬浮培养、毛状根培养技术均未得到商业化广泛应用。其中愈伤组织和细胞悬浮培养技术因经历长时间多代继代培养后，均会因过度逆进化方向驯化导致代谢遗传的不稳定而影响代谢物生产的稳定性，从而制约了该技术的商业化应用。红豆杉毛状根培养技术虽解决了遗传相对稳定的问题，但工业化连续自动化生产技术的诸多关键技术问题尚未得到解决。
【发明内容】
[0026]本发明的目的是提供一种南方红豆杉细胞培养技术，通过诱导愈伤组织再分化来增强或保持植物细胞代谢遗传稳定性，同时又能提高其中代谢产物紫杉醇含量的技术，以加速植物细胞培养生产代谢产物技术商业化应用的进程。
[0027]本发明采用的技术方案包括:一种诱导再分化提高南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量的方法，步骤包括:
(I)外植体预处理:南方红豆杉当年生较成熟幼茎,剪除叶片,用自来水冲洗2~4h后晾干表面水，剪成5 cm左右长的小段，置于三角瓶中，于超净工作台中用75 %酒精浸洗15s,再用0.1% HgCl2浸泡20 min,用无菌水冲洗6~8次后无菌切成0.5~I cm长的小段备接种用。
[0028](2)愈伤组织诱导培养:将茎段无菌接种在增补I~1.5mg/L2, 4-D,3~5mg/LNAA,2~3mg/L6-BA的MS培养基中进行诱导培养；培养条件:人工气候箱中进行培养，温度(20±5) °C、湿度(80±5)% 黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5)%、光照 1000-1200 Lx 各12 h交替进行。
[0029](3)愈伤组织继代培养:步骤(2)中，经诱导长出黄绿色愈伤组织后，将黄绿色愈伤组织转接于增补 1.5 ~2.0 mg/L 2，4-D、3 ~4 mg/L NAA、0.05 ~0.2 mg/L KT 的 MS培养基中进行增殖继代培养；培养条件:人工气候箱中进行培养，温度(20±5) °C、湿度(80±5)%黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5)%、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0030](4)愈伤组织再分化诱导培养:步骤(3)中，继代培养4次，每次培养的周期为20~35天，然后选择颜色较好、质地紧密的愈伤组织转接入增补0.05~0.20mg/L6-BA、
0.2~2.0 mg/L NAA,0.1 mg/LKT、0.5mg/L CH的改良MS培养基中进行再分化诱导培养；培养条件:人工气候箱中进行培养，温度(20 ±5) °C、湿度(80 ±5)%黑暗和温度(25 ±5) °C、湿度(85±5) %、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0031](5)收获愈伤组织:步骤(4)中，再分化诱导培养45~75天，南方红豆杉愈伤组织出现微小芽体，此时收获愈伤组织。
[0032](6)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇的粗提取纯化:再分化的愈伤组织样品经干燥称重后放入50 mL的三角瓶中，加入10倍量乙酸乙酯:丙酮(I: l，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min ;过滤后残渣再用5倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min ;过滤后残渣再用3倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声30min后过滤，将三次滤液合并浓缩，将所得之浸膏与二氯甲烷(I: l，v/v)混合充分溶解，再加入与二氯甲烷等量的水充分混合后，缓慢搅拌静置2 h分层，分液，回收有机相，合并有机相浓缩，得紫杉醇粗提物；
步骤(4)中，所述的改良MS培养基中的氨态氮为2000~2600 mg/L，硝态氮为800~1000 mg/Lο
[0033]本发明的技术效果:
(I)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇含量比未分化愈伤组织增加近I倍。南方红豆杉外植体经诱导培养脱分化形成愈伤组织，愈伤组织细胞是一种新生薄壁细胞。为保护自身不受病菌浸染，其次生代谢产物较外植体本身会成倍增加。
(2)再分化南方红豆杉愈伤组织的次生代谢遗传稳定性较未分化愈伤组织要强，比南方红豆杉悬浮培养细胞更稳定。愈伤组织因脱分化易造成染色体变异，出现混倍体现象，从而导致愈伤组织遗传不稳定。若进一步进行悬浮培养，由于培养驯化环境的彻底改变，由陆生变成了水生，细胞的遗传特性会更加不稳定，其次生代谢也会因驯化程度的不断加深而发生难以预料的改变。诱导再分化相对会抑制愈伤组织染色体的倍性改变，增强其遗传的稳定性，同时为保护新发生的器官，愈伤组织次生代谢会增强，从而增加愈伤组织中紫杉醇的含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1:南方红豆杉未分化愈伤组织中紫杉醇的HPLC图，横坐标为出峰时间。
[0035]图2:南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇的HPLC图，横坐标为出峰时间。
[0036]图3:五个实施例中的南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇含量与南方红豆杉未分化愈伤组织的紫杉醇含量对比图。(图中:横坐标为愈伤组织类型，纵坐标为愈伤组织中紫杉醇的百分比含量；斜线框为未分化愈伤组织，网格框为不同实施例的诱导培养基中再分化愈伤组织为实施例1，B2为实施例2，B3为实施例3，B4为实施例4，B5为实施例5)。
具体实施方 式
[0037]下面将用实施例对本发明进行进一步说明，但并不仅限于这些实施例中的任一个或类似实例。
[0038]实施例1
(I)外植体预处理:取南方红豆杉当年生较成熟幼茎,剪除叶片,用自来水冲洗2~4h后晾干表面水，剪成5 cm左右长的小段，置于三角瓶中，于超净工作台中用75 %酒精浸洗15 s,再用0.1% HgCl2浸泡20 min,用无菌水冲洗6~8次后无菌切成0.5~I cm长的小段备接种用。
[0039](2)愈伤组织诱导培养:将茎段无菌接种在增补1.2mg/L 2，4_D、4mg/L NAA、
2.8mg/L 6-BA的MS培养基中进行诱导培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5)% 黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5)%、光照 1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0040](3)愈伤组织继代培养:步骤(2)中，经诱导长出黄绿色愈伤组织后，将黄绿色愈伤组织转接于增补1.6 mg/L 2，4-D,3.2 mg/L NAA,0.1 mg/L KT的MS培养基中进行增殖继代培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5)%黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5) %、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0041](4)愈伤组织再分化诱导培养:步骤(3)中，继代培养4次，每次培养的周期为20~35天，然后选择颜色较好、质地紧密的愈伤组织转接入增补0.10mg/L 6-BA,0.50 mg/L NAA、0.1 mg/L KT、0.5mg/L CH的改良MS (将氨态氮提高到2000~2600 mg/L，硝态降至800~1000 mg/L)培养基中进行再分化诱导培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5)%黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5) %、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0042](5)收获愈伤组织:步骤(4)中，再分化诱导培养45~75天后，可见南方红豆杉愈伤组织出现微小芽体，此时收获愈伤组织。
[0043](6)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇的粗提取纯化:再分化的愈伤组织样品经干燥称重后放入50 mL的三角瓶中，加入10倍量乙酸乙酯:丙酮(I: l，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min ;过滤后残渣再用5倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min ;过滤后残渣再用3倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声30min后过滤，将三次滤液合并浓缩，将所得之浸膏与二氯甲烷(I: 1，v/v)混合充分溶解，再加入与二氯甲烷等量的水充分混合后，缓慢搅拌静置2 h分层，分液，回收有机相，合并有机相浓缩，得紫杉醇粗提物。后用甲醇溶解并定容至10 1^，用0.45 ym微孔滤膜过滤至Tube管中备检。[0044](7)紫杉醇标准溶液的配制:用十万分之一天平准确称取紫杉醇对照品(美国sigma公司生产)3.0 mg,用甲醇溶解定容到30 mL于冰箱中冷藏备用。
[0045](8)紫杉醇浓度对HPLC色谱图峰面积值的回归曲线方程的建立:精确吸取紫杉醇标准溶液1、2、3、4、5 mL分别置于5个10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇分别定容至10 mL,过滤后进样检测，根据检测图谱，以峰面积值(X)为纵坐标，紫杉醇对照品已知百分比浓度(Y)为横坐标作标准曲线，得回归方程为:Y=6X10-10X - 7X10-5 (r2=0.9993)。
[0046](9)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇含量的HPLC检测:检测仪器:高效液相色谱仪(LC-20AT，日本岛津)、紫外检测器(SH)-20A，日本岛津)、LCsolution色谱数据工作站(日本岛津)。色谱柱:MetaChem Taxsil (5 μ m, 250X4.6mm,美国迪马公司，紫杉醇检测专用柱)；流动相:乙腈:水=1: I (v/v);进样量:20 μ L ;流速:1.0 mL/min ;柱温:30°C;检测波长:227 nm。经检测，南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇含量可达0.0599%。
[0047]实施例2
(I)外植体预处理:取南方红豆杉当年生较成熟幼茎,剪除叶片,用自来水冲洗2~4h后晾干表面水，剪成5 cm左右长的小段，置于三角瓶中，于超净工作台中用75 %酒精浸洗15 s,再用0.1% HgC12浸泡20 min,用无菌水冲洗6~8次后无菌切成0.5~I cm长的小段备接种用。
[0048](2)愈伤组织诱导培养:将茎段无菌接种在增补lmg/L 2，4_D、3mg/L NAA、2mg/L 6-BA的MS培养基中进行诱导培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5)% 黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5)%、光照 1000-1200 Lx 各12 h交替进行。
[0049](3)愈伤组织继代培养:步骤(2)中，经诱导长出黄绿色愈伤组织后，将黄绿色愈伤组织转接于增补1.5 mg/L 2, 4-D,3 mg/L NAA、0.05 mg/L KT的MS培养基中进行增殖继代培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5) %黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5) %、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0050](4)愈伤组织再分化诱导培养:步骤(3)中，继代培养4次，每次培养的周期为20~35天，然后选择颜色较好、质地紧密的愈伤组织转接入增补0.05mg/L 6-BA,0.2 mg/L NAA、0.1 mg/L KT、0.5mg/L CH的改良MS (将氨态氮提高到2000~2600 mg/L，硝态降至800~1000 mg/L)培养基中进行再分化诱导培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5)%黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5) %、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0051](5)收获愈伤组织:步骤(4)中，再分化诱导培养45~75天后，可见南方红豆杉愈伤组织出现微小芽体，此时收获愈伤组织。
[0052](6)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇的粗提取纯化:再分化的愈伤组织样品经干燥称重后放入50 mL的三角瓶中，加入10倍量乙酸乙酯:丙酮(I: l，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min ;过滤后残渣再用5倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min ;过滤后残渣再用3倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声30min后过滤，将三次滤液合并浓缩，将所得之浸膏与二氯甲烷(I: 1，v/v)混合充分溶解，再加入与二氯甲烷等量的水充分混合后，缓慢搅拌静置2 h分层，分液，回收有机相，合并有机相浓缩，得紫杉醇粗提物。后用甲醇溶解并定容至10 1^，用0.45 ym微孔滤膜过滤至Tube管中备检。
[0053](7)紫杉醇标准溶液的配制:用十万分之一天平准确称取紫杉醇对照品(美国sigma公司生产)3.0 mg,用甲醇溶解定容到30 mL于冰箱中冷藏备用。
[0054](8)紫杉醇浓度对HPLC色谱图峰面积值的回归曲线方程的建立:精确吸取紫杉醇标准溶液1、2、3、4、5 mL分别置于5个10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇分别定容至10 mL,过滤后进样检测，根据检测图谱，以峰面积值(X)为纵坐标，紫杉醇对照品已知百分比浓度(Y)为横坐标作标准曲线，得回归方程为:Y=6X 1(T1QX — 7X l(T5(r2=0.9993)。[0055](9)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇含量的HPLC检测:检测仪器:高效液相色谱仪(LC-20AT，日本岛津)、紫外检测器(SH)-20A，日本岛津)、LCsolution色谱数据工作站(日本岛津)。色谱柱:MetaChem Taxsil (5 μ m, 250X4.6mm,美国迪马公司，紫杉醇检测专用柱);流动相:乙腈:水=1: I (v/v);进样量:20 μ L ;流速:1.0 mL/min ;柱温:30°C;检测波长:227 nm。经检测，南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇含量可达0.0515%。
[0056]实施例3
(I)外植体预处理:取南方红豆杉当年生较成熟幼茎,剪除叶片,用自来水冲洗2~4h后晾干表面水，剪成5 cm左右长的小段，置于三角瓶中，于超净工作台中用75 %酒精浸洗15 s,再用0.1% HgC12浸泡20 min,用无菌水冲洗6~8次后无菌切成0.5~I cm长的小段备接种用。
[0057](2)愈伤组织诱导培养:将茎段无菌接种在增补1.5mg/L 2，4_D、5mg/L NAA、3mg/L 6-BA的MS培养基中进行诱导培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5)% 黑暗和温度(25 ±5) °C、湿度(85±5) %、光照 1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0058](3)愈伤组织继代培养:步骤(2)中，经诱导长出黄绿色愈伤组织后，将黄绿色愈伤组织转接于增补2.0 mg/L 2，4-D,4 mg/L NAA,0.2 mg/L KT的MS培养基中进行增殖继代培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5) %黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5) %、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0059](4)愈伤组织再分化诱导培养:步骤(3)中，继代培养4次，每次培养的周期为20~35天，然后选择颜色较好、质地紧密的愈伤组织转接入增补0.20mg/L 6-BA,2.0 mg/L NAA、0.1 mg/L KT、0.5mg/L CH的改良MS (将氨态氮提高到2000~2600 mg/L，硝态降至800~1000 mg/L)培养基中进行再分化诱导培养；培养条件均为于人工气候箱中进行培养，且温度(20±5) °C、湿度(80±5)%黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5) %、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行。
[0060](5)收获愈伤组织:步骤(4)中，再分化诱导培养45~75天后，可见南方红豆杉愈伤组织出现微小芽体，此 时收获愈伤组织。
[0061](6)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇的粗提取纯化:再分化的愈伤组织样品经干燥称重后放入50 mL的三角瓶中，加入10倍量乙酸乙酯:丙酮(I: l，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min ;过滤后残渣再用5倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min ;过滤后残渣再用3倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声30min后过滤，将三次滤液合并浓缩，将所得之浸膏与二氯甲烷(I: 1，v/v)混合充分溶解，再加入与二氯甲烷等量的水充分混合后，缓慢搅拌静置2 h分层，分液，回收有机相，合并有机相浓缩，得紫杉醇粗提物。后用甲醇溶解并定容至10 1^，用0.45 μ m微孔滤膜过滤至Tube管中备检。
[0062](7)紫杉醇标准溶液的配制:用十万分之一天平准确称取紫杉醇对照品(美国sigma公司生产)3.0 mg,用甲醇溶解定容到30 mL于冰箱中冷藏备用。
[0063](8)紫杉醇浓度对HPLC色谱图峰面积值的回归曲线方程的建立:精确吸取紫杉醇标准溶液1、2、3、4、5 mL分别置于5个10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇分别定容至10 mL,过滤后进样检测，根据检测图谱，以峰面积值(X)为纵坐标，紫杉醇对照品已知百分比浓度(Y)为横坐标作标准曲线，得回归方程为:Y=6Xl(r1QX — 7Xl(T5(r2=0.9993)。
[0064](9)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇含量的HPLC检测:检测仪器:高效液相色谱仪(LC-20AT，日本岛津)、紫外检测器(SH)-20A，日本岛津)、LCsolution色谱数据工作站(日本岛津)。色谱柱:MetaChem Taxsil (5 μ m, 250X4.6mm,美国迪马公司，紫杉醇检测专用柱);流动相:乙腈:水=1: I (v/v);进样量:20 μ L ;流速:1.0 mL/min ;柱温:30°C;检测波长:227 nm。经检测，南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇含量可达0.0488%。
[0065]实施例4
与实施例1基本相同，仅诱导培养基有所变化，诱导培养基为增补的6-BA和NAA分别为0.lmg/L和1.00 mg/L的改良MS培养基，再分化愈伤组织中紫杉醇含量为0.0452%。
[0066]实施例5
与实施例1基本相同，仅诱导培养基有所变化，诱导培养基为增补的6-BA和NAA分别为0.15mg/L和1.00 mg/L的改良MS培养基，再分化愈伤组织中紫杉醇含量为0.0438%。
【权利要求】
1.一种诱导再分化提高南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量的方法，步骤包括: (I)外植体预处理:南方红豆杉当年生较成熟幼茎,剪除叶片,用自来水冲洗2~4h后晾干表面水，剪成5 cm左右长的小段，置于三角瓶中，于超净工作台中用75 %酒精浸洗15s,再用0.1% HgC12浸泡20 min,用无菌水冲洗6~8次后无菌切成0.5~I cm长的小段备接种用； (2)愈伤组织诱导培养:将茎段无菌接种在增补I~1.5mg/L2, 4_D、3~5mg/L NAA、.2~3mg/L6-BA的MS培养基中进行诱导培养；培养条件:人工气候箱中进行培养，温度(20±5) °C、湿度(80±5)% 黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5)%、光照 1000-1200 Lx 各.12 h交替进行； (3)愈伤组织继代培养:步骤(2)中，经诱导长出黄绿色愈伤组织后，将黄绿色愈伤组织转接于增补 1.5 ~2.0 mg/L 2，4_D、3 ~4 mg/L NAA,0.05 ~0.2 mg/L KT 的 MS 培养基中进行增殖继代培养；培养条件:人工气候箱中进行培养，温度(20±5) °〇、湿度(80±5)%黑暗和温度(25±5) °C、湿度(85±5)%、光照1000-1200 Lx各12 h交替进行； (4)愈伤组织再分化诱导培养:步骤(3)中，继代培养4次，每次培养的周期为20~.35天，然后选择颜色较好、质地紧密的愈伤组织转接入增补0.05~0.20mg/L6-BA、0.2~.2.0 mg/L NAA,0.1 mg/LKT、0.5mg/L CH的改良MS培养基中进行再分化诱导培养；培养条件:人工气候箱中进行培养，温度(20 ±5) °C、湿度(80 ±5)%黑暗和温度(25 ±5) °C、湿度(85±5) %、光照 1000-1200 Lx 各 12 h 交替进行； (5)收获愈伤组织:步骤(4)中，再分化诱导培养45~75天，南方红豆杉愈伤组织出现微小芽体，此时收获愈伤组织； (6)南方红豆杉再分化愈伤组织中紫杉醇的粗提取纯化:再分化的愈伤组织样品经干燥称重后放入50 mL的三角瓶中，加入10倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30°C超声30 min ;过滤后残渣再用5倍量乙酸乙酯:丙酮(I: 1，v/v)浸提过夜，30 °C超声.30 min ;过滤后残渣再用3倍量乙酸乙酯:丙酮(I: I，v/v)浸提过夜，30 °C超声30 min后过滤，将三次滤液合并浓缩，将所得之浸膏与二氯甲烷(I: 1，v/v)混合充分溶解，再加入与二氯甲烷等量的水充分混合后， 缓慢搅拌静置2 h分层，分液，回收有机相，合并有机相浓缩，得紫杉醇粗提物； 步骤(4)中，所述的改良MS培养基中的氨态氮为2000~2600 mg/L,硝态为800~1000mg/L ο
【文档编号】A01H4/00GK103651139SQ201310663800
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】杜亚填 申请人:吉首大学