金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法
【专利摘要】本发明涉及一种金线莲种子与丝核菌共生萌发快速成苗的方法，由金线莲种子与共生真菌共生萌发成原球茎，由共生真菌持续为原球茎提供营养，原球茎成长分化为金线莲幼苗的快速育苗模式。本发明方法简便、成本低廉，整个培育过程仅需一种育苗培养基、仅需一次转移金线莲的原球茎即可成苗，从金线莲种子与真菌共生到培育成金线莲幼苗仅需70—90天的培育期，培育金线莲幼苗的周期比传统的金线莲种子无菌播种育苗周期缩短30—60天以上；所培育出的金线莲幼苗抗病力强，移栽成活率达95%以上，培育过程当中不使用任何化学合成物质，非常容易转化成为大规模工厂化培育金线莲幼苗的模式。CGMCC No.97282014.09.28
【专利说明】金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，具体来说是金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗 的方法。
【背景技术】
[0002] 金线莲为地生兰，种子细微，比毛发还细小，不具胚乳，无发芽能力，只有在真菌 共生下，才促进种子萌发生长，但其发芽率很低。而金线莲对生态环境要求也极为严苛，多 生长在常绿阔叶林的沟边，小溪边的土质松散，阴凉潮湿地带，所以野生金线莲的成苗率就 更低，或为万分之一。由于金线莲的自然繁殖率极低，生态环境的严重破坏，以及人为的盲 目采挖，野生金线莲已经日趋枯竭，濒临灭绝。近年来，国内外研究人员纷纷加强对金线莲 的药用价值开发力度，金线莲中许多具备药理活性成分的化合物不断地被发现与验证，金 线莲的药用价值和保健功能为越来越多的人们所认知，市场需求越来越大。
[0003] 现有兰科植物的繁育模式一组培工厂（金线莲茎段为外植体无菌组培和金线莲 种子无菌播种）繁育金线莲，虽然可以繁育大量的金线莲组培苗，但存在着许多不足：首 先，育苗工艺繁琐，需要配制3或4种培养基质，原球茎需要转接3次或4次。其次，育苗的 生产成本较高，需要无菌的工作环境；育苗周期较长，至少需要110-120天的培育时间，甚 至更长的培育周期。
[0004] 金线莲组培苗从无菌的环境移栽到自然的生长环境，导致生长缓慢、植株抗病力 低、有效药用成分达不到要求，对金线莲的药用价值开发形成制约。
[0005] 在自然界中，整个兰科植物的生活史都与共生真菌紧密联系着，共生真菌促进兰 科植物种子萌发，为萌发的原球茎提供营养物质，促进其转化成幼苗成长。
[0006] 研究金线莲种子与共生真菌共生萌发快速成苗的方法，是完全模拟兰科植物在 自然界中的自然生长规律，发现金线莲种子与共生真菌背后的共生规律，实现从金线莲种 子与真菌共生萌发的有性繁育和快速成苗，这一种繁育模式具有成苗周期短，仅需70 - 90 天；成苗抗病力和抗逆性强；金线莲成苗的有效药用成分接近野生金线莲。这一由金线莲 种子和真菌共生萌发快速繁育金线莲幼苗的生产模式，可为其它珍稀兰科植物品种的保育 开辟一个全新的高效繁育模式。
[0007] 目前，国内外能够把真菌的共生技术运用在兰科植物的有性繁育和人工规模化栽 培品种是天麻，由上世纪80年代徐锦堂研发而成。此后，国内外的许多兰科真菌研究专家 学者对其它兰科植物的共生真菌、真菌与兰科植物种子共生机理作了深入全面的理论研究 和实践运用，但是还没有能够实现从兰科植物种子和真菌共生萌发、萌发的原球茎继续成 长发育成幼苗规模化栽培这一关键阶段技术的突破。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法，是全国首 创的培育仿野生金线莲与真菌共生成苗的快速生长模式。
[0009] 实现本发明目的的技术方案是： 金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法，包括如下步骤， (1) 金线莲共生萌发真菌的分离、纯化： 选取野生金线莲健壮幼苗根状茎的顶端突起部位、或是根状茎的节上突起部位；将这 一部位用70%酒精表面消毒3_5s，置于清水琼脂培养基中培养、分离、纯化； (2) 制备金线莲共生萌发真菌的液体菌种： 将分离纯化后的金线莲有效共生萌发真菌一丝核菌（Rhizoctoniasp.),保藏号为CGMCCNo. 9728,从低温保藏的斜面试管活化后，制备成液体共生菌种备用； 液体菌种的配制比例为：20%马铃薯提取液：1一5%山毛榉科树叶提取液：0. 5-1. 5% 白砂糖； 所述山毛榉科树叶提取液的制备采用现有技术，具体是将山毛榉科树叶与水按1 :5的 比例混合，煮沸半小时，滤出原液制成； (3) 制备金线莲共生萌发丝核菌的固体培养基： 培养基由山毛榉科树叶、山毛榉科木屑、麦麸或米糠按照比例混合，再经过高温杀菌， 然后将丝核菌的液体菌种接种到培养基上，在温度为25°C-27°C的环境下培养，待共生真 菌长满整个培养基，等待播种； 所述培养基原料配制的比例为：山毛榉科树叶30-45% :山毛榉科木屑30-45% :米糠 或麦麸10-40%，培养基的含水量为60-62%; (4) 金线莲种子的播种与暗培养： 将成熟的金线莲种子撒播在长满共生真菌的培养基上，在温度为25- 27°C的环境下， 暗培养45-60天，金线莲种子与共生真菌共生萌发成长为粗壮的原球茎，原球茎长度达可 达L5_3cm; (5) 金线莲原球茎的转移与光培养： 将粗壮的金线莲原球茎转移至山毛榉科树叶：山毛榉科木屑体积比为1 :1?1 :3的混 合基质中，在光照强度为1000-3000LUX，光照时间为10-12h/d，温度为25°C-27°C的条件 下，光培养20-30天，即可成长为具有原生态的仿野生金线莲幼苗，金线莲幼苗高度可达 5cm以上。
[0010] 本发明提供的菌种丝核菌（Rhizoctoniasp.)，已于2014年9月28日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 9728。
[0011] 所述步骤（2)液体菌种制备的周期为：5-7天，在温度为25°C-27°C条件下培养。
[0012] 本发明将获得的真菌接种在消毒后的山毛榉科树叶上，将成熟的金线莲种子撒播 在带菌的树叶上进行共生萌发培养，以检验所得的真菌对金线莲种子共生萌发的有效性， 以金线莲种子的萌发率和金线莲原球茎的生长速度作为两个主要筛选标准，筛选出最有效 的金线莲共生萌发菌，并对此共生真菌进行分子鉴定和保存。此方法分离金线莲种子有效 萌发共生真菌的分离效率在60%-80%以上。目前筛选出最有效的金线莲共生萌发真菌，种 子萌发率在15-20%之间。这一分尚方法相对于传统的利用金线莲根部分尚有效共生萌发 真菌的方法更简单、快速；分离效率高10倍以上。
[0013] 本发明金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法，工艺流程简单，成本低，育苗 周期比传统的种子无菌播种和组培方法时间缩短一半甚至一倍以上；而且育苗全程不添加 任何人工合成化学物质；金线莲从种子与所分离筛选的共生萌发真菌结合共生萌发成原球 茎，共生真菌持续为原球茎提供营养，成长分化成金线莲幼苗，育苗全程仅需一种固体培养 基和经一次转移，培育周期仅在70- 90天；金线莲幼苗已经携带共生真菌，与无菌的金线 莲组培苗相比更具抗病力和抗逆性；所培育的金线莲幼苗的有效药用成分更接近野生金线 莲的有效药用成分。这一育苗方法的发明，可为其它珍稀兰科植物的繁育及濒危珍稀兰花 品种的保育产生一定的借鉴意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为金线莲种子； 图2为金线莲根状茎的突起部位； 图3为实施例金线莲原球茎与丝核菌共生萌发36天的照片； 图4为实施例金线莲原球茎与丝核菌共生萌发60天的照片； 图5为实施例金线莲原球茎与丝核菌共生萌发70天的照片； 图6为实施例金线莲共生幼苗与丝核菌共生萌发85天的照片； 图7为实施例金线莲共生幼苗与丝核菌共生萌发93天的照片。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和实施例对本
【发明内容】
作进一步的说明，但不是对本发明的限定。 实施例
[0016] 金线莲种子与共生真菌共生萌发快速成苗的方法，包括以下步骤： (1)金线莲共生萌发真菌的分离、纯化： 选取野生金线莲健壮幼苗根状茎的顶端突起部位(如图2所示)，将这一部位用70%酒 精表面消毒3_5s，置于清水琼脂培养基中培养、分离、纯化； 已经筛选好的金线莲共生萌发真菌一丝核菌（Rhizoctoniasp.)，已于2014年9月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏号为CGMCC No.9728。
[0017] (2)液体菌种的制备：将丝核菌CGMCCNo. 9728的菌株自低温保藏斜面试管活化 后，制备成液体共生菌种备用；液体菌种的配制比例为：20%马铃薯提取液、2%山毛榉科树 叶提取液、1%白砂糖，在室温为25°C-27°C的条件下培养5-7天备用。
[0018] (3)制备金线莲共生萌发丝核菌的固体培养基：培养基成分包括：山毛榉科树叶、 山毛榉科木屑、米糠，按照其重量比例为：40 : 40 : 20的比例混合配制而成，培养基的含 水量为60%，经120°C高温灭菌，灭菌时间为lh，将步骤（2)菌株的液体菌种接种到固体培 养基上，培养10-14天，待大部分或是全部固体培养基长满共生真菌时备用。
[0019] (4)金线莲种子的播种与暗培养：将成熟的金线莲种子(如图1所示）撒播在步骤 (3)固体培养基上，金线莲种子与共生真菌共生萌发成原球茎，在室温25-27°C的条件下，经 过45- 60天的暗培养，发育成长度达I. 5-3cm金线莲原球茎，如图3-4所示。
[0020] (5)金线莲原球茎的转移与光培养：将粗壮的金线莲原球茎转移到山毛榉科树 叶：山毛榉科木屑体积比为1 :1的混合基质，在室温25°C-27°C的条件下，光照强度在 2000LUX，每天光照12h，光培养约20-30天，原球茎分化成为具有原生态的仿野生金线莲 幼苗，幼苗高度可达5cm以上，如图5-7所示。
[0021] 下面列表显示本实施例共生菌株对金线莲种子萌发率及株高的影响
【权利要求】
1.金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 金线莲共生萌发真菌的分离、纯化： 选取野生金线莲健壮幼苗根状茎的顶端突起部位、或是根状茎的节上突起部位；将这 一部位用70%酒精表面消毒3-5s，置于清水琼脂培养基中培养、分离、纯化； (2) 制备金线莲共生萌发真菌的液体菌种： 将分离纯化后的金线莲有效共生萌发真菌一丝核菌，保藏号为CGMCC No. 9728,从低温 保藏的斜面试管活化后，制备成液体共生菌种备用； 液体菌种的配制比例为：20%马铃薯提取液：1 一5%山毛榉科树叶提取液：0. 5 - 1. 5% 白砂糖； 山毛榉科树叶提取液的制备：将山毛榉科树叶与水按1 :5的比例混合，煮沸半小时，滤 出原液制成； (3) 制备金线莲共生萌发丝核菌的固体培养基： 培养基由山毛榉科树叶、山毛榉科木屑、麦麸或米糠按照比例混合，再经过高温杀菌， 然后将丝核菌的液体菌种接种到培养基上，在温度为25°C - 27°C的环境下培养，待共生真 菌长满整个培养基，等待播种； 所述培养基原料配制的比例为：山毛榉科树叶30-45% :山毛榉科木屑30-45% :米糠 或麦麸10-40%，培养基的含水量为60- 62% ; (4) 金线莲种子的播种与暗培养： 将成熟的金线莲种子撒播在长满共生真菌的培养基上，在温度为25- 27°C的环境下， 暗培养45- 60天，金线莲种子与共生真菌共生萌发成长为粗壮的原球茎； (5) 金线莲原球茎的转移与光培养： 将粗壮的金线莲原球茎转移至山毛榉科树叶：山毛榉科木屑体积比为1 :1?1 :3的混 合基质中，在光照强度为1000-3000LUX，光照时间为10-12h/d，温度为25°C -27°C的条件 下，光培养20- 30天，成长为具有原生态的仿野生金线莲幼苗。
【文档编号】A01C1/02GK104350838SQ201410582811
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】赵有林, 崔保登 申请人:桂林保林生物技术有限公司