一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法
【专利摘要】本发明根据南美叉柱花的生长特性在MS培养基的基础上配制出适合南美叉柱花组织培养的用于不定芽诱导的培养基、用于继代增殖的培养基和用于无菌生根的培养基。使用本发明所述的用于不定芽诱导的培养基、用于继代增殖的培养基和用于无菌生根的培养基能有效提高繁殖系数，降低生产成本；生产周期短，种植效益大大提高；能够有效解决夏季南美叉柱花严重供应不足的问题，也为种植者提供良好的经济效益。
【专利说明】一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，属于植物快速繁殖【技术领域】。
【背景技术】
[0002]观赏水草在水族箱中有着重要的地位，随着人们对水草的喜爱，已经发展成为以水草为主的观赏水族箱。目前在水族箱中应用的观赏水草品种已经超过500多种，其中绝大多数来原于美洲、非洲、东南亚等热带地区。南美叉柱花是一种双子叶植物，属于爵床科叉柱花属，分布于巴西、委内瑞拉等地。其属于挺水性水草，生长缓慢，能以匍匐茎向四周延伸繁殖，可制造出紧凑的绿色前景，是前景草的最好选择。虽然近年来才刚刚引入我国，但是得到市场的认可，非常流行，市场上往往供不应求。
[0003]南美叉柱花的繁殖主要依靠对成年的匍匐茎进行分支，繁殖系数较低同时成本较高。其属于短日照植物，在每年11月以后常常开花，引起植物早衰，叶片变黄，加之花叶较普通没有欣赏价值，导致南美叉柱花经济价值下降，市场上缺乏生长旺盛的植株产品。
[0004]观赏水草多生长在水中，内生菌丰富，严重制约组织培养技术的应用。目前虽有一些观赏水草如水榕、红椒、绿椒等已经成功建立了组织培养技术体系，但是还没有南美叉柱花相关的报道，也没有进行南美叉柱花工厂化生产。组织培养技术能够在短期内大量提供南美叉柱花的种苗，同时通过室内培养避免其受光周期诱导开花，保障期周年供应市场。
[0005]针对以上的现状，本发明提供了一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，降低种苗的生产成本，同时也能在冬季供应市场，提高种植和销售者的收入，促进观赏水草产业的发展。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于解决当前南美叉柱花种苗的来源，特别是为在冬、春季保障南美叉柱花种苗，提供一种快速，低成本的南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方法如下:
[0008]一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤:(I)外植体选取与消毒，(2)培养基的制备，(3)不定芽诱导，(4)继代增殖，(5)无菌生根以及(6)炼苗与移栽，其特征在于，所述的培养基的制备方法如下:
[0009](I)改良MS培养基的制备，配方为:用Ca(NO3)2.4H20代替原MS培养基中的CaCl2.2H20并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；在改良MS培养基中Ca(NO3)2.4H20的浓度为95-120mg/L，抗坏血酸的浓度为3_8mg/L ；
[0010](2)制备用于不定芽诱导的培养基，配方为:在所述改良MS培养基上添加6-BA、KT以及NAA ;在不定芽诱导培养基中6-BA的浓度为0.05-5mg/L，KT的浓度为0.1-lmg/L，NAA的浓度为 0.05-0.5mg/L ；
[0011](3)制备用于继代增殖的培养基，配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA, KT以及NAA，在继代增殖培养基中6-BA的浓度为0.5_2mg/L，KT的浓度为0.l_2mg/L，NAA 的浓度为 0.05-5mg/L ；
[0012](4)制备用于无菌生根的培养基，配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，在生根培养基中IBA的浓度为0.1-lmg/L, NAA的浓度为0.5_5mg/L。
[0013]优选的，在改良MS培养基中Ca(NO3)2.4Η20的浓度为112mg/L，抗坏血酸的浓度为5mg/L。
[0014]优选的，在所述用于不定芽诱导的培养基中6-BA的浓度为lmg/L，KT的浓度为0.5mg/L，NAA 的浓度为 0.2mg/L ；
[0015]优选的，在所述用于继代增殖的培养基中6-BA的浓度为lmg/L，KT的浓度为
0.5mg/L+NAA 0.2mg/L。
[0016]优选的，在所述用于无菌生根的培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为lmg/L。
[0017]本发明的有益效果是:
[0018]利用本发明所述培养基对南美叉柱花茎段的腋芽进行组织培养快速繁殖，有效提高繁殖系数，生产周期短，种植效益大大提高，能够有效解决夏季南美叉柱花严重供应不足的问题，也为种植者提供良好的经济效益。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
[0020]一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤:
[0021](I)外植体选取与消毒:
[0022]①选取生长健壮的南美叉柱花幼嫩的枝条作为外植体，
[0023]②用中性洗涤剂洗涤洗枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，
[0024]③在超净工作台上，先用70%酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3次，每次3_5min，
[0025]④立即转入0.1-0.3%的升未溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3_5次，每次3-5min，得到消毒外植体；
[0026](2)改良MS培养基的制备:
[0027]改良MS培养基的配方为:用Ca (NO3) 2.4H20代替原MS培养基中的CaCl2.2H20并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；其中Ca(NO3)2.4Η20的浓度为112mg/L，抗坏血酸的浓度为 5mg/L ；
[0028](3)不定芽诱导:
[0029]将步骤(I)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽或双芽茎段，然后接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养18-22天，得到南美叉柱花不定芽；诱导培养条件如下:温度为26±3°C，湿度为50-80%，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001X ;所述用于不定芽诱导的培养基的配方为:在所述改良MS培养基上添加6-BA、ΚΤ0.5mg/L以及NAA ;其中6-BA的浓度为lmg/L，KT的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L ；
[0030](4)继代增殖:
[0031]将步骤(3)得到的南美叉柱花不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养20-25天，得到南美叉柱花无菌苗；继代增殖培养条件如下:温度为26±3°C，湿度为50-65%，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001X ;所述用于继代增殖的培养基的配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及NAA，其中6-BA的浓度为lmg/L，KT的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L ；
[0032](5)无菌生根:
[0033]将步骤(4)获得的南美叉柱花无菌苗进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入用于无菌生根的培养基中进行生根培养15-20天，得到南美叉柱花幼苗；生根培养条件如下:培养温度为26±3°C，湿度为50-65%，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001X ;所述用于无菌生根的培养基的配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为lmg/L ；
[0034](6)炼苗与移栽:
[0035]步骤(5)中南美叉柱花幼苗生长至根长0.5cm、苗高3cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5天，然后洗净根部培养基，移入采用64孔的穴盘，消毒后的水池，塑料大棚，遮光率75%的遮阳网；经室内炼苗7天后用消毒后的岩棉包裹好组培苗根部，放入直径为5cm的镂空塑料杯中，置于塑料大棚，移栽5天后即可上市。
[0036]实施例2
[0037]一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤:
[0038](I)外植体选取与消毒:
[0039]①选取生长健壮的南美叉柱花幼嫩的枝条作为外植体，
[0040]②用中性洗涤剂洗涤洗枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，
[0041]③在超净工作台上，先用65%酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3_5min，
[0042]④立即转入0.1 %的升未溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3_5次，每次3-5min，得到消毒外植体；
[0043](2)改良MS培养基的制备:
[0044]改良MS培养基的配方为:用Ca (NO3) 2.4H20代替原MS培养基中的CaCl2.2H20并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；其中Ca(NO3)2.4H20的浓度为95mg/L，抗坏血酸的浓度为 3mg/L ；
[0045](3)不定芽诱导:
[0046]将步骤(I)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽或双芽茎段，然后接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养18天，得到南美叉柱花不定芽；诱导培养条件如下:温度为26±3°C，湿度为50%，光照时间为12小时/天，光照强度为800-10001X ;所述用于不定芽诱导的培养基的配方为:在所述改良MS培养基上添加6-BA、KT以及NAA ;其中6-BA的浓度为0.05mg/L，KT的浓度为0.lmg/L, NAA的浓度为0.05mg/L ；
[0047](4)继代增殖:
[0048]将步骤(3)得到的南美叉柱花不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养20天，得到南美叉柱花无菌苗；继代增殖培养条件如下:温度为26±3°C，湿度为50%，光照时间为12小时/天，光照强度为800-10001X ;所述用于继代增殖的培养基的配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及NAA，其中6-BA的浓度为0.5mg/L，KT的浓度为 0.lmg/L, NAA 的浓度为 0.05mg/L ；
[0049](5)无菌生根:
[0050]将步骤(4)获得的南美叉柱花无菌苗进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入用于无菌生根的培养基中进行生根培养15天，得到南美叉柱花幼苗；生根培养条件如下:培养温度为26±3°C，湿度为50%，光照时间为12小时/天，光照强度为800-10001X ；所述用于无菌生根的培养基的配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA的浓度为0.lmg/L, NAA的浓度为0.5mg/L ；
[0051](6)炼苗与移栽:
[0052]步骤(5)中南美叉柱花幼苗生长至根长2cm、苗高4cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，移入采用64孔的穴盘，消毒后的水池，塑料大棚，遮光率80%的遮阳网；经室内炼苗5天后用消毒后的岩棉包裹好组培苗根部，放入直径为8cm的镂空塑料杯中，置于塑料大棚，移栽7天后即可上市。
[0053]实施例3
[0054]一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤:
[0055](I)外植体选取与消毒:
[0056]①选取生长健壮的南美叉柱花幼嫩的枝条作为外植体，
[0057]②用中性洗涤剂洗涤洗枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分，
[0058]③在超净工作台上，先用70%酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3-5次，每次3_5min，
[0059]④立即转入0.3 %的升未溶液中消毒8-12min，最后用无菌水洗涤3_5次，每次3-5min，得到消毒外植体；
[0060](2)改良MS培养基的制备:
[0061]改良MS培养基的配方为:用Ca(NO3)2.4H20代替原MS培养基中的CaCl2.2H20并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；其中Ca(NO3)2.4Η20的浓度为120mg/L，抗坏血酸的浓度为 8mg/L ；
[0062](3)不定芽诱导:
[0063]将步骤(I)得到的消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽或双芽茎段，然后接种于用于不定芽诱导的培养基，进行诱导培养22天，得到南美叉柱花不定芽；诱导培养条件如下:温度为26±3°C，湿度为80%，光照时间为15小时/天，光照强度为1000-12001X ;所述用于不定芽诱导的培养基的配方为:在所述改良MS培养基上添加6-BA、KT以及NAA ;其中6-BA的浓度为5mg/L，KT的浓度为lmg/L，NAA的浓度为0.5mg/L ；
[0064](4)继代增殖:
[0065]将步骤(3)得到的南美叉柱花不定芽接入用于继代增殖的培养基，进行继代培养20-25天，得到南美叉柱花无菌苗；继代增殖培养条件如下:温度为26±3°C，湿度为65%，光照时间为15小时/天，光照强度为800-12001X ;所述用于继代增殖的培养基的配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及NAA，其中6-BA的浓度为2mg/L，KT的浓度为2mg/L，NAA的浓度为5mg/L ；
[0066](5)无菌生根:
[0067]将步骤(4)获得的南美叉柱花无菌苗进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入用于无菌生根的培养基中进行生根培养20天，得到南美叉柱花幼苗；生根培养条件如下:培养温度为26±3°C，湿度为65%，光照时间为15小时/天，光照强度为1000_12001x ；所述用于无菌生根的培养基的配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，其中IBA的浓度为lmg/L，NAA的浓度为5mg/L ；
[0068](6)炼苗与移栽:
[0069]步骤(5)中南美叉柱花幼苗生长至根长0.5?2cm、苗高3_4cm后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养5-7天，然后洗净根部培养基，移入采用64孔的穴盘，消毒后的水池，塑料大棚，遮光率75-80%的遮阳网；经室内炼苗5?7天后用消毒后的岩棉包裹好组培苗根部，放入直径为5?1cm的镂空塑料杯中，置于塑料大棚，移栽5-7天后即可上市。
【权利要求】
1.一种南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤:(I)外植体选取与消毒，(2)培养基的制备，(3)不定芽诱导，⑷继代增殖，(5)无菌生根以及(6)炼苗与移栽，其特征在于，所述的培养基的制备方法如下: (1)改良MS培养基的制备，配方为^Ca(NO3)2.4Η20代替原MS培养基中的CaCl2.2Η20并添加抗坏血酸，其他组分均无变化；在改良MS培养基中Ca(NO3)2.4Η20的浓度为95-120mg/L，抗坏血酸的浓度为3_8mg/L ； (2)制备用于不定芽诱导的培养基，配方为:在所述改良MS培养基上添加6-BA、KT以及NAA ;在不定芽诱导培养基中6-BA的浓度为0.05-5mg/L，KT的浓度为0.l_lmg/L，NAA的浓度为 0.05-0.5mg/L ； (3)制备用于继代增殖的培养基，配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加6-BA、KT以及NAA，在继代增殖培养基中6-BA的浓度为0.5-2mg/L，KT的浓度为0.l_2mg/L，NAA的浓度为 0.05-5mg/L ； (4)制备用于无菌生根的培养基，配方为:在所述改良MS培养基的基础上添加IBA和NAA，在生根培养基中IBA的浓度为0.1-lmg/L，NAA的浓度为0.5_5mg/L。
2.如权利要求1所述的南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在改良MS培养基中Ca(NO3)2.4H20的浓度为112mg/L，抗坏血酸的浓度为5mg/L。
3.如权利要求1所述的南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在所述用于不定芽诱导的培养基中6-BA的浓度为lmg/L，KT的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L0
4.如权利要求1所述的南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在所述用于继代增殖的培养基中6-BA的浓度为lmg/L，KT的浓度为0.5mg/L+NAA 0.2mg/L。
5.如权利要求1所述的南美叉柱花的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在所述用于无菌生根的培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为lmg/L。
【文档编号】A01H4/00GK104488722SQ201410819419
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】王继华, 张木清, 徐世强 申请人:广西大学