一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法
【专利摘要】本发明公开了一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，是选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术。本发明提供的方法聚合了烟草普通花叶病和黑胫病的抗性，获得了双抗种质资源，与传统杂交育种方法相比，可以明显减轻育种的工作强度、缩短育种的周期，具有效率高、选育周期短的优点；选育的品种虽然农艺性状离生产应用还有差距，但创建的聚合抗性种质与常规栽培推广的品种可以实现正常杂交，可用于优良品种的抗性改良。
【专利说明】一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草育种【技术领域】，具体涉及一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质 资源的选育方法。
【背景技术】
[0002] 烟草母本起源单倍体育种是栽培烟草(母本）与非洲烟a/ricafla) (父本）杂交产生的母本起源的单倍体（BurkL.G.，WernsmanD.U. 1979.Maternal HaploidsofNicotianatabacumL.fromSeed.Science. 206:585. )〇 这些F1 种子 播种后，只有孤雌生殖的烟苗和少数混倍体存活下来，那些腺毛密度小、叶片薄圆的烟苗 即为单倍体。处于绝对领先地位的美国在烟草母本起源单倍体育种新技术实践中得到了 广泛使用，选育出NC2000、NC71等优良品种。因此，在单基因控制的显性抗烟草普通花叶 病（TobaccoMosaicVirusTMV)基因N(Lewi 2005.MolecularandGenetic CharacterizationofNicotianatabacumL.ChromosomeSegmentsinResistant TobaccoAccessions.CropScience. 45:2355.)和来源于况/?7應的单基 因控制的显性抗黑胚病基因PhP(Johnson<9 (a/. 2002. Marker-AssistedSelectionforResistancetoBlackShankDiseaseinTobacco. PlantDisease. 86:1303-1309.)等单抗烟草栽培品种成功选育的基础上，采用母本来源 单倍体育种技术，为双抗烟草普通花叶病和黑胫病种质资源的创建提供了可能。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法。
[0004] 本发明的目的是这样实现的，选择抗黑胫病的Coker371材料为母本，抗烟草普通 花叶病的烟草品种Cokerl76为父本，采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助 选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以下步骤： A、 杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料； B、 母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟为父本，进 行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到 单倍体烟苗； C、 抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍 体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得 加倍单倍体烟苗； D、 抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单 倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花 叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为双抗加倍单倍体植物，常规繁种 获得的种子即可作为种质资源进行保存。
[0005] 本发明采用杂交聚合抗性、母本来源单倍体育种技术、分子标记辅助选择和常规 抗病性鉴定相结合的方法创建新种质。先将抗黑胫病的Coker371与抗烟草普通花叶病的 烟草品种Cokerl76进行杂交；以获得的杂种材料为母本，以非洲烟 为父本，进行远缘杂交；将获得的杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育 苗，待长出3片真叶后选择叶缘圆形、叶缘中部略凹、2片真叶有明显凹痕、腺毛少的幼苗即 为单倍体烟苗；再选择有抗TMV的N基因及抗黑胫病的PhP基因分子标记的单倍体烟苗培 养至现蕾期，取中部叶片中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体植株； 选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基 部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花叶病和黑胫病常规抗性鉴定验证，即获得兼抗这 两种病害的加倍单倍体植株，常规繁种获得的种子就可作为种质资源进行保存。本方法不 仅具有效率高、选育周期短的优点，而且创建的聚合抗性种质可用于优良品种的抗性改良。
[0006] 本发明具有以下优点及效果： 1、本发明提供的方法聚合了烟草普通花叶病和黑胫病的抗性，获得了双抗种质资源， 与传统杂交育种方法相比，可以明显减轻育种的工作强度、缩短育种的周期，具有效率高、 选育周期短的优点。
[0007] 2、选育的品种虽然农艺性状离生产应用还有差距，但创建的聚合抗性种质与常规 栽培推广的品种可以实现正常杂交，可用于优良品种的抗性改良。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1为聚合双抗烟草普通花叶病和黑胫病种质资源的选育过程示意图； 图2为C〇ker371XC〇kerl76双抗杂交种与非洲烟杂交获得单倍体材料，其中，a为目 标单倍体材料，b为单倍体现蕾，c为二倍体与单倍体花器比较； 图3为Coker371XCokerl76双抗单倍体分子标记筛选；其中：a为MIOObp标准 分子量，1为Cokerl76,2为Fl杂交种，3-7为单倍体植株（111，113，114，117，118)，8为红大； b为MIOObp标准分子量，1为红大，2为Coker371，3为Fl杂交种，4-8为单倍体植株 (H1，H3，H6，H7，H8); 图4为双抗单倍体组培加倍，其中a为外植体材料，b为外植体丛生芽萌发，c为目标 丛生芽筛选，d为加倍单倍体； 图5为双抗单倍体组培加倍材料TMV及黑胫病常规抗性接种鉴定，其中a为TMV抗性 鉴定鉴定，1为RBST，2为红大；b黑胫病抗性鉴定，1为RBST，2为红大； 图6为双抗单倍体组培加倍材料TMV及黑胫病抗性相关分子标记分析，其中，a为抗 黑胫病PhP基因RAPD分析M100bp标准，1为红大2-3为RBST，4-5为Coker371，6为 Cokerl76,7SH20;b抗TMV的N基因电泳分析M100bp标准，1为红大2-3为RBST，4为 Cokerl76,5-6 为Coker371，7SH20。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基 于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0010] 本发明所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，是选择抗黑胫 病的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker176为父本，采用杂种聚合 抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括 以下步骤： A、 杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料； B、 母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟为父本，进 行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到 单倍体烟苗； C、 抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍 体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得 加倍单倍体烟苗； D、 抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单 倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花 叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为双抗加倍单倍体植物，常规繁种 获得的种子即可作为种质资源进行保存。
[0011] B步骤中所述的点播育苗是将杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规 程育苗。
[0012]C步骤中N基因及PhP基因分子标记的引物分别为： N基因F: 5，-ACCAGAATGATATGTTCCAC-3，； N基因R:5，-GGACTCAACGTTAATTCTCTG-3' ；
[0013]C步骤中N基因及PhP基因分子标记引物扩增的特征谱带分别为545bp、770bp。
[0014] 若未特别指明，实施例和应用例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常 规手段。
[0015] 本发明采用杂种聚合抗性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴 定相结合的育种技术，具体包括以下步骤： 1、 杂种聚合抗性：将抗黑胫病的Coker371和抗烟草普通花叶病的烟草品种Cokerl76 进行杂交； 2、 母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟为父本，进行 远缘杂交；再将获得的杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育苗，待长出 3片真叶后选择叶缘圆形、叶缘中部略凹、2片真叶有明显凹痕、腺毛少的幼苗即为单倍体 烟苗； 3、 抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍 体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍 体烟苗； 4、 抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单 倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花 叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为抗性加倍单倍体植株，常规繁种 获得的种子就可作为种质资源进行保存。
[0016]本发明的具体操作如下： 1材料和方法 1.1材料 烤烟品种红花大金元、Coker371、Cokerl76、非洲烟（况a/rica/?a)。
[0017] 1.2 方法 1. 2. 1杂种聚合抗性 将抗黑胫病Coker371和抗烟草普通花叶病的Cokerl76进行杂交。
[0018] 1. 2. 2母本来源单倍体烟苗的选择 以Cokerl76XCoker371的杂交材料为母本，以况为父本，进行远缘杂 交。再将获得的杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程育苗，待长出3 片真叶后，参考前人（BurkL.G.，WernsmanD.U. 1979.MaternalHaploidsof NicotianatabacumLfromSeed.Science. 206:585;WernsmanE.A. ,etal.1989. Androgeneticvs.GynogeneticDoubledHaploidsofTobacco.CropScience29: 1151-1155;LewisandRose. 2011.IdentificationofTobaccoHaploidsonthe BasisofTransgenicOverexpressionofPAPlfromArabidopsisthaliana.Crop Science51: 1491-1497.)的方法，进行单倍体苗期形态鉴别，选择真叶叶缘圆形、叶缘中 部略凹、2片真叶有明显凹痕、腺毛少的单倍体烟苗。单倍体诱导频率=(诱导的单倍体数/ 种子数量）X100%。
[0019] 1. 2. 2抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍 按文献（Lewietal. 2005.MolecularandGeneticCharacterizationof NicotianatabacumL.ChromosomeSegmentsinResistantTobaccoAccessions.Crop Science. 45:2355；(Johnsonetal. 2002.Marker-AssistedSelectionforResistance toBlackShankDiseaseinTobacco.PlantDisease. 86:1303-1309.)方法开展抗 TMV、黑胫病分子标记辅助筛选。选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍体烟苗培养至 现蕾期，取中部叶片中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得加倍单倍体植株。黑胫 病接种采用创伤贴接法，以烟株凋萎死亡表示高感，存活为高抗。参照国家标准方法（GB/T 23224-2008烟草品种抗病性鉴定）进行TMV抗性鉴定评价。
[0020] 2结果和分析 2. 1单倍体诱导频率比较 供试材料与# 杂交种播种25d后发现，远缘杂交后代大部分苗已致死，存活 的烟苗中，多数为混倍体，而两片真叶表现凹痕的烟苗为单倍体苗。
[0021] 表1单倍体诱导频率
【权利要求】
1. 一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征在于选择抗黑胫病 的Coker371材料为母本，抗烟草普通花叶病的烟草品种Coker 176为父本，采用杂种聚合抗 性、母本来源单倍体、分子标记辅助选择和常规抗病性鉴定相结合的育种技术，具体包括以 下步骤： A、 杂种聚合抗性：将所述母本和所述父本杂交，获得双抗杂种材料； B、 母本来源单倍体烟苗的选择：以获得的双抗杂种材料为母本，以非洲烟为父本，进 行远缘杂交，将获得的杂交种点播育苗，待长出3片真叶后进行单倍体苗期形态鉴别得到 单倍体烟苗； C、 抗性母本来源单倍体的筛选和组培加倍：选择有N基因及PhP基因分子标记的单倍 体烟苗培养至现蕾期，取中部叶片5cm大小中脉在普通MS培养基上直接诱导丛生芽，获得 加倍单倍体烟苗； D、 抗性母本来源单倍体加倍种质的建立：选择有N基因及PhP基因分子标记的加倍单 倍体烟苗采用幼苗喷雾接种TMV及菌丝块茎基部创伤法接种黑胫病菌进行抗烟草普通花 叶病和黑胫病常规抗性鉴定，同时兼抗这两种病害的，即为双抗加倍单倍体植物，常规繁种 获得的种子即可作为种质资源进行保存。
2. 根据权利要求1所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征 在于B步骤中所述的点播育苗是将杂交种点播漂浮盘或塑料盘中按漂浮或湿润育苗规程 育苗。
3. 根据权利要求1所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征 在于C步骤中N基因及PhP基因分子标记的引物分别为： N 基因 F : 5，-ACCAGAATGATATGTTCCAC-3，； N 基因 R:5，-GGACTCAACGTTAATTCTCTG-3' ； PhP 基因（RAPD):5，-TCCCATGCTG-3，。
4. 根据权利要求1所述的聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法，其特征 在于C步骤中N基因及PhP基因分子标记引物扩增的特征谱带分别为545bp、770bp。
【文档编号】A01H1/04GK104472345SQ201410819251
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】李永平, 陈学军, 肖炳光, 焦芳婵, 方敦煌, 刘勇, 张谊寒, 杨大海 申请人:云南省烟草农业科学研究院