本发明涉及组培技术，尤其涉及一种北美红栎的组培方法。
背景技术：
北美红栎(学名：Quercus rubra L.)树冠匀称，幼树卵圆形，随着树龄的增加逐渐变为圆形，叶子形状美丽，色彩鲜艳，叶片互生，叶子7至11裂。秋季叶色逐渐变为红色，充足的光照可以使秋季叶色更加鲜艳，嫩枝呈绿色或红棕色，坚果棕色。北美红栎生长速度较快，耐旱、耐寒、耐瘠薄、抗火灾、较耐荫，喜光照，萌蘖能力强，可耐-29℃低温。耐环境污染，对不同酸碱度的土壤适应能力强。北美红栎原产于美国东部，中国长江中下游也有分布，是优良的城市观赏树种。在街道、公园、校园和球场用作遮阴树，广泛用于城市绿化，同时具有生态价值，可用于地被恢复，特别适合大面积栽培。
由于利用种子进行播种繁殖存在一些局限性，扦插与嫁接繁育技术目前在我国生根成活率较低，因此加强其无性繁殖的研究，建立无性繁殖技术体系，提高我国北美红栎苗木的生产能力，能为北美红栎广泛应用于城市园林中提供技术保障。目前我国对于北美红栎组培的研究，无菌材料的保存率仅66％、茎芽诱导率仅达53％，即现有北美红栎组培存在繁殖慢，增殖系数低，成苗率低等缺点。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对上述问题，提出一种北美红栎的组培方法，该方法简便高效，成本低，诱导率高，增殖系数高，成活率高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种北美红栎的组培方法，包括以下步骤：
步骤一、切取北美红栎(沼生栎)植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.01～0.1mg/L细胞分裂素、0.01～0.1mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h、20～30天获得无菌芽苗；
步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～3.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.1～1.5mg/L细胞分裂素、0.01～0.1mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h、每10～30天更换新鲜培养基的条件下培养1～3个月，获得丛生芽苗；
步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.1～0.5mg/L(两种生长素组合，浓度均为0.1-0.5mg/L)生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的生根培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h条件下培养10～30天，获得再生植株；
步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在炼苗室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为20～30℃、湿度为60％～80％、光照强度为40～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得北美红栎(沼生栎)苗木，即完成北美红栎(沼生栎)的微繁方法。
进一步地，步骤一所述预处理包括以下步骤：(大连地区)5-6月份，晴天上午，选生长健壮、树形优美、无病虫害的优良母本，采集一年生枝条，剪成长约1.5-2.5cm的带腋芽茎段(优选为2cm)，用中性洗涤剂漂洗后，流水冲洗2h以上，后置于工作台备用。在超净工作台上，先用70％乙醇处理10-30s，后用0.1％升汞处理1-5min，然后用无菌水漂洗5次。。
进一步地，步骤一、切取北美红栎(沼生栎)植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.02-0.05mg/L细胞分裂素、0.01-0.04mg/L生长素、25～35g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20～30℃、湿度为50％～70％、光照强度为40～80μmol·m-2·s-1、每天光照15～20h、20～30天获得无菌芽苗。进一步地，步骤一中所述诱导培养基为MS培养基、1/2MS培养基、DKW培养基、WPM培养基或QL培养基，所述诱导培养基pH值为5～6，所述细胞分裂素为苄基腺嘌呤、玉米素、激动素或氯吡苯脲，所述生长素为萘乙酸或吲哚丁酸。
进一步地，步骤二、将获得的无菌芽苗切割成2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，接种到含1.1-1.5mg/L细胞分裂素、0.01-0.04mg/L生长素、25～35g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为50～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h、每10～30天更换新鲜培养基的条件下培养2～3个月，获得丛生芽苗。
进一步地，步骤二中所述增殖培养基为MS培养基、DKW培养基、WPM培养基或QL培养基，所述增殖培养基pH值为5～6，所述细胞分裂素为苄基腺嘌呤、玉米素、激动素或氯吡苯脲，所述生长素为萘乙酸或吲哚丁酸。
进一步地，步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.1-0.3(两种生长素组合，浓度均为0.1-0.3)mg/L生长素、20-30g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的生根培养基上，在温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～24h条件下培养10～30天，获得再生植株。
进一步地，步骤三中所述生根培养基为生长素为MS培养基、DKW培养基或WPM培养基，所述生根培养基pH值为5～6，所述生长素为萘乙酸和/或吲哚丁酸。
进一步地，步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在炼苗室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为20～30℃、湿度为60％～80％、光照强度为40～100μmol·m-2·s-1、每天光照12～18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得北美红栎(沼生栎)苗木，即完成北美红栎(沼生栎)的微繁方法。
进一步地，步骤四中所述栽培基质包含体积比如下的各组分：草炭土3份，珍珠岩1-3份。优选为草炭土3份，珍珠岩2份。
本发明北美红栎的组培方法步骤科学、合理，与现有技术相比较具有以下优点：
1、预处理简便，污染率低，无菌材料的保存率高，可达80％。
2、初代培养基的诱导率高，可达90％以上。
3、增殖培养基的增殖速度快、苗生长整齐一致、增殖系数高，可达7.0。
4、苗生长健壮，无需壮苗，可直接生根驯化移栽。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明：
实施例1
本实施例提供一种北美红栎的组培方法，包括以下步骤：
步骤一、切取北美红栎(沼生栎)植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.05mg/L细胞分裂素、0.05mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为25℃、湿度为60％、光照强度为60μmol·m-2·s-1、每天光照18h、25天获得无菌芽苗；
步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～3.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.5mg/L细胞分裂素、0.05mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为25℃、湿度为60％、光照强度为60μmol·m-2·s-1、每天光照18h、每20天更换新鲜培养基的条件下培养2个月，获得丛生芽苗；
步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.3mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂的生根培养基上，在温度为25℃、湿度为60％、光照强度为60μmol·m-2·s-1、每天光照20h条件下培养20天，获得再生植株；
步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在炼苗室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为25℃、湿度为80％、光照强度为80μmol·m-2·s-1、每天光照15h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得北美红栎(沼生栎)生长健壮，主茎笔直，长势一致的苗木，即完成北美红栎(沼生栎)的微繁方法。
上述预处理以大连地区为例，包括以下步骤：5-6月份，晴天上午，选生长健壮、树形优美、无病虫害的优良母本，采集一年生枝条，剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段，用中性洗涤剂漂洗后，流水冲洗2h以上，后置于工作台备用；在超净工作台上，先用70％乙醇处理10-30s，后用0.1％升汞处理1-5min，然后用无菌水漂洗5次。
其中步骤一中诱导培养基为MS培养基，pH值均为5，细胞分裂素为苄基腺嘌呤，生长素为萘乙酸；步骤二中增殖培养基为MS培养基，pH值均为5，细胞分裂素为苄基腺嘌呤，生长素为萘乙酸；步骤三中生根培养基为生长素为MS培养基，pH值均为5，生长素为萘乙酸和吲哚丁酸；步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土、2份的珍珠岩。
本实施例所述方法可使保存率达80％以上，初代培养基的茎芽诱导率可达90％以上；增殖快，增殖系数高，整齐一致，成苗率高。
实施例2
本实施例提供一种北美红栎的组培方法，包括以下步骤：
步骤一、切取北美红栎(沼生栎)植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.02mg/L细胞分裂素、0.08mg/L生长素、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20℃、湿度为80％、光照强度为20μmol·m-2·s-1、每天光照12、30天获得无菌芽苗；
步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～3.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.1mg/L细胞分裂素、0.01mg/L生长素、40g/L蔗糖和7g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为30℃、湿度为80％、光照强度为20μmol·m-2·s-1、每天光照20h、每10天更换新鲜培养基的条件下培养3个月，获得丛生芽苗；
步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.3mg/L生长素、30g/L蔗糖和5g/L琼脂的生根培养基上，在温度为30℃、湿度为40％、光照强度为100μmol·m-2·s-1、每天光照24h条件下培养10天，获得再生植株；
步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在炼苗室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为30℃、湿度为60％、光照强度为80μmol·m-2·s-1、每天光照18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得北美红栎(沼生栎)苗木，即完成北美红栎(沼生栎)的微繁方法。
上述预处理以大连地区为例，包括以下步骤：5-6月份，晴天上午，选生长健壮、树形优美、无病虫害的优良母本，采集一年生枝条，剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段，用中性洗涤剂漂洗后，流水冲洗2h以上，后置于工作台备用；在超净工作台上，先用70％乙醇处理10-30s，后用0.1％升汞处理1-5min，然后用无菌水漂洗5次。
其中步骤一中诱导培养基为DKW培养基，pH值均为6，细胞分裂素为玉米素，生长素为吲哚丁酸；步骤二中增殖培养基为WPM培养基，pH值均为5，细胞分裂素为玉米素，生长素为吲哚丁酸；步骤三中生根培养基为生长素为DKW培养基，pH值均为5，生长素为吲哚丁酸；步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土、2份的珍珠岩。
本实施例所述方法可使保存率达80％以上，初代培养基的茎芽诱导率可达90％以上；增殖快，增殖系数高，整齐一致，成苗率高。
实施例3
本实施例提供一种北美红栎的组培方法，包括以下步骤：
步骤一、切取北美红栎(沼生栎)植株个体的半木质化茎芽进行预处理，然后接种到含0.08mg/L细胞分裂素、0.04mg/L生长素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为30℃、湿度为40％、光照强度为60μmol·m-2·s-1、每天光照24h、30天获得无菌芽苗；
步骤二、将获得的无菌芽苗切割成1.5～3.0cm的带顶芽的茎段，接种到含0.5mg/L细胞分裂素、0.05mg/L生长素、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的增殖培养基上，在温度为20℃、湿度为70％、光照强度为30μmol·m-2·s-1、每天光照12h、每10天更换新鲜培养基的条件下培养2个月，获得丛生芽苗；
步骤三、挑选健壮的丛生芽苗，以单个芽苗为单位进行切离，将切离后的单个芽苗切割成长度为2.0～3.0cm的带顶芽的茎段，然后将茎段接种到含有0.4mg/L生长素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的生根培养基上，在温度为20℃、湿度为50％、光照强度为50μmol·m-2·s-1、每天光照12h条件下培养20天，获得再生植株；
步骤四、将株高达4cm、根系发达、叶片展开的再生植株在炼苗室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为30℃、湿度为80％、光照强度为40μmol·m-2·s-1、每天光照18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得北美红栎(沼生栎)苗木，即完成北美红栎(沼生栎)的微繁方法。
上述预处理以大连地区为例，包括以下步骤：5-6月份，晴天上午，选生长健壮、树形优美、无病虫害的优良母本，采集一年生枝条，剪成长1.5-2.5cm的带腋芽茎段，用中性洗涤剂漂洗后，流水冲洗2h以上，后置于工作台备用；在超净工作台上，先用70％乙醇处理10-30s，后用0.1％升汞处理1-5min，然后用无菌水漂洗5次。
其中步骤一中诱导培养基为QL培养基，pH值均为6，细胞分裂素为氯吡苯脲，生长素为萘乙酸；步骤二中增殖培养基为QL培养基，pH值均为5，细胞分裂素为氯吡苯脲，生长素为萘乙酸；步骤三中生根培养基为生长素为WPM培养基，pH值均为6，生长素为萘乙酸；步骤四中栽培基质按体积份数比为3份的草炭土、2份的珍珠岩。
本实施例所述方法可使保存率达80％以上，初代培养基的茎芽诱导率可达90％以上；增殖快，增殖系数高，整齐一致，成苗率高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。