本发明涉及医学和生物学领域，具体涉及一种器官保存液及其制备方法。
背景技术：
器官移植被誉为二十世纪改变人类生活的重大生命科学进展，是世界公认的治疗多种终末期疾病的有效方法。据统计，仅我国每年器官衰竭的病人有100-150万，急需器官移植患者约30万。因此，如何进行离体器官的有效保存成为器官移植的重要支撑技术之一。
器官保存的根本目的是保持离体器官的活性，最大限度减少缺血对离体器官的各种损伤，使之更加适用于运送，并在手术后能够更加迅速地恢复功能。
一种有效的器官保存液必须具备五个方面的特点：1、减少因低温导致的细胞水肿；2、防止灌洗保存过程中的细胞间隙膨胀；3、防止细胞的酸化作用；4、防止或减轻再灌注损伤；5、提供再生高能磷酸化合物的底物。目前临床上常用的器官保存液大致有2种UW液和HTK液等。
UniversityWisconsin器官保存液(简称UW液)由美国Wisconsin大学发明，被公认为肝脏、胰、肾脏的标准保存液，临床证实其能够保存肾脏72小时，肝脏脏20-24小时。然而该保存液高钾低钠，易引起血管内皮细胞的损伤；胶体成分羟乙基淀粉(HES)对血液流变学影响较大，并易引起红细胞聚集；棉子糖、乳糖醛酸等原料成本高昂，大大增加器官移植患者临床费用；粘滞度高，影响灌注效果。
HTK液中含有组氨酸-组氨酸盐缓冲对，能够明显抑制组织酸化；其钠离子和钾离子浓度较低；粘度低，易于扩撒。然而从器官保存效果来看，供者肝脏脏表现出微循环障碍，HTK液的保存效果不及UW液。
目前，我国开发的细胞保存液有HC-A液(高渗枸橼酸嘌呤液)，由第二军医大学长征医院和上海市中心血站共同研制，其配制简单，稳定性好。但是HC-A液仅限于整块切取器官时体内灌洗和肾脏保存，肝脏、胰等器官保存仍需依赖UW液。
此外，研究人员还提供了多种改良的器官保存液，如中国专利申请200910014423公开了一种器官保存液及其制备方法，其特点是：在每1000ml器官保存液中含有：枸橼酸钾21～29mmol；一水合磷酸二氢钠6～10mmol；磷酸氢二钠30～45mmol；硫酸镁4～6mmol；氯化钾1～3mmol；右旋糖酐-4016-24g；甘露醇110～150mmol；腺苷4～6mmol；乙酰半胱氨酸4～6mmol；氢氧化钠4～6mmol；余量为注射用水。然而该保存液为双室包装，使用较为麻烦，不够简便，进而制备方法也较为繁琐复杂，应对紧急情况时灵活性相对较差；且该保存液仅对肾脏有较好效果，对其他器官的保存效果不佳。
又如，中国专利申请200810033425公开了一种器官保存液及其制备方法，该保存液由枸橼酸钠、枸橼酸钾硫酸镁、一水合磷酸二氢钠、氢氧化钠、腺嘌呤核苷、精氨酸、色氨酸、甘露醇和盐酸川弓嗪等成分组成。然而该保存液也仅对肾脏有较好效果，对其他器官的保存效果不佳。
综上所述，HTK液和Celsior液主要用于心脏的保存，使用范围受到限制；UW液作为标准的多器官保存液具有诸多优点，然而其粘度高、钾离子过高，且价格昂贵，处理与检验不便，并不适用于我国实际国情；国产HCA液及其改进配方主要用于肾脏保存，对其他器官保存效果不佳。近年来，随着肝脏脏、心脏和胰腺等大器官移植以及多器官联合移植在我的需求不断提高，缺乏高效、廉价、适用范围广并适应我国国情的多器官保存液成为限制我国器官移植技术发展的重要原因。
综上所述，开发一种新型廉价、高效，并适用于多器官保存的器官保存液有着十分重要的研究和临床价值。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种新型廉价、高效，并适用于多器官保存的器官保存液。
一个方面，本发明提供了一种器官保存液，所述的器官保存液按重量配比为，每1000mL含有：
优选地，所述的器官保存液按重量配比为，每1000mL含有：
更优选地，所述的器官保存液按重量配比为，每1000mL含有：
进一步优选地，所述的器官保存液按重量配比为，每1000mL含有：
器官保存液中的能量底物用于再生细胞的能量来源三磷酸腺苷，保持线粒体的功能活性，维持能量代谢。本发明所述的器官保存液中的能量底物为腺嘌呤核苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、色氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、琥珀酰辅酶A、乙酰辅酶A和辅酶Q10中的一种或几种；优选为腺嘌呤核苷、琥珀酸、辅酶Q10、色氨酸和α-酮戊二酸中的一种或几种；进一步优选为腺嘌呤核苷、辅酶Q10、色氨酸和琥珀酸中的一种或几种；更进一步优选为腺嘌呤核苷、辅酶Q10、色氨酸和琥珀酸。
低温保存状态下，由于缺血缺氧，代谢途径向糖酵解方向进行，同时促进乳酸的生成，导致组织酸化。组织酸化会损伤细胞并导致溶酶体不稳定，激活溶酶体并损伤线粒体的功能。因此器官保存液中应当含有酸碱缓冲系统，减少组织酸化，维持细胞内外环境相对稳定。本发明所述的器官保存液中的pH缓冲对为磷酸盐、碳酸氢盐和组氨酸中的一种或几种；优选为磷酸盐和组氨酸中的一种或两种；进一步优选为磷酸盐和组氨酸。
所述的器官保存液中还含有昆布多糖、海藻糖、昆布氨酸和甜菜碱中的一种或几种。
昆布多糖，是指昆布中的大分子多糖物质。昆布多糖具有广泛的生物学活性，例如研究表明昆布多糖净化酸性物质的作用。
海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类，在医学上已经成功地应用海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂，此外海藻糖还具有防止病毒传播的功能。
甜菜碱，用于抗肿瘤，降血压，抗消化性溃疡及胃肠功能障碍，治疗肝脏疾病等，此外还具有杀菌消炎的功能。
所述的器官保存液中昆布多糖的含量为，每1000mL含有1.0-10.0g。
所述的器官保存液中海藻糖的含量为，每1000mL含有1.0-16.0g。
所述的器官保存液中昆布氨酸的含量为，每1000mL含有8.0-27.0g。
所述的器官保存液中甜菜碱的含量为，每1000mL含有4.0-37.0g。
所述的器官保存液中还可以含有盐酸川弓嗪、精氨酸、乳糖酸、谷胱甘肽、别嘌呤醇和木棉糖中的一种或多种。
另一方面，本发明还提供的上述器官保存液的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)按照配方用量称取除了能量底物之外的其他成分，加总体积50-80％的注射用水搅拌均匀后，加入医用活性炭，搅拌5-20分钟后，使用0.45μm的滤膜过滤脱碳，得到溶液A；
(2)按照配方用量称取能量底物，采用注射用水溶解后，得到能量底物溶液，将能量底物溶液和步骤(1)的溶液A混合，补加注射用水至全量，搅拌均匀后，使用0.45μm的滤膜过滤，滤液即为器官保存液。
所述的制备方法步骤(1)中医用活性炭的加入量为每1000mL注射用水加入1-5g；优选为每1000mL注射用水加入2-4g,；进一步优选为每1000mL注射用水加入3g。
所述的制备方法步骤(1)中医用活性炭的平均粒径为2～5μm，优选为3～4μm，进一步优选为4μm。
与现有技术相比，本发明提供的伤口修复液具有以下有益效果：
(1)、本发明提供的器官保存液能够用于多种器官的冷却、灌洗和保存，可有效保存肾脏、肝脏、心脏和胰超过48小时，其中可保存肾脏72小时，肝脏48小时。
(2)、本发明将昆布氨酸用于器官保存液，昆布氨酸具有减压和抗菌作用，此外意外地发现昆布氨酸的加入能够明显延长对胰的保存时间，将心脏的保存时间由不足24h延长至48h。
(3)、本发明提供的器官保存液具有高钾低钠特性，能够减少细胞内外的离子交换和能量消耗，防止细胞水肿发生，有效延长保存时间。
(4)、本发明提供的器官保存液中去除了羟乙基淀粉，降低液体粘滞度，除了含有甘露醇外，还含有昆布多糖、和海藻糖，其中昆布多糖和海藻糖具有稳定生物膜的作用，由甘露醇、昆布多糖、和海藻糖三种成分构成混合渗透压调节剂，能够有效调剂渗透压，抑制细胞水肿和间隙膨胀，有效延长保存时间。
(5)、本发明提供的器官保存液中含有甜菜碱，甜菜碱具有保护细胞膜膜、保护酶、维持细胞渗透压的作用，本发明创造性地发现，将甜菜碱用于器官保存液能够一定程度抑制组织酸化、稳定溶酶体；并且能够一定程度抑制细胞水肿，能够有效延长对肝脏、肾脏的保存时间。
(6)、器官在冷冻保存时了，无氧糖酵解是其唯一的能量来源，此过程是pH依赖性的，pH下降及其他代谢产物的积累将抑制糖酵解过程，也将导致能量缺乏。因此，pH缓冲对在器官保存液中的功能非常重要，合适的pH缓冲对能够有效抵抗pH变化，并且进行跨细胞膜运输能力较弱，不会因进入细胞内而引起水肿。常规器官保存液采用单一种类的缓冲对，而本发明采用磷酸盐和组氨酸的双成分缓冲对，其效果明显优于各自的单一成分缓冲对，能够维持pH在8.0左右，pH在8.0左右的器官保存液有利于细胞内的H+通过跨膜转运向外流动，缓解细胞内酸中毒，是肝脏细胞pH在0-4℃时接近7.7左右，能减缓ATP分解，减轻对线粒体的损害，消除酸中毒对糖酵解关键酶1,6-二磷酸果糖激酶的抑制，增加ATP的合成。
(7)、由于不同物质的跨膜运输效率不同，因此进入细胞内部发挥作用的效果也不同。常规器官保存液采用单一种类的能量底物，如腺嘌呤核苷。而本发明采用多种类成分的能量底物，如腺嘌呤核苷、辅酶Q10、色氨酸和琥珀酸，多成分能量底物之间由于跨膜运输效率不同，因此可以相互弥补由于运输效率差异导致的能量合成不足。而本发明提供的含有多成分能量底物的器官保存液的保存效果也明显好于含有单一成分能量底物的器官保存液，在缺氧条件下为细胞提供能量，对再灌注损伤的修复作用更强，能够有效进行能量再生。
(8)本发明提供的器官保存液pH在6.2-8.4，接近生理pH，能够有效抑制组织酸化并防止细胞水肿，减少因pH差异引起的不良反应；渗透压在310-380mOsm/L，可以有效防止水肿，能够明显延长器官保存时间。
(9)、线粒体呼吸率(RCR)作为线粒体内能量合成的指标能够有效反应细胞和移植物的活性，RCR高于3.0的保存肝，移植后肝功能较好。本发明提供的器官保存液保存肾脏48小时，能够维持RCR在3.0左右，明显高于现有技术。
(10)、本发明提供的器官保存液所使用的成分之间无配伍禁忌，制备工艺简单，性质稳定，价格低廉。
综上所述，本发明提供的器官保存液廉价、高效，并适用于多器官保存。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
枸橼酸钾购自广东台山市新宁制药厂；枸橼酸钠购自陕西西安市第四制药厂；七水合硫酸镁购自上海宝达化工有限公司；琥珀酸、色氨酸、组氨酸、氯化钾、一水合磷酸二氢钠、磷酸氢二钠购自上海精化科技研究所；腺嘌呤核苷购自广东肇庆市星湖公司；、海藻糖购自南宁中诺生物工程公司；昆布氨酸购自陕西慈缘生物技术有限公司；昆布多糖购自西安通泽生物科技有限公司；甘露醇购自郑州皇朝化工产品有限公司；甜菜碱购自济南金辉化工有限公司；辅酶Q10购自西安康诺化工有限公司；光学显微镜购自上海光学仪器公司；离心机和恒温水浴箱购自上海医疗仪器公司。
实施例1一种器官保存液
配方，每1000mL含有：
制备方法：
(1)按照配方用量称取除了腺嘌呤核苷之外的其他成分，加总体积600mL的注射用水搅拌均匀后，加入平均粒径为2μm的医用活性炭1g，搅拌5分钟后，使用0.45μm的滤膜过滤脱碳，得到溶液A；
(2)按照配方用量称取腺嘌呤核苷，采用50mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，将能量底物溶液和步骤(1)的溶液A混合，补加注射用水至1000mL，搅拌均匀后，使用0.45μm的滤膜过滤，滤液即为器官保存液。
实施例2一种器官保存液
配方，每1000mL含有：
制备方法：
(1)按照配方用量称取除了腺嘌呤核苷、辅酶Q10和琥珀酸之外的其他成分，加总体积800mL的注射用水搅拌均匀后，加入平均粒径为3μm的医用活性炭5g，搅拌20分钟后，使用0.45μm的滤膜过滤脱碳，得到溶液A；
(2)按照配方用量称取腺嘌呤核苷、辅酶Q10和琥珀酸，采用100mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，将能量底物溶液和步骤(1)的溶液A混合，补加注射用水至1000mL，搅拌均匀后，使用0.45μm的滤膜过滤，滤液即为器官保存液。
实施例3一种器官保存液
配方，每1000mL含有：
制备方法：
(1)按照配方用量称取除了腺嘌呤核苷、辅酶Q10、色氨酸和琥珀酸之外的其他成分，加总体积700mL的注射用水搅拌均匀后，加入平均粒径为4μm的医用活性炭3g，搅拌15分钟后，使用0.45μm的滤膜过滤脱碳，得到溶液A；
(2)按照配方用量称取腺嘌呤核苷、辅酶Q10、色氨酸和琥珀酸，采用200mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，将能量底物溶液和步骤(1)的溶液A混合，补加注射用水至1000mL，搅拌均匀后，使用0.45μm的滤膜过滤，滤液即为器官保存液。
实施例4一种器官保存液
配方，每1000mL含有：
制备方法：
(1)按照配方用量称取除了腺嘌呤核苷和琥珀酸之外的其他成分，加总体积700mL的注射用水搅拌均匀后，加入平均粒径为4μm的医用活性炭3g，搅拌15分钟后，使用0.45μm的滤膜过滤脱碳，得到溶液A；
(2)按照配方用量称取腺嘌呤核苷和琥珀酸，采用200mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，将能量底物溶液和步骤(1)的溶液A混合，补加注射用水至1000mL，搅拌均匀后，使用0.45μm的滤膜过滤，滤液即为器官保存液。
实施例5一种器官保存液
配方，每1000mL含有：
制备方法：
(1)按照配方用量称取除了腺嘌呤核苷和辅酶Q10之外的其他成分，加总体积600mL的注射用水搅拌均匀后，加入平均粒径为5μm的医用活性炭2g，搅拌8分钟后，使用0.45μm的滤膜过滤脱碳，得到溶液A；
(2)按照配方用量称取腺嘌呤核苷和辅酶Q10，采用200mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，将能量底物溶液和步骤(1)的溶液A混合，补加注射用水至1000mL，搅拌均匀后，使用0.45μm的滤膜过滤，滤液即为器官保存液。
实施例6一种器官保存液
配方，每1000mL含有：
制备方法：
(1)按照配方用量称取除了腺嘌呤核苷、色氨酸和琥珀酸之外的其他成分，加总体积600mL的注射用水搅拌均匀后，加入平均粒径为5μm的医用活性炭2g，搅拌10分钟后，使用0.45μm的滤膜过滤脱碳，得到溶液A；
(2)按照配方用量称取腺嘌呤核苷、色氨酸和琥珀酸，采用200mL注射用水溶解后，得到能量底物溶液，将能量底物溶液和步骤(1)的溶液A混合，补加注射用水至1000mL，搅拌均匀后，使用0.45μm的滤膜过滤，滤液即为器官保存液。
对比例1一种器官保存液
配方和实施例3的区别为不含昆布多糖和海藻糖；
制备方法同实施例3。
对比例2一种器官保存液
配方和实施例3的区别为不含昆布氨酸；
制备方法同实施例3。
对比例3一种器官保存液
配方和实施例3的区别为不含甜菜碱；
制备方法同实施例3。
对比例4一种器官保存液
配方和实施例3的区别为不含组氨酸；
制备方法同实施例3。
对比例5一种器官保存液
配方和实施例3的区别为不含磷酸氢二钠和一水合磷酸二氢钠；
制备方法同实施例3。
对比例6一种器官保存液
配方和实施例3的区别为不含辅酶Q10、色氨酸和琥珀酸，且腺嘌呤核苷的含量为11.0g；
制备方法同实施例3。
实验例1猪肾脏低温保存期间的形态学改变
实验动物：健康成年实验用巴马小型猪，雌雄随机，体重25-30kg。
实验方法：
1、术前准备及麻醉：术前禁食16h，进水12h。供体采用基础麻醉，肌注氯胺酮1mg/kg诱导麻醉，异丙酚维持。
2、供肾切取：采用通用全肾快速切取技术。
3、保存：供肾获取后，分别于实施例1-6和对比例1-6制备的器官保存液中低温保存，以HCA-Ⅱ液(由第二军医大长征医院提供)为对照。
4、病理检查：在肾脏保存的第1、24、48、72小时，取肾脏实质标本，制作石蜡切片，进行光镜观察；制作电镜切片进行透射电镜形态学观察。
实验结果：
HCA-Ⅱ液组：保存24小时，光镜所见肾脏结构轻微改变，肾脏小球、肾脏小管结构轮廓清晰，间质轻度水肿；保存48小时，大部分肾脏小球毛细血管轮廓尚清，肾脏小管上皮广泛中到重度空泡样变性，间质水肿明显，刷状缘损害严重，可见肾脏小管上皮多发小灶状坏死；保存72小时，肾脏小球毛细血管部分已无正常轮廓，肾脏小管上皮广泛且严重变性并片状坏死，细胞间解离，间质水肿明显。电镜结果与光镜一致。
本发明实施例1-6组：在保存的48内，实施例1-6组的形态学改变和HCA-Ⅱ液组无明显差别；但保存72小时，肾脏组织轮廓较48小时未有明显恶化，未出现细胞破碎和片状坏死，恶化程度由强到弱排序依次为：实施例5、1、4、2、6、3。
本发明对比例1-6组：保存24小时较1小时即出现明显恶化，出现细胞破碎和片状坏死。
实验例2小型猪肝脏低温保存-再灌注期间的形态学改变
实验动物：同实验例1
实验方法：
1、术前准备及麻醉：同实验例1。
2、供肝切取：采用通用全肝快速切取技术。
3、保存-再灌注：供肝获取后进行低温保存，保存液为本发明实施1-5和对比例1-6制备的器官保存液，在保存的1、12小时和再灌注后1小时后，取标本进行光镜观察，以HCA-Ⅱ液和UW液(由第二军医大长征医院提供)为对照。
实验结果：
HCA-Ⅱ液组：保存1小时，肝组织形态结构基本正常，肝细胞轻度水肿；保存12小时，肝小叶结构尚清楚，部分肝板崩解，肝细胞普遍轻到中度气球样变，少量干细胞坏死；再灌注一小时后，肝血窦明显扩张，肝细胞肿胀，肝板大部分崩解，散在少量脂肪变性和少量坏死。
UW液组：保存1小时，肝组织形态结构基本正常，肝细胞轻度水肿；保存12小时，肝小叶结构尚清楚，肝细胞肿胀，有少量肝细胞成气球样变，小叶周边部分肝细胞有点状坏死。
本发明实施例1-6组：保存1小时，肝组织形态结构基本正常；保存12小时，肝组织形态结构基本正常，肝细胞轻度水肿，其它未有明显变化，肝组织形态学改变程度由强到弱依次为：1、4、2、5、6、3。
本发明对比例1-6组：保存1小时，肝小叶结构尚清楚，肝细胞肿胀，有少量肝细胞成气球样变，小叶周边部分肝细胞有点状坏死。
实验例3肾脏移植实验
动物模型：雌性杂种犬，体重13-15kg。
器官保存液：对照组：HCA-Ⅱ液和UW液；实验组：本发明实施例1-6和对比例1-6制备的器官保存液。
实验方法：术前12小时禁食，以3％戊巴比妥30mg/kg腹腔内注射麻醉。麻醉成功后，取腹正中切口，自剑突向下长约12cm，切开进腹。游离左肾及肾动静脉、输尿管，切断输尿管，长约7cm，在肾静脉和深动脉根部分别将其切断。立即取出肾脏至于各组保存液(0℃)200mL经肾动脉灌注肾脏，直至肾脏呈苍白色，将肾脏连同500mL保存液置于肾袋中，在0-4℃条件下储存。分别结扎实验动物肾动静脉及输尿管残端，关腹。术后立即给与头孢曲松钠1g静脉滴注。72小时后，同一实验犬按同样方法麻醉，按原切口打开腹腔，并向下延长至耻骨上方，游离右侧髂外动静脉，取出肾脏，肾静脉与髂外静脉以7-0prelene血管吻合线端侧吻合，肾动脉与髂外动脉端端吻合，开放血流后彻底止血。切开膀胱，留置导尿管。输尿管内置F4.5之双J管，以5-0羊肠线与膀胱吻合。随后切开实验犬右肾，关腹，手术结束。术后予补液(每日10％葡萄糖500mL、平衡液500mL)及头孢曲松钠1g直至实验动物开始自行进食。术后检测移植前后肾功能指标变化。术后观察期60天，达到60天的动物视为长期存活。
实验结果：
1、肾皮质低温保存期间细胞凋亡情况，凋亡指数如下所示：
2、线粒体呼吸控制率(RCR)测定结果如下所示：
3、存活时间：使用本发明实施例1-6制备的器官保存液的存活时间和UW液的存活时间相当，均明显高于HCA-Ⅱ液以及本发明中的对比例1-6；使用本发明实施例1-6制备的器官保存液的长期存活犬数量也明显多于HCA-Ⅱ液以及本发明中的对比例1-6。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。