本发明涉及topsentin类生物碱在抗植物病毒和病菌中的应用，属于农业防护技术领域。
背景技术：
海洋是人类物质资源的天然宝库，已知海洋生物的物种总数占地球生物的80％以上(jantibiot(tokyo)，1994，47，1425-1433)，目前从海绵、海兔、海鞘、海藻、鲨鱼、珊瑚等海洋生物中分离获得7000余种海洋天然产物，新发现的化合物还在以加速度递增。在已发现的化合物中包括萜类、多肽、甾体类、聚醚类、生物碱、大环内酯类、多糖等化合物，约50％具有各种生物活性，超过0.1％的化合物结构新颖，活性显著，极有可能开发成药(chem.rev.2015，115，9655-9706)。因此，从海洋天然产物中寻找新型活性药物先导已成为当今研究的热点。
topsentin类生物碱是一类含有双吲哚结构骨架的天然生物碱，广泛存在于海洋动物海绵中。自1987年，topsentin类生物碱topsentina(deoxytopsentin，1)，topsentinb1(topsentin，2)和topsentinb2(bromotopsentin，3)被首次分离报道以来，目前已有10个该类生物碱被分离并确定结构(结构式一)。其中包括双吲哚咪唑酮化合物1-6和双吲哚-4，5-二氢咪唑酮化合物7-10。
结构式一
1987年，比利时布鲁塞尔自由大学bartik小组首次从法国地中海海岸的浅水海绵topsentiagenitrix中分离得到topsentin类生物碱topsentina(deoxytopsentin，1)，topsentinb1(topsentin，2)和topsentinb2(bromotopsentin，3)，同时该小组发现分离的三个生物碱对虹鱼表现出毒性，ld值在15-20mg/l(can.j.chem.1987，65，2118-2121)。
1987年，比利时布鲁塞尔自由大学braekman小组以3-乙酰基吲哚(11)为原料经3步以8％的总收率完成了生物碱topsentina(deoxytopsentin，1)的首次全合成。3-乙酰基吲哚(11)与溴化铜反应得3-溴乙酰基吲哚(12)，再与1，1-二甲基肼进行亲核取代得关键中间体季铵盐(13)，在加热条件下季铵盐(13)重排然后偶联得生物碱topsentina(deoxytopsentin，1)，该路线总收率较低，且重排反应条件苛刻(结构式二)(bull.soc.chim.belg.1987，96，809-812)。
结构式二
结构式三
1988年，美国伊利诺伊大学香槟分校的rinehart研究小组从几种加勒比深海海绵spongosorites中分离得到已知生物碱topsentin(2，干含量0.1％)和bromotopsentin(3，干含量0.3％)，同时也分离到一种新型双吲哚类化合物4，5-dihydro-6″-deoxybromotopsentin(spongotinea，8，干含量0.005％)。为了验证topsentin(2)的结构，他们对topsentin(2)及其衍生物进行了合成，以3-氯乙酰基吲哚(14)及3-氯乙酰基-6-苄氧基吲哚(15)为原料，经水解，醋酸铜氧化，与氨水反应合环得topsentin苄基衍生物18，再经钯碳催化氢化得生物碱topsentin(2)，同时还得到topsentin(2)的几个衍生物，该方法缺点是反应选择性差，收率低(结构式三)。生物活性研究发现，topsentin(2)和bromotopsentin(3)在体外对hsv，vsv及coronavirusa-59等多种病毒有抑制活性。topsentin(2)在体外能抑制p388白血病细胞的生长(ic50＝3.0μg/ml)，也能抑制人结肠癌细胞hct-8、人肺癌细胞a-549和t47d的生长(ic50＝20μg/ml)。在体内能抑制p388(t/c137％，150mg/kg)和b16黑色素肿瘤细胞(t/c144％，37.5mg/kg)的生长。化合物4，5-dihydro-6″-deoxybromotopsentin(8)同样表现出不错的抗肿瘤活性，但抗病毒活性较差(j.org.chem.1988，53，5446-5453)。
1996年，美国先灵葆雅研究所的coval研究小组从巴哈马圣塔玛丽亚海滩西部海域的海绵spongosoritessp.中分离到生物碱bromotopsentin(3)，同时发现bromotopsentin(3)及其同系物具有很好的绑定α-1肾上腺素受体能力(表1)(bioorg.med.chem.lett.1996，6，2103-2106)。
表1.生物碱2，3的α-1ki值
1996年，法国兰斯大学的achab研究小组以钯催化的still反应为关键步骤，实现了生物碱deoxytopsentin(1)，topsentin(2)，bromotopsentin(3)和deoxybromotopsentin(bromodeoxytopsentin，4)的合成，路线收率较高，但操作条件较为苛刻，不易重复。二碘咪唑19在丁基锂条件下转化为锂中间体20，与醛21和22进行加成反应分别制得咪唑醇23和24，再经二氧化锰氧化得咪唑酮25和26，在钯催化下与3-碘吲哚27偶联得28和29，最后脱保护得deoxytopsentin(1)和topsentin(2)(结构式四)。3-碘吲哚27和30与咪唑醛31加成分别制得咪唑醇32和33，经二氧化锰氧化得咪唑酮34和35，在钯催化下与锡化物36偶联得37和38，最后脱保护得bromotopsentin(3)和deoxybromotopsentin(bromodeoxytopsentin，4)(结构式五)(tetrahedronlett.1996，37，5503-5506)。
1998年，日本京都药科大学的ohta研究小组，通过pb0催化的在咪唑环5-位的suzuki偶联反应及咪唑环2-位的酰化反应实现了topsentin(2)的合成。但路线较长，收率较低。三碘咪唑39经保护得40，钯催化下与3-吲哚硼酸41偶联得42，与格式试剂反应脱除碘得43，再在丁基锂存在下与44发生咪唑环2-位的酰化反应得45，最后三溴化硼脱甲基得topsentin(2)(结构式六)(heterocycles1998，48，1887-1901)。
结构式四
结构式五
结构式六
1999年，韩国韩南大学shin研究小组从济州岛海绵spongosoritesgenitrix中分离到4个topsentin类双吲哚生物碱deoxytopsentin(1)，bromotopsentin(3)，bromodeoxytopsentin(4)和isobromodeoxytopsentin(5)，其中bromodeoxytopsentin(4)和isobromodeoxytopsentin(5)为首次分离并确定结构。生物活性研究发现，bromodeoxytopsentin(4)和isobromodeoxytopsentin(5)对人白血病细胞k562有抑制活性，lc50分别为0.6μg/ml和2.1μg/ml(j.nat.prod.1999，62，647-649)。
2000年，意大利萨勒诺大学riccio研究小组从地中海海绵rhaphisialacazei中分离到6个topsentin类双吲哚生物碱deoxytopsentin(1)，topsentin(2)，bromotopsentin(3)，bromodeoxytopsentin(4)，topsentind(7)和4，5-dihydro-6″-deoxybromotopsentin(8)。生物活性研究发现，topsentin(2)，bromotopsentin(3)对人支气管肺癌(nsclc-n6)有抑制活性，ic50分别为12.0μg/ml和6.3μg/ml(j.nat.prod.2000，63，447-451)。
2000年，美国俄勒冈州立大学horne研究小组完成了生物碱topsentina(deoxytopsentin，1)。以吲哚(46)为原料，经草酰化再与氰化亚铜反应得3-氰基甲酰基吲哚(48)，钯碳氢气还原得3-氨乙酰基吲哚醋酸盐(49)，再在氨水中双分子合环得topsentina(1)，路线4步，总收率38％，但反应选择性不好，不能用于大量衍生物的制备(结构式七)(org.lett.2000，2，2121-2123)。并且申请人尝试过该路线，在合环制备咪唑环时适中拿不到产品，估计是文献作者进行了技术保留。
结构式七
2005年，韩国国立首尔大学shin研究小组从韩国西南部济州岛的海绵spongosoritessp.中分离得到4个topsentin类双吲哚生物碱deoxytopsentin(1)，bromotopsentin(3)，bromodeoxytopsentin(4)和4，5-dihydro-6″-deoxybromotopsentin(8)。生物活性研究发现，该类化合物具有抑制金黄色葡萄球菌srta酶活性和抑制金黄色葡萄球菌活性(表2)(bioorg.med.chem.lett.2005，15，4927-4931)。
表2.生物碱1，3，4和11抑制srta酶活性和抑制金黄色葡萄球菌活性。
2005年，韩国釜山国立大学jung研究小组从韩国济州岛海域海绵spongosoritessp.中分离到6个topsentin类双吲哚生物碱deoxytopsentin(1)，topsentin(2)，bromotopsentin(3)，bromodeoxytopsentin(4)，isobromodeoxytopsentin(5)和dibromodeoxytopsentin(6)，其中dibromodeoxytopsentin(6)为首次报道。生物活性研究发现，该类化合物对多种肿瘤细胞都有抑制活性(表3)(j.nat.prod.2005，68，711-715)。
表3.生物碱1-6抗癌活性a。
adataexpressedined50values(μg/ml).a549，humanlungcancer；sk-ov-3，humanovariancancer；sk-mel-2，humanskincancer；xf498，humancnscancer；hct15，humancoloncancer.
2006年，韩国国立首尔大学oh研究小组对生物碱deoxytopsentin(1)，bromotopsentin(3)，bromodeoxytopsentin(4)和4，5-dihydro-6″-deoxybromotopsentin(8)进行了抗菌和抗癌活性研究，化合物deoxytopsentin(1)表现出非常好的抗菌(表4)和抗癌活性(表5)(biol.pharm.bull.2006，29，570-573)。
表4.生物碱1，3，4和8对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的离体抑制活性。
mrsa＝methicillin-resistantstaphylococcusaureus.
表5.生物碱1，3，4和8抗癌活性。
ags：humangastricadenocarcinoma；l1210：mouselymphocyticleukemia；bc：humanbreastcancer；hepg2：hepatoma.
2007年，韩国釜山国立大学jung研究小组从韩国济州岛海域海绵spongosoritessp.中分离到3个topsentin类双吲哚生物碱spongotinea(4，5-dihydro-6″-deoxybromotopsentin，8)，spongotineb(9)和spongotinec(10)，spongotineb(11)和spongotinec(12)为首次报道。生物活性研究发现spongotinesa(8)和c(10)具有很好的抗癌活性，能对多种癌细胞产生抑制(表6)(j.nat.prod.2007，70，2-8)。
表6.化合物spongotinea-c(8-10)抗癌活性a。
adataexpressedined50values(μg/ml).a549，humanlungcancer；sk-ov-3，humanovariancancer；sk-mel-2，humanskincancer；xf498，humancnscancer；hct15，humancoloncancer.bthesolubilityofthesamplewasnotgood.
2007年，法国约瑟夫傅立叶大学的denis研究小组完成了生物碱topsentina(1)，isobromodeoxytopsentin(5)，topsentind(7)和spongotineb(9)的全合成，其中isobromodeoxytopsentin(5)，topsentind(7)和spongotineb(9)为首次全合成。路线步骤较短，但原料的制备较为困难。吲哚(46)和6-溴吲哚(50)与草酰氯反应得酰氯47和51，与三丁基锡烷反应再经s8和哌啶处理得52和53，与碘甲烷反应得亚胺盐54和55。氨基醇56经钯催化还原得57，酸性条件下脱保护基得盐酸盐58，与亚胺盐54和55反应得生物碱topsentind(7)和spongotineb(9)，再经ibx氧化脱氢得生物碱topsentina(1)和isobromodeoxytopsentin(5)(结构式九)(j.org.chem.2007，72，3972-3975)。
结构式九
由于topsentin类生物碱天然含量较低，且合成较为困难，生物活性研究还不够深入，主要集中在抗癌活性方面，在抗病毒和杀菌方面的研究还处于初级阶段，并且在抗植物病毒和病菌中的应用还没有报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供topsentin类生物碱在抗植物病毒和病菌中的应用。本专利的topsentin类生物碱具有很好的抗植物病毒和病菌活性。
本发明的topsentin类生物碱是具有如下结构式十所示结构的化合物i-1～i-8：
结构式十
本发明的topsentin类生物碱i-1～i-8参照结构式九所示的方法制备(j.org.chem.2007，72，3972-3975)。
本发明首次发现topsentin类生物碱i-1～i-8表现出很好的抗植物病毒和病菌活性，能很好地抑制烟草花叶病毒(tmv)和黄瓜枯萎，花生褐斑，苹果轮纹，小麦纹枯，玉米小斑，西瓜炭疽，水稻恶苗，番茄早疫，小麦赤霉，马铃薯晚疫，辣椒疫霉，油菜菌核，黄瓜灰霉，水稻纹枯14种植物病菌。
具体实施方式
下述的实施例和生测试验结果可用来进一步说明本发明，但不意味着限制本发明。
实施例1：topsentin类生物碱i-1～i-8的实验数据
i-1：黄色固体，熔点291-293℃，1hnmr(400mhz，dmso-d6+1％tfa)δ12.54(s，1h)，11.67(s，1h)，8.80(s，1h)，8.35-8.27(m，1h)，8.14(s，2h)，8.04(d，j＝7.7hz，1h)，7.67-7.58(m，1h)，7.53(d，j＝7.9hz，1h)，7.37-7.32(m，2h)，7.23(dt，j＝14.9，6.9hz，2h).13cnmr(100mhz，dmso-d6+1％tfa)δ171.5，140.6，138.7，136.8，136.4，130.9，125.7，125.7，124.1，124.1，123.0，121.2，120.4，119.3，115.8，113.5，112.8，112.2，110.7，102.3.hrms(esi)calcdforc20h15n4o(m+h)+327.1240，found327.1248.
i-2：黄色固体，熔点227℃(分解)，1hnmr(400mhz，dmso-d6+1％tfa)δ12.46(s，1h)，11.74(s，1h)，11.12(br，tfa)，8.92(s，1h)，8.33(m，1h)，8.11(s，1h)，8.04(s，1h)，8.02(d，j＝7.2hz，1h)，7.71(s，1h)，7.61-7.59(m，1h)，7.35-7.32(m，2h)，7.29(s，1h).13cnmr(100mhz，dmso-d6+1％tfa)δ174.1，143.4，137.9，137.4，136.6，132.6，132.5，126.4，125.5，123.6，122.9，122.5，121.5，118.3，118.3，114.7，113.7，112.6，105.8，99.6.hrms(esi)calcdforc20h14brn4o(m+h)+405.0346，found405.0348.
i-3：黄色固体，分解温度245℃，1hnmr(400mhz，dmso-d6+1％tfa)δ15.02(brs，tfa)，12.47(s，1h)，11.75(s，1h)，8.60(s，1h)，8.25-8.10(m，3h)，8.03(d，j＝6.7hz，1h)，7.54(d，j＝7.1hz，1h)，7.32-7.18(m，2h)，7.11(s，1h)，6.99(d，j＝7.9hz，1h)，3.85(s，3h).13cnmr(100mhz，dmso-d6+1％tfa)δ171.7，161.9，157.4，141.1，138.1，136.6，131.2，125.8，124.3，122.5，122.1，120.5，119.8，119.5，116.2，113.9，112.7，112.4，102.8，96.0，55.4.hrms(esi)calcdforc21h17n4o2(m+h)+357.1346，found357.1351.
i-4：黄色固体，熔点283-285℃，1hnmr(400mhz，dmso-d6+1％tfa)δ13.63(brs，tfa)，12.27(s，1h)，11.72(s，1h)，8.56(s，1h)，8.14(s，2h)，8.06(d，j＝8.6hz，1h)，8.02(d，j＝7.7hz，1h)，7.53(d，j＝7.8hz，1h)，7.23(dt，j＝14.8，7.0hz，2h)，6.95(s，1h)，6.84(d，j＝8.2hz，1h).13cnmr(100mhz，dmso-d6+1％tfa)δ171.9，155.0，141.4，138.1，137.4，136.4，125.3，124.1，122.2，121.9，120.3，119.4，118.6，116.6，116.3，113.7，112.8，112.2，110.9，97.8.hrms(esi)calcdforc20h15n4o2(m+h)+343.1190，found343.1185.
i-5：深绿色固体，分解温度278℃，1hnmr(400mhz，dmso-d6+1％tfa)δ14.79(brs，tfa)，12.63(s，1h)，11.80(s，1h)，8.90(d，j＝2.6hz，1h)，8.26(d，j＝8.6hz，1h)，8.14(d，j＝2.3hz，1h)，8.11(s，1h)，8.02(d，j＝8.6hz，1h)，7.83(s，1h)，7.74(s，1h)，7.48(d，j＝8.4hz，1h)，7.32(d，j＝8.4hz，1h).13cnmr(100mhz，dmso-d6+1％tfa)δ171.8，155.0，141.4，138.1，137.4，136.4，125.3，124.1，122.2，121.9，120.2，119.4，118.6，116.3，113.8，112.8，112.2，97.8.hrms(esi)calcdforc20h13br2n4o(m+h)+482.9451，found482.9427.
i-6：黄色固体，熔点222-225℃，1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ12.15(s，1h)，10.98(s，1h)，8.97-8.97(m，1h)，8.90(s，1h)，8.28(d，j＝5.5hz，1h)，7.57(d，j＝8.0hz，1h)，7.53(d，j＝5.4hz，1h)，7.39(d，j＝8.2hz，1h)，7.31(s，1h)，7.26(dd，j＝4.8，2.6hz，2h)，7.09(t，j＝7.4hz，1h)，6.97(t，j＝7.3hz，1h)，5.36(t，j＝9.2hz，1h)，4.19-4.14(m，1h)，3.79-3.63(m，1h).13cnmr(100mhz，dmso-d6)δ179.6，162.1，138.4，136.8，136.4，126.1，125.5，123.2，122.5，122.4，121.3，121.1，118.9，118.5，117.1，113.7，112.5，111.7，27.7，26.3.hrms(esi)calcdforc20h17n4o(m+h)+329.1397，found329.1405.
i-7：黄色固体，熔点254-256℃，1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ12.11(s，1h)，11.11(s，1h)，8.89(s，1h)，8.27(s，1h)，7.57(s，1h)，7.52(br，2h)，7.34(s，1h)，7.25(br，2h)，7.10(d，j＝7.2hz，1h)，5.32(m，1h)，4.03(m，1h)，3.62(m，1h).13cnmr(100mhz，dmso-d6)δ180.2，162.6，138.8，138.2，136.8，126.6，125.0，124.0，123.7，122.8，121.8，121.2，118.1，114.7，114.4，114.2，113.0，50.0，31.2.hrms(esi)calcdforc20h16brn4o(m+h)+407.0502，found407.0506.
i-8：黄色固体，熔点213-215℃，1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ11.97(s，1h)，10.98(s，1h)，8.76(s，1h)，8.11(d，j＝8.8hz，1h)，7.56(d，j＝7.6hz，1h)，7.30(d，j＝2.4hz，1h)，7.09(t，j＝7.2hz，1h)，7.02(d，j＝2.4hz，1h)，6.97(t，j＝7.2hz，1h)，6.89(dd，j＝2.0hz，1h)，5.35(t，j＝9.6hz，1h)，4.15(m，1h)，3.71(m，1h).13cnmr(100mhz，dmso-d6)δ207.0，179.9，162.5，157.1，138.1，138.0，137.3，126.0，123.0，122.4，121.6，120.4，119.4，119.0，117.5，114.3，112.4，112.2，96.2，55.7，31.2.hrms(esi)calcdforc21h19n4o2(m+h)+359.1503，found359.1508.
实施例2：抗烟草花叶病毒活性的测定，测定程序如下：
1、病毒提纯及浓度测定：
病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒sop规范执行。病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
2、化合物溶液配制：
称量后，原药加入dmf溶解，制得1×105μg/ml母液，后用含1‰吐温80水溶液稀释至所需浓度；宁南霉素制剂直接兑水稀释。
3、离体作用：
摩擦接种珊西烟适龄叶片，用流水冲洗，病毒浓度10μg/ml。收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于1‰吐温水及药剂中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次。3d后记录病斑数，计算防效。
4、活体保护作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(500目)，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/ml，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数，计算防效。
5、活体治疗作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/ml，接种后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。3d后记录病斑数，计算防效。
6、活体钝化作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/ml，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1‰吐温80水溶液对照。3d后数病斑数，计算结果。
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％
表7topsentin类生物碱i-1～i-8的抗tmv活性测试结果：
从表7中可见topsentin类生物碱i-1～i-8表现出很好的抗tmv活性，i-3、i-5、i-7抗tmv活性较好，超过了病毒唑，具备极大的开发价值。
实施例3：抗菌活性测试，测定程序如下：
a.离体杀菌测试，菌体生长速率测定法(平皿法)：
将一定量药剂溶解在适量丙酮内，然后用含有200ug/ml乳化剂水溶液稀释至所需浓度，然后各吸取1ml药液注入培养皿内，再分别加入9ml培养基，摇匀后制成50ug/ml的含药平板，以添加1ml灭菌水的平板做空白对照。用直径4mm的打孔器沿菌丝外缘切取菌盘，移至含药平板上。每处理重复三次。将培养皿放在24±1℃恒温培养箱内培养。48小时后调查各处理菌盘扩展直径，求平均值，与空白对照比较计算相对抑菌率。
表8topsentin类生物碱i-1～i-8的离体杀菌活性测试结果：
由表8中数据可以看出，topsentin类生物碱i-1～i-8表现出很好的抗植物病菌活性，化合物i-4对苹果轮纹和小麦纹枯的抑制率达到90％以上，ec50值分别为36mg/kg和6mg/kg。化合物i-6对多种病菌的抑制率达到了50％以上，具有广谱的杀菌活性。
b.活体杀菌测试，植株喷雾法：
称量各化合物，定量dmso溶解后加入1‰吐温80水溶液，配制成所需浓度待测液。
供试黄瓜、小麦幼苗培养于南开大学生测楼日光温室。黄瓜第一片真叶完全展开后，喷雾处理，喷液量1ml/处理，喷雾压力0.7kg/cm2，喷雾距离15cm。小麦一叶一心期处理，方法与黄瓜处理过程相同。
药剂处理后24h，黄瓜灰霉与黄瓜霜霉均采用喷雾接种5×105个/ml的孢子囊悬浮液于药剂处理后的黄瓜真叶叶背，至叶片呈水浸状止。暗环境保湿培养24h，后移至温室环境下正常培养。48h后调查结果。小麦苗则采用沉降接种法，接菌后7d调查结果。结果调查采用分级方法，以“100”级代表无病，即抑制率100％；“0”级代表最严重的发病程度，抑制率为0，记录。
表9topsentin类生物碱i-1～i-8的活体杀菌活性测试结果：
从表5中数据可以看出，topsentin类生物碱i-1～i-8同样表现出不错的活体杀菌活性。