本发明属于大黄鱼标记领域，特别涉及一种用茜素红标记大黄鱼的方法。
背景技术：
标志重捕是评估鱼类增殖放流效果最常用的方法，该方法需要在放流前对鱼类进行标记以区分放流群体和野生群体。目前常用的标记方法有物理标记、生物分子标记和化学标记等。这些方法中物理标记会对鱼体造成一定的损伤，只适用于对规格较大的鱼体进行标记，且标记成本较高、需逐条操作，不适合大规模标记放流。生物分子标记检测程序则过于复杂。化学标记主要是通过浸泡、注射、投喂等方法指在鳃盖、耳石等部位形成可稳定保持的化学荧光标记。其中浸泡法是最主要的化学标记方式，该方法可以对放流群体规模化标记，且对鱼的伤害小，尤其适用于仔稚幼鱼的标记。常用的化学荧光染料包括：盐酸四环素、钙黄绿素、茜素红、茜素络合指示剂。这些染料能与生物体内的钙结合形成稳定的螯合物，沉积在水生生物的硬组织中,最终形成荧光标记。盐酸四环素是一种抗生素,在用于化学标记时，使用浓度太低会影响标记效果，浓度过大会降低标记目标的存活率，且会威胁水产品质量安全。钙黄绿素产生的背景荧光较强，标记检测效果较差。茜素红和茜素络合指示剂在荧光标记应用中表现良好，对标记目标无明显损害，标记效率高，标记效果明显且保留时间较长，是理想的标记方法。值得注意的是，这两种染料均易与海水中的Ca2+等螯合产生沉淀物，影响了在海水中的溶解量。如梁小双等在《红鳍笛鲷荧光标记技术的研究》中报道，茜素红在海水中的溶解量仅为30mg/L，而染色浓度需达100～200mg/L才能形成明显的标记色。这一特点使得二者对海洋生物的标记效果较差，悬浮的沉淀物也可能堵塞鱼的腮部，造成死亡。另外，使用成本较高也是限制茜素络合指示剂标记应用的一大因素，该染料对5cm幼鱼的标记成本达1～2元/尾，限制了其在放流标记中的应用。相较而言，茜素红的应用成本则较低，仅为前者的约1/200，特别适合鱼类的大规模标记。
大黄鱼是我国重要的海洋经济鱼类，由于野生大黄鱼的资源的衰退，大黄鱼成为我国最重要的增殖放流鱼类之一，每年各地大黄鱼的放流量达数千万尾。大黄鱼放流规格一般为5cm左右，如何能对这一规格的大黄鱼幼鱼进行规模化标记成为评估增殖放流效果亟需解决的一大问题。大黄鱼属石首鱼科鱼类，耳石较大，易于标记和检测，非常适合以耳石作为标记物进行荧光标记，但现有的标记方案都存在一些弊端。如发明专利《一种大黄鱼增殖放流标志的方法》，申请号201410283245.X，公开了一种通过在育苗池中加入六水合氯化锶，对大黄鱼幼鱼进行锶标志的方法。该方法标记时间较长，且标记的鉴定需要对耳石磨片后用专业设备检测，操作复杂，实用性较差。另外，专利《一种标志石首科幼鱼的方法》，申请号201410145230.7，公开了一种用茜素络合指示剂标记石首科幼鱼的方法，该方法标记成本较高，且不能解决茜素络合指示剂在海水中易产生沉淀的问题。大黄鱼在染料浸泡应激状态下会分泌大量粘液，粘液与悬浮的沉淀物结合形成絮状物，极易对大黄鱼的腮部造成堵塞，引起死亡。实际操作中大黄鱼标记后成活率不足50％。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种用茜素红标记大黄鱼的方法，该方法通过调配人工海水，避免了钙离子对茜素红溶解的影响和沉淀的产生，提高了茜素红的有效浓度和浸染效果，解决了悬浮沉淀物易堵塞大黄鱼鳃部引起大量死亡的问题。
本发明的一种用茜素红标记大黄鱼的方法，包括：
(1)配制茜素红储备母液，稀释母液至应用浓度后调节盐度至15‰以上，得到人工海水染液；
(2)将待染色大黄鱼鱼苗浸泡于上述染液中进行染色；染色完成后将鱼苗转移至自然海水中漂洗，即得经茜素红标记的大黄鱼。
所述步骤(1)中配制茜素红储备母液时用气石强曝气12h。
所述步骤(1)中应用浓度为100～300mg/L，采用曝气48h以上的自来水稀释。
所述步骤(1)中采用不含碘精盐、MgSO4、MgCl2和KCl调节盐度。添加量为：每升染液添加不含碘精盐12.3g，MgSO4 1.0g，MgCl2 1.6g，KCl 0.3g。
所述步骤(1)中得到人工海水后进行曝气，采用气动式过滤棉吸附沉淀(吸附自来水和精盐中携带的少量钙离子可能形成的沉淀)，用NaHCO3溶液调节pH值至7.8～8.2。
所述步骤(2)中待染色大黄鱼鱼苗预先在盐度为15‰的低盐海水中适应48h以上(增强对低盐人工海水的适应能力)。
所述步骤(2)中染色在养殖池或染色桶中进行。
所述步骤(2)中待染色大黄鱼的浸泡密度为1.5～2.5尾/L(全长5cm左右)，浸泡时间为24h。
所述浸泡期间持续充气，采用气动式过滤棉吸附沉淀(吸附由大黄鱼体表带入海水等形成的少量沉淀物及鱼体分泌粘液)，用NaHCO3溶液调节pH，使其保持在7.8～8.2之间。
所述步骤(2)中染色完成后的染色液经过滤重复使用。
有益效果
(1)本发明采用调制人工海水的方式，提高了茜素红染液的有效浓度和染色效果，标记率达100％，耳石着色在浸染后90d依然可清晰检测到。检测方式简单，前期(约50d内)通过肉眼观察即可分辨标记鱼苗，后期可借助荧光显微镜观察提高辨别准确度；
(2)本发明中人工海水避免了悬浮沉淀物的产生，防止其与大黄鱼分泌粘液结合形成絮状物堵塞鱼鳃引起的大黄鱼大量死亡，标记后48h大黄鱼成活率保持在95％以上；
(3)本发明借助气动式过滤棉的过滤作用进一步减小了浸染过程中可能产生的少量沉淀对鱼苗的影响；
(4)本发明的方法避免了体外挂牌等方法对鱼体损伤大，不适合小规格鱼标记，且易遗失的问题；
(5)本发明的方法标记成本极低，每尾鱼的标记成本不到0.1元，适合大黄鱼放流大规模标记；
(6)大黄鱼对盐度变化的耐受性较强，本发明中从自然海水直接转移至盐度为15‰的人工海水中，对大黄鱼的成活无明显影响，适当降低浸染盐度可减少精盐等的用量，进一步节约成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)用蒸馏水配制2000mg/L的茜素红储备母液，配制时用气石强曝气12h使茜素红充分溶解；用曝气48h后的自来水稀释母液至200mg/L；采用不含碘精盐(市售)、MgSO4、MgCl2和KCl调节盐度至15‰，得到人工海水染液(添加量为每升染液添加不含碘精盐12.3g，MgSO4 1.0g，MgCl2 1.6g，KCl 0.3g)。染液曝气12h，采用气动式过滤棉吸附沉淀(每立方米水体布放2只)，用NaHCO3溶液调节pH值至8.2。
(2)染色在6m3的养殖池中进行。将12000尾平均全长5.15±0.75cm待染色大黄鱼鱼苗(约5cm，预先在不含茜素红的盐度15‰的海水中适应48h)浸泡于上述人工海水中进行染色，浸泡时间为24h，浸泡期间持续充气，采用气动式过滤棉吸附沉淀，用NaHCO3溶液调节pH，使保持在7.8～8.2之间；染色完成后将鱼苗转移至自然海水中漂洗24h，去除体表浮色，即得经茜素红标记的大黄鱼。
经观察，标记后48h大黄鱼成活率为98％，标记率达100％。
实施例2
(1)用蒸馏水配制2000mg/L的茜素红储备母液，配制时用气石强曝气12h使茜素红充分溶解；于3只300L染色桶中分别用曝气48h后的自来水稀释母液至100、200、300mg/L；每升稀释液添加不含碘精盐12.3g，MgSO4 1.0g，MgCl2 1.6g，KCl 0.3g，得到盐度为15％的人工海水染液，曝气12h，每桶用1只气动式过滤棉吸附沉淀，用NaHCO3溶液调节pH值至8.2。
(2)每桶放入500尾全长为4.68±0.82cm的大黄鱼鱼苗进行浸泡染色，浸泡时间为24h，浸泡期间持续充气，采用气动式过滤棉吸附沉淀，用NaHCO3溶液调节pH，使其保持在7.8～8.2之间；染色完成后将鱼苗转移至自然海水中漂洗24h，去除体表浮色。
大黄鱼染色标记效果如下：