本发明属于植物无性繁殖技术领域，涉及一种美叶柯组织培养外植体获取方法。
背景技术：
美叶柯（Lithocarpus calophyllus）又名红叶橼（江西）、硬叶椆、黄椆、黄背栎（广东）、者锥（广西），系壳斗科（Fagaceae）柯属（Lithocarpus）乔木，乔木，高达28米，胸径1米，新生枝的上段被早脱落的疏微柔毛，二年生枝褐黑色，有皮孔。叶硬革质，宽椭圆形，卵形或长椭圆形，长8-15厘米，宽4-9厘米，顶部渐尖或短突尖，尾状，基部近于圆或浅耳垂状，有时一侧略短或偏斜，侧脉每边7-11条，在叶面凹陷，在叶缘附近急向上弯而隐没，支脉甚纤细，彼此近于平行，叶背无毛，但有甚厚的棕黄色至红褐色、可抹落的甚短的毡毛状、粉末状鳞秕层，二年生叶的叶背灰白色或稍带苍灰色，蜡鳞层紧实；叶柄长2.5-5厘米，花和花序与星毛柯的相同；壳斗厚木质，高5-10毫米，宽15-25毫米；坚果高15-20毫米，宽18-26毫米，顶部平坦中央微凹陷或甚短尖，常有淡薄的灰白色粉霜，果脐口径10-14毫米，深2-4毫米。花期6-7月，果次年8-9月成熟。树皮暗褐黑色，不开裂或浅纵裂，树高约15米的树皮厚约12毫米，内皮淡红褐色，脊棱甚突出，高达3毫米，木材淡灰褐色，颇坚重，不甚耐腐。果实含淀粉。产江西、福建二省西南部、湖南南部、广东、广西、贵州南部。生于海拔500-1 200米山地常绿阔叶林中。
目前，美叶柯资源仍处于野生分布状态，但随着保护植物多样性的需求，规模化人工栽培美叶柯资源势在必行。目前虽然美叶柯已成功利用组培快繁技术对选育出的优良家系进行了育苗并造林，但是在组织培养过程中，外植体材料通常使用大树穗条和基部萌芽等。但是大树多数位于偏远林区，采摘不便、萌芽难、数量少且难以灭菌，因此大树萌条难以满足实际生产育苗需求。而离体胚、无菌实生苗、子叶和针叶等作为外植体材料，获取不定芽的速度和数量不及茎段快和多，难以成为组织培养的常用材料。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种采摘方便，质量好，数量多，灭菌易，可满足美叶柯组织培养快速繁殖体系建立需要的美叶柯组织培养外植体获取方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种美叶柯组织培养外植体获取方法，主要操作步骤如下：
（1）选种与播种：选取无病虫害、颗粒饱满的美叶柯优良家系种子经催芽处理后播种；
（2）芽苗移植与管理：芽苗出土后移植到规格为15cm×15cm无纺布育苗袋内，视情况淋水、喷药、施肥；
（3）母株种植与管理：当步骤（2）移植苗木生根稳定后，移栽到规格为30cm×30cm容器杯内，搭建荫棚，挑选壮苗作母株移植到装有基质的容器杯中进行母株种植，定时追肥，加强病虫害防治；所述的基质的组分和重量比是：黄心土∶腐熟椰糠∶蛭石∶鸡粪为5∶1∶2∶2；
（4）外植体获取：剪取萌芽条，修剪针叶，进行消毒接种。
以上所述的播种方法是指将经常规消毒和热水浸泡后的种子置于100～140℃的烘箱中烘干，自然冷却到室温后将种子播种于采用体积浓度0.3%的高锰酸钾溶液消毒过的沙床上。
以上所述的芽苗移植与管理方法是当芽苗高6～8 cm时移植到无纺布育苗袋内，每隔7～10天施一次质量浓度0.5%复合肥溶液，40天后芽苗生根稳定。
以上步骤（3）选取苗高40～60 cm，地径0.3～0.6 cm，主干通直，侧枝少的容器苗作为母株。
以上所述的母株管理方法是用遮阴度为40～60%的遮阴网搭建高1.8～2.5 m的荫棚，每隔7～15天施肥一次体积浓度为0.5～1%复合肥溶液，每20天向叶面喷施一次质量浓度为0.2%～0.5％的磷酸二氢钾溶液；当母株种植30天后，于距离地面30 cm处截断主干。
以上所述的外植体获取方法是剪取长6～9cm，直径0.2～0.4 cm的萌芽条，用体积浓度75%的酒精溶液对萌芽条进行喷雾消毒后，于萌芽条顶部0.5～1.0 cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成3.0～4.0 cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取1～2个茎段。
以上所述的复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%。
对比于现有技术，本发明具有的优点及有益效果如下：
1、本发明是在苗圃里进行母株种植，方便母株管理和萌条采集；在母株选择时已经过优良种源和优良壮苗的两轮选择，能很好的保证了所获取的外植体的优良品质，并且在管理下，萌条可以不断萌发，生长快，可满足规模化生产的需要。
2、本发明及时对母株进行截干促萌，既保证了有足够的萌芽生长空间，又更好的保持了营养的均衡；选取适合的萌芽条作为外植体材料，其木质化程度和生理老化程度可较好的满足了组培需要。
4、本发明根据美叶柯的生理特性配制的母株基质，材料易得，营养均衡，减少了生产成本，提高了母株的成活率。
5、本发明在消毒萌芽条后，于其顶部剪除顶芽，可除掉受消毒液伤害的幼嫩顶芽，保证了外植体接种后的成活率；每根萌条从上往下剪取1-2个茎段，保证取茎段均具有较强的再生能力，保证了不定芽诱导过程中不定芽集中萌发，萌芽整齐。
6、本发明的母株管理和萌条采集都十分方便，所获得的外植体品质优良，污染率、死亡率低，不定芽萌发率高，萌芽整齐，可操作性强，满足了美叶柯组织培养快速繁殖体系建立的需求，具有较强的经济效益、社会效益和生态效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
选取无病虫害、颗粒饱满的美叶柯优良家系种子，经常规消毒和热水浸泡后将种子置于100～140℃的烘箱中烘干，自然冷却到室温后将种子播种于采用体积浓度0.3%的高锰酸钾溶液消毒过的沙床上。
芽苗出土后，当芽苗高6～8 cm时移植到规格为15cm×15cm无纺布育苗袋内，视情况淋水、喷药，并每隔7～10天施一次质量浓度0.5%复合肥溶液，其中复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%，40天后芽苗生根稳定。
当移植苗木生根稳定后，选取苗高40～60 cm，地径0.3～0.6 cm，主干通直，侧枝少的容器苗作为母株，移栽到规格为30cm×30cm并装有基质的容器杯内，所述的基质的组分和重量比是：黄心土∶腐熟椰糠∶蛭石∶鸡粪为5∶1∶2∶2。用遮阴度为40～60%的遮阴网搭建高1.8～2.5 m的荫棚，每隔7～15天施肥一次体积浓度为0.5～1%复合肥溶液，复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%；每20天向叶面喷施一次质量浓度为0.2～0.5％的磷酸二氢钾溶液；当母株种植30天后，于距离地面30 cm处截断主干。
剪取长6～9cm，直径0.2～0.4 cm的萌芽条，用体积浓度75%的酒精溶液对萌芽条进行喷雾消毒后，于萌芽条顶部0.5～1.0 cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成3.0～4.0 cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取1～2个茎段。
实施例2：
选取无病虫害、颗粒饱满的美叶柯优良家系种子，经常规消毒和热水浸泡后将种子置于110℃的烘箱中烘干，自然冷却到室温后将种子播种于采用体积浓度0.3%的高锰酸钾溶液消毒过的沙床上。
芽苗出土后，当芽苗高6～8 cm时移植到规格为15cm×15cm无纺布育苗袋内，视情况淋水、喷药，并每隔8天施一次质量浓度0.5%复合肥溶液，其中复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%，40天后芽苗生根稳定。
当移植苗木生根稳定后，选取苗高45～50 cm，地径0.3～0.4 cm，主干通直，侧枝少的容器苗作为母株，移栽到规格为30cm×30cm并装有基质的容器杯内，所述的基质的组分和重量比是：黄心土∶腐熟椰糠∶蛭石∶鸡粪为5∶1∶2∶2。用遮阴度为50%的遮阴网搭建高2.0 m的荫棚，每隔8天施肥一次体积浓度为0.5%复合肥溶液，复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%；每20天向叶面喷施一次质量浓度为0.2～0.3％的磷酸二氢钾溶液；当母株种植30天后，于距离地面30 cm处截断主干。
剪取长6～8cm，直径0.2～0.3 cm的萌芽条，用体积浓度75%的酒精溶液对萌芽条进行喷雾消毒后，于萌芽条顶部0.5 cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成3.0cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取1～2个茎段。
实施例3：
选取无病虫害、颗粒饱满的美叶柯优良家系种子，经常规消毒和热水浸泡后将种子置于120℃的烘箱中烘干，自然冷却到室温后将种子播种于采用体积浓度0.3%的高锰酸钾溶液消毒过的沙床上。
芽苗出土后，当芽苗高6～8 cm时移植到规格为15cm×15cm无纺布育苗袋内，视情况淋水、喷药，并每隔9天施一次质量浓度0.5%复合肥溶液，其中复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%，40天后芽苗生根稳定。
当移植苗木生根稳定后，选取苗高50～55 cm，地径0.4～0.5 cm，主干通直，侧枝少的容器苗作为母株，移栽到规格为30cm×30cm并装有基质的容器杯内，所述的基质的组分和重量比是：黄心土∶腐熟椰糠∶蛭石∶鸡粪为5∶1∶2∶2。用遮阴度为40～60%的遮阴网搭建高2.2 m的荫棚，每隔10天施肥一次体积浓度为1%复合肥溶液，复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%；每20天向叶面喷施一次质量浓度为0.3～0.4％的磷酸二氢钾溶液；当母株种植30天后，于距离地面30 cm处截断主干。
剪取长7～8cm，直径0.2～0.3cm的萌芽条，用体积浓度75%的酒精溶液对萌芽条进行喷雾消毒后，于萌芽条顶部0.5～1.0 cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成3.0～4.0 cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取1～2个茎段。
实施例4：
选取无病虫害、颗粒饱满的美叶柯优良家系种子，经常规消毒和热水浸泡后将种子置于140℃的烘箱中烘干，自然冷却到室温后将种子播种于采用体积浓度0.3%的高锰酸钾溶液消毒过的沙床上。
芽苗出土后，当芽苗高6～8 cm时移植到规格为15cm×15cm无纺布育苗袋内，视情况淋水、喷药，并每隔10天施一次质量浓度0.5%复合肥溶液，其中复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%，40天后芽苗生根稳定。
当移植苗木生根稳定后，选取苗高55～60 cm，地径0.5～0.6 cm，主干通直，侧枝少的容器苗作为母株，移栽到规格为30cm×30cm并装有基质的容器杯内，所述的基质的组分和重量比是：黄心土∶腐熟椰糠∶蛭石∶鸡粪为5∶1∶2∶2。用遮阴度为60%的遮阴网搭建高2.5 m的荫棚，每隔15天施肥一次体积浓度为1%复合肥溶液，复合肥溶液中的NPK的有效成分≥48%；每20天向叶面喷施一次质量浓度为0.4～0.5％的磷酸二氢钾溶液；当母株种植30天后，于距离地面30 cm处截断主干。
剪取长8～9cm，直径0.3～0.4 cm的萌芽条，用体积浓度75%的酒精溶液对萌芽条进行喷雾消毒后，于萌芽条顶部0.5～1.0 cm处剪除顶芽，余下部分由上至下修剪成4.0 cm长的茎段作为外植体，每根萌芽条取1～2个茎段。