本发明涉及蓝莓组织培养技术领域，特别是蓝莓茎段快速繁殖方法。
背景技术：
蓝莓为杜鹃花科越橘属植物，是具有较高经济价值和广阔开发前景的新兴果树树种。蓝莓果实营养丰富，特别是抗氧化能力为所有果品蔬菜之首。
蓝莓主要通过扦插和组培法两种方法进行繁殖，但常规栽培方式培养周期长，生产效率较低，而采用组培技术具有繁殖系数高、繁育时间不受季节限制，缩短培养周期、便于工厂化管理等优点，可提高蓝莓生产效率，该技术已成为解决当前蓝莓产业化发展对种苗需求的关键技术。蓝莓组培繁育过程包括外植体的选择处理、茎段诱导培养、增殖培养和生根培养等阶段。其中，茎段增殖培养阶段是使蓝莓茎段数量增多达到蓝莓种苗生产需求计划的关键步骤，而这个阶段蓝莓茎段增殖数量的多少取决于其增殖培养基配方是否适合茎段生长发育需求，因而茎段增殖培养基配方需要经过多次试验才能够获得。
中国专利CN102812905A公开了一种蓝莓嫩茎段组培快繁工艺，它包括以下步骤：S1、从田间选取未木质化的嫩茎，洗净消毒，切成带芽茎段；S2、诱导培养，采用的诱导培养基为MS+ZT3.0mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L；S3、继代培养，采用的继代增殖培养基为MS+ZT0.5～1.5mg/L+IBA0.05～0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L；在蓝莓出瓶移栽之前采用MS+ZT0.3～0.7mg/L培养基进行苗木复壮。该专利的有益效果是：繁殖率高、繁殖速度快，生产组培苗成本低廉；生产的苗木质量好，均匀一致，容易脱去病毒，根系发达，为后期树体生长结果奠定良好的基础。该专利的缺点在于使用的培养基配方复杂，不易操作，并且三个培养阶段均玉米素(ZT)的使用量较大，同时培养过程中还要使用吲哚丁酸(IBA)，生产成本高；另外，该专利培养过程中要经过诱导阶段，不仅增加生产成本，而且也延长了培养周期。
中国专利CN 101869078A公开了一种蓝莓组培微繁育苗方法，生长季节从田间采集蓝莓新梢，无菌条件下，经表面消毒，用无菌水冲后，剪切成带1～2个芽茎段，其特征是将带1～2个芽的茎段接种到初代诱导培养基WPM+ZT3.0mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L上，该培养基pH5.4；经过2～3代的培养，获得无菌的、旺盛生长的、分枝多的组培无性系；在蓝莓组培苗继代增殖培养阶段，采用增殖培养基WPM+ZT0.5～1.5mg/L+CPPU0.05～1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，pH5.4；每50～60天一个继代周期，繁殖系提高5～10倍，该专利缺点在于培养基中添加氯吡苯脲(CPPU)生长调节剂，该调节剂为膨大剂，主要用于果实膨大等方面的，鲜见在组培方面的应用；另外，该专利培养过程中要经过诱导阶段，增加生产成本，培养周期长。
中国专利CN 103583368A公开了一种兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法，涉及植物组织培养方法。本发明选取水培苗的茎段为外植体，用酒精和升汞处理后接种在茎芽系诱导培养基中，进一步将茎芽系诱导培养的茎段竖直插于茎芽系增殖培养中，并在生根培养中取IBA浓度2.0mgL-1，生根率高于85％。上述取水培苗作为来源，其污染率和褐化率明显低于温室培育苗；用酒精和升汞消毒相互促进；茎芽系诱导、增殖与正交实验结果一致；IBA对生根的影响为单因素随机区组实验的结果。该专利的缺点是选取水培苗的茎段为外植体，采用液体培养基进行培养，容易造成蓝莓的玻璃化，玻璃化是蓝莓在固体培养基中常出现的问题，因而在液体里面培养就更容易出现这个问题；其二是容易造成缺氧造成植物的死亡；其三是上述专利选用的品种是兔眼蓝莓，使用范围窄。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种蓝莓茎段快速繁殖方法，该方法蓝莓茎段繁殖系数高，生产成本低，适合蓝莓大规模生产对种苗的需求。
本发明蓝莓茎段快速繁殖方法包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒处理：
蓝莓外植体的选择：于春季采集当年生枝条的顶端及上部茎段。
蓝莓外植体的消毒处理：将新采集的枝条去掉叶片并切段，每个茎段留1-2个叶芽，用自来水冲洗3-5次，再用洗衣粉水清洗15-20min，洗衣粉水重量浓度为0.1-0.5％，之后用自来水将泡沫冲洗干净，再用流动水冲洗30-40min，之后用75％酒精浸泡30-40s，用无菌水冲洗4～5次；再用0.1％升汞消毒5-10min，用无菌水冲洗6～7次，沥干水分，备用。
在这部分里，酒精浸泡的时间和升汞的消毒时间可根据采集的蓝莓茎段的幼嫩程度延长或缩短。
(2)蓝莓茎段培养：
蓝莓茎段培养分为两个阶段，在第一阶段，将步骤(1)处理好的外植体接种到MS培养基上，优选在光照时间为12-15h/d、光照强度为2000-3000Lx，温度25-27℃的条件下培养10-15天，观察茎段生长情况(即观察其有没有污染、死亡的情况)。根据蓝莓茎段生长情况，第二阶段，挑选没有污染、长出新叶片的无菌苗接种在增殖培养基上，增殖培养基的配方为：WPM+0.5mg/L～1.5mg/L ZT+30g/L糖+6.5-8g/L琼脂，调节pH为5.4-5.8，第二阶段培养30-40天，优选培养条件是：温度25-27℃，光照时间为12-15h/d、光照强度为2000-3000Lx。
pH值的调整用0.1mol/LNaOH或0.1mol/L HCl来调整。
其中第二阶段培养基中的糖为蔗糖或白砂糖。
本发明材料说明：
(1)MS：是人名Murashige and Skoog的缩写。MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。
(2)WPM：木本植物用培养基(Woody Plant medium)。
(3)ZT：玉米素。
本发明的有益效果是：
(1)由于本发明中使用的增殖培养基配方为：WPM+ZT+白砂糖+琼脂，从培养基配方来看，培养基较简单，所用试剂较少，因此操作相对来说简单，成本低，繁殖系数能达到5-10倍。
(2)本发明分为两个阶段，第一个阶段为MS培养基，第二阶段为增殖培养基。从茎段培养过程，由于第一阶段只采用MS培养基，因此相比培养技术、过程更加简单，成本更低，但繁殖系数高、植株生长速度加快，具体的说本发明的效果主要体现在以下几个方面：一是蓝莓的繁殖系数高，可以达到5-10倍；二是蓝莓的生长速度加快，表现在植株的株高上，30天即可使植株高度达到5-6cm，比其它培养基培养的植株长到相同高度可缩短10-20天，因此大大加快蓝莓茎段的繁殖速度；三是由于在本发明中使用玉米素浓度较低，因而培养出的植株要比使用较高浓度培养出的植株生长势强，即茎比较粗，叶片较大且数量较多，愈伤组织少，可不经过后续的壮苗培养阶段，直接进行生根培养；四是本发明方法不易造成蓝莓的玻璃化，从以上几方面可看出，使用本发明培养基，可大大提高蓝莓的繁殖速度。
(3)本发明繁殖方法适用范围广。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：奥尼尔蓝莓
(1)外植体的选择与处理：春季采集刚萌动的枝条，将新采集的枝条去掉叶片并切段，每个茎段留1-2个叶芽，用自来水冲洗3次，再用洗衣粉水清洗15min，之后用自来水将泡沫冲洗干净，再用流动水冲洗30min，之后用75％酒精浸泡30s，用无菌水冲洗5次；再用0.1％升汞消毒5-10min，用无菌水冲洗6-7次，沥干水分，备用。
(2)蓝莓茎段培养：
蓝莓茎段培养分为两个阶段，在第一阶段，将步骤1处理好的外植体接种到MS培养基上在光照时间为14h/d、光照强度为2500Lx，温度25℃的条件下培养14天；根据蓝莓茎段生长情况，挑选没有污染、长出新叶片的茎段接种在增殖培养基上，增殖培养基的配方为：WPM+0.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，调节pH为5.8，第二阶段培养30天，培养条件是：光照时间为14h/d、光照强度为2200Lx，温度25℃。
经过培养，其繁殖系数为5，植株生长高度为5-6cm；植株生长势强，成活率100％，叶片全部为绿色，表现为壮苗，培养过程中无玻璃化现象发生。
实施例2：美登蓝莓
蓝莓茎段培养阶段，第二阶段增殖培养基的配方为：WPM+1.0mg/L ZT+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，其它与实施例1相同，其繁殖系数为8-10，植株生长高度为5-5.5cm；植株生长势强，且生长均一，叶片全部为绿色，成活率100％，表现为壮苗，培养过程中无玻璃化现象发生。
实施例3：蓝丰蓝莓
蓝莓茎段培养阶段，第二阶段增殖培养基的配方为：WPM+1.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，其它与实施例1相同，其繁殖系数为6-7，植株生长高度为4-5cm；植株生长势强，且生长均一，叶片全部为绿色，成活率100％，表现为壮苗，培养过程中无玻璃化现象发生。
实施例4：都克蓝莓
蓝莓茎段培养阶段，第二阶段增殖培养基的配方为：WPM+0.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，其它与实施例1相同，其繁殖系数为5，植株生长高度为5-5.5cm；植株生长势强，且生长均一，叶片全部为绿色，成活率100％，表现为壮苗，培养过程中无玻璃化现象发生。
实施例5：乔治蓝莓
蓝莓茎段培养阶段，第二阶段增殖培养基的配方为：WPM+0.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，其它与实施例1相同，其繁殖系数为6，植株生长高度为5.5-6cm；植株生长势强，且生长均一，叶片全部为绿色，成活率100％，表现为壮苗，培养过程中无玻璃化现象发生。
本发明采用利用固体培养基进行培养，没有玻璃化苗的产生，这是相对于液体培养基而言具有的优势。
对比例1：乔治蓝莓
将实施例5乔治蓝莓的培养中第二阶段增殖培养基的配方换为：WPM+0.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.5mg/LCPPU，其它与实施例5相同，其繁殖系数为4-5，植株生长高度为5.5-6cm；成活率85％，茎段基部愈伤组织较多，植株出现落叶或基部叶片发黄的现象。
对比例2：
将实施例5乔治蓝莓的培养中第二阶段增殖培养基的配方换为：WPM+0.5mg/L ZT+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1mg/L IBA，其它与实施例5相同，其繁殖系数为4-5，植株生长高度为5.0-5.5cm；成活率86％，茎段基部愈伤组织较大，叶片出现黄色或脱落的现象。
对比例3：
将实施例5乔治蓝莓的培养中第二阶段增殖培养基的配方换为：WPM+3mg/L ZT+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，其它与实施例5相同，其繁殖系数为6，植株生长高度为4.5-5cm；成活率95％，培养过程中无玻璃化现象发生。
以上内容描述了本发明的基本原理和主要特征，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。