本发明涉及一种褐纹报春苣苔的离体培养方法。
背景技术：
褐纹报春苣苔(Primulina glandaceistriata(Gesneriaceae))是苦苣苔科报春苣苔属的多年生草本植物。本种于2014年发表在《Phytotaxa》上，主要分布于广西灵川县。该种在形态上和Primulina dryas和Primulina beiliuensis较近，但其叶片具备棕色条纹而又显著区别于这两个种。该物种目前属于极危物种。
作为一个极危物种，目前褐纹报春苣苔的研究仍处于空白阶段，面临的形势较严峻。目前需要一种繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制的褐纹报春苣苔的离体培养方法。
技术实现要素：
基于以上现有技术的不足，本发明所解决的技术问题在于提供一种繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制的褐纹报春苣苔的离体培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种褐纹报春苣苔的离体培养方法，包含如下步骤：
步骤一、外植体的消毒灭菌，春季取褐纹报春苣苔的幼嫩叶片，清洗、消毒然后切去少量叶片的边缘，然后将处理后的叶片接入初代培养基上，培养14d；
步骤二、不定芽的诱导，将步骤一培养后的无菌叶片切成1cm×1cm大小，并将叶片的边缘切去少量，接入不定芽诱导培养基中，培养15-18d，形成不定芽；
步骤三、继代培养，将步骤二获得的不定芽转接到继代培养基中培养25-30d，形成组培小苗；
步骤四、生根培养，将步骤三获得的组培小苗转接于生根培养基中培养18-20d，获得生根苗；
步骤五、炼苗移栽，将步骤四获得的生根苗移出培养室后揭盖在自然条件下炼苗4-5d，然后洗净培养基移栽到基质中；浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，早晚浇水一次，培养7-10d。
作为上述技术方案的优选实施方式，本发明实施例提供的褐纹报春苣苔的离体培养方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤一为，春季取褐纹报春苣苔的幼嫩叶片，用中性洗涤剂浸泡40～60min后在流水下冲洗30min，并用软毛刷轻轻刷洗；在超净工作台上，先用棉球蘸取75％酒精拭擦叶片表面，无菌水冲洗2次，再将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗3次；用0.1％升汞浸泡叶片10min，无菌水冲洗3次，并轻轻震荡使叶片充分接触升汞；将叶片的边缘切去少量然后接入初代培养基MS培养基上，培养14d。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤二中的不定芽诱导培养基为MS+TDZ1.0-2.0mg/L+NAA0.01-0.1mg/L+卡拉胶6.0g/L，并调节pH6.4。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤三中继代培养基为1/2MS+KT0.5-1.5mg/L+IBA0.05mg/L+活性炭0.2g/L+卡拉胶6.0g/L并调节pH6.4，增殖系数为5.62-6.70，植株长势好，健壮。1/2MS培养基中的大量元素以及蔗糖含量为MS培养基中的大量元素以及蔗糖含量的1/2。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤四中生根培养基为1/4MS+NAA0.1-0.3mg/L+活性炭0.1-0.3g/L+卡拉胶6.0g/L并调节pH6.4。当步骤二中组培小苗长至高1.5-3.0cm时，转接于生根培养基中。1/4MS培养基中的大量元素以及蔗糖含量为MS培养基中的大量元素以及蔗糖含量的1/4。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤五中移栽基质为泥炭和细河沙体积比为3:1的混合物。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：本发明的褐纹报春苣苔的离体培养方法操作简单，设计合理，该褐纹报春苣苔的离体培养方法具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制的优点。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。
材料选取褐纹报春苣苔。
增殖系数＝增殖植株数/接种数
生根率(％)＝生根植株数/接种数
实施例1
2016年3月14日，取褐纹报春苣苔的幼嫩叶片，用洗衣粉浸泡40min后在流水下冲洗30min，并用软毛刷轻轻刷洗叶片。然后转入超净工作台进行灭菌操作。先用棉球蘸取75％酒精拭擦叶片表面，无菌水冲洗2次，将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理10min，无菌水冲洗3次，并轻轻震荡使叶片充分接触升汞。接入MS培养基，14d后，将获得的无菌叶片切成1cm×1cm大小，并将叶片的边缘切去少量，接入MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.01mg/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中。经过18d的培养，叶片四周的伤口诱导出不定芽，不定芽长势良好，数量多。将不定芽切取下来，接入1/2MS+KT0.5mg/L+IBA0.05mg/L+活性炭0.2g/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中，25d后可获得大量的不定芽丛生苗，增殖系数为5.90，植株长势好，健壮。选取苗高1.5-3.0cm，转接于1/4MS+NAA0.2mg/L+活性炭0.2g/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中，20d即可生根，生根率为100.00％。植株长势好，健壮，根系多。将生根苗高为2.5-4.0cm时，移出培养室后揭盖在自然条件下炼苗4-5d。洗净培养基移栽到装有基质(泥炭和细河沙的体积比为3:1)的50孔穴盘中。浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，早晚浇透水各一次。移栽后7d即成活，成活率100％。
实施例2
2016年3月18日，取褐纹报春苣苔的幼嫩叶片，用洗衣粉浸泡40min后在流水下冲洗30min，并用软毛刷轻轻刷洗叶片。然后转入超净工作台进行灭菌操作。先用棉球蘸取75％酒精拭擦叶片表面，无菌水冲洗2次，将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理10min，无菌水冲洗3次，并轻轻震荡使叶片充分接触升汞。接入MS培养基，14d后，将获得的无菌叶片切成1cm×1cm大小，并将叶片的边缘切去少量，接入MS+TDZ1.5mg/L+NAA0.05mg/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中。经过18d的培养，叶片四周的伤口诱导出不定芽，不定芽长势良好，数量多。将不定芽切取下来，接入1/2MS+KT1.0mg/L+IBA0.05mg/L+活性炭0.2g/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中，30d后可获得大量的不定芽丛生苗，增殖系数为5.62，植株长势好，健壮。选取苗高1.5-3.0cm，转接于1/4MS+NAA0.2mg/L+活性炭0.2g/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中，18d即可生根，生根率为100.00％。植株长势好，健壮，根系多。将生根苗高为2.5-4.0cm时，移出培养室后揭盖在自然条件下炼苗4-5d。洗净培养基移栽到装有基质(泥炭和细河沙的体积比为3:1)的50孔穴盘中。浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，早晚浇透水各一次。移栽后7d即成活，成活率100％。
实施例3
2016年3月22日，取褐纹报春苣苔的幼嫩叶片，用洗衣粉浸泡40min后在流水下冲洗30min，并用软毛刷轻轻刷洗叶片。然后转入超净工作台进行灭菌操作。先用棉球蘸取75％酒精拭擦叶片表面，无菌水冲洗2次，将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞处理10min，无菌水冲洗3次，并轻轻震荡使叶片充分接触升汞。接入MS培养基，14d后，将获得的无菌叶片切成1cm×1cm大小，并将叶片的边缘切去少量，接入MS+TDZ1.5mg/L+NAA0.01mg/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中。经过15d的培养，叶片四周的伤口诱导出不定芽，不定芽长势良好，数量多。将不定芽切取下来，接入1/2MS+KT1.5mg/L+IBA0.05mg/L+活性炭0.2g/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中，25d后可获得大量的不定芽丛生苗，增殖系数为6.70，植株长势好，健壮。选取苗高1.5-3.0cm，转接于1/4MS+NAA0.3mg/L+活性炭0.3g/L+卡拉胶6.0g/L+pH6.4培养基中，18d即可生根，生根率为100.00％。植株长势好，健壮，根系多。将生根苗高为2.5-4.0cm时，移出培养室后揭盖在自然条件下炼苗4-5d。洗净培养基移栽到装有基质(泥炭和细河沙的体积比为3:1)的50孔穴盘中。浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，早晚浇透水各一次。移栽后7d即成活，成活率100％。
在本发明实施例中，生根率100.00％，植株长势好，健壮，根系多；成活率100.00％，繁殖速度快、繁殖系数大。
本发明的褐纹报春苣苔的离体培养方法操作简单，设计合理，该褐纹报春苣苔的离体培养方法具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制的优点。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。