本发明涉及一种花粉长期保存方法，具体是一种金银忍冬花粉超低温保存方法。
背景技术：
金银忍冬又名金银木、鸡骨头树等，为忍冬科忍冬属落叶小乔木，常丛生成灌木状，其花果并美，具有较高的观赏价值，浆果从六七月份逐渐由黄变红，由红变成紫红，园林中常将金银木丛植于草坪、山坡、林缘、路边或点缀于建筑周围，是良好的观赏灌木。金银忍冬是稀有的药用观赏灌木，具有解热、增强免疫力及抑菌作用，全株可入药,能祛风解毒、消肿止痛，主治头晕、跌打损伤。其茎皮可制人造棉，种子油可制肥皂，叶浸汁可杀棉蚜虫，花可作金银花用。由此可见，金银忍冬是一种集药用和观赏应用于一体的植物，具有较高的推广价值。在自然条件下，许多花粉的寿命非常短,这给种质资源研究和杂交育种工作带来极大的不便，同时也不利于相关的植物遗传研究。进行花粉的超低温保存研究对于加速育种进程以及完善种质资源保存方法等研究工作都具有重要意义。成熟的花粉含有植物的全部遗传物质信息，花粉超低温保存操作简单，是进行种质资源保存的一条新途径。
超低温保存是指在液氮(－196℃)及液氮蒸汽相(－150～－180℃)的超低温条件下保存生物材料。超低温保存技术可使植物材料的代谢和生长活动在一定的低温条件下几乎完全停止，进而有效的保持材料的遗传稳定性，同时又不会丧失其形态发生的潜能，达到长期保存的目的；并具有遗传稳定性高，操作简单方便，节省空间、省时省力的优点。
将超低温保存技术应用于花粉保存，其优点：操作简单易行、占用空间小、安全稳定保存成本低可以大大延长花粉的保存时间，使花粉的贮运和交换成为可能，同时还能很好服务于育种工作，提高育种效率经过低温保存的花粉能保持其遗传完整性和稳定性低温条件下还可以避免病虫害的引入，为地区间、国际间的种质交换提供方便。
金银忍冬花粉超低温保存目前还未见报道。因此，研发一种适合于金银忍冬花粉的可行的超低温保存方法是非常必要的。
技术实现要素：
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
将不同采集时期和采集时间金银忍冬新鲜花粉放入1.8ml的冻存管中，花粉的体积不超过冻存管容量的2/3，然后将冷冻管放入盛有硅胶干燥剂的干燥皿内干燥不同的时间后获得不同含水量的花粉，干燥皿规格为V＝410mm×410mm×310mm、Φ＝300mm；将装有花粉的冻存管投入﹣196℃液氮罐中保存；取出冻存管进行不同化冻处理；化冻后将花粉在培养液中测定萌发率。
所述不同采集时期，为开花前1天，开花当天，开花后1天采集的花粉进行萌发率的测定
所述不同采集时间，1d中不同时间所采集的花粉萌发率不同，我们分别采集了7:30、9:30、11:30、13:30、15:30、17:30、19:30的金银忍冬花粉。
所述干燥不同的时间分别为干燥0min、10min、20min、30min、40min、50min。
所述不同含水量，为金银忍冬花粉干燥的时间不同得到的含水量。
所述不同化冻方式，分别为三种：(1)室温化冻30min；(2)40℃水浴化冻2min；(3)自来水冲洗5min。
通过对以上技术方案进行试验找出最佳一种金银忍冬花粉超低温保存方法，用于权利要求。
具体实施方式：
以下对本发明结合具体的实例作进一步的详细说明，并介绍本发明的相关研究结果。
1.以东北林业大学校内的金银忍冬花粉为例对本发明作进一步的详细说明。
1)不同采集时期对金银忍冬花粉萌发率的影响
在金银忍冬开花前一天，开花当天，开花后一天采集花粉，观察不同采收时期的花粉萌发率的变化情况。
表1不同采集时期对金银忍冬花粉萌发率的影响
2)不同采集时间对金银忍冬花粉萌发率的影响
从金银忍冬开花的一天中选定不同的时段，即7:30、9:30、11:30、13:30、15:30、17:30、19:30每隔两小时采集花粉，观察其萌发率。
表2不同采集时间对金银忍冬花粉萌发率的影响
3)经不同干燥时间得不同含水量花粉超低温保存前后萌发率
首先采用烘干法测得金银忍冬花粉的最大含水量后，利用硅胶干燥法进行花粉不同含水量梯度的配制，然后测定花粉的萌发率；后将其投入液氮罐中保存一段时间后取出，经化冻后测定金银忍冬花粉经超低温保存后的萌发率。
表3经不同干燥时间得不同含水量花粉超低温保存前萌发率
表4经不同干燥时间得不同含水量花粉超低温保存后萌发率
4)不同化冻方式对花粉萌发率的影响
采用了3种化冻方式(1)室温化冻30min；(2)40℃水浴化冻2min；(3)自来水冲洗5min对金银忍冬花粉超低温保存24h后的进行化冻试验，比较3种化冻方式对花粉萌发力的影响。
表5不同化冻方式对花粉萌发率的影响
2.试验结果
1)花粉的萌发率是花粉超低温保存效果的重要评价因子，花粉的离体萌发技术由于其操作简便易行而作为检验花粉萌发率的重要手段之一。一般情况下，成熟的金银忍冬花粉可以采用蔗糖400g/L+硼酸127.23mg/L+2,4D75mg/L的培养液在25℃左右的培养箱内进行萌发率的测定。但是花粉的萌发情况受到多种因素的同时影响，金银忍冬花粉自身的发育程度及其周围的环境条件都会直接影响着它的萌发。不同采收时期的金银忍冬花粉成熟度不同，则具有不同的萌发率。开花当天萌发率最高，开花前1天及开花后1天，花粉萌发率较低，因此，采集开花当天的金银忍冬花粉进行超低温保存效果较好。
2)一天当中不同的采集时间花粉的萌发率也不同，在一天中从早上7:30至13:30花粉活力不断增强，从13:30至19:30花粉萌发率不断下降，在13:30时花粉活力最高。综合考虑，金银忍冬花粉最适宜采集时间为13:30左右，萌发率在90％以上。
3)金银忍冬花粉在超低温保存后采用自来水化冻，可以获得较好的冷冻效果，化冻后的金银忍冬花粉萌发率较高，而采用水浴化冻和在室温中自然化冻的方式都不适合金银忍冬花粉的萌发，得到的萌发率都相对较低。
4)花粉含水量的多少是决定花粉超低温保存成功与否的关键因素。许多花粉新采集的花粉含水量较高，在超低温保存时，细胞内水分容易结冰，细胞膜容易受损，从而引起花粉萌发率低。但是当含水量过低，细胞会由于过度脱水而死亡，萌发率也不高。不同植物花粉进行超低温保存时的适宜含水量不同。
由试验结果可知，当金银忍冬花粉含水量在13％～14％时，即未干燥的花粉的萌发率较高，说明未干燥的金银忍冬花粉适宜直接进行超低温保存，此时含水量可作为花粉超低温冷冻保存的安全含水量的参考依据。但随着干燥时间的延长和含水量的降低，花粉本身的生活力衰退严重，已经不适合进行超低温保存。