本发明涉及作物抗病育种技术领域，尤其涉及瓠瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒的接种鉴定、定量检测方法。
背景技术：
瓠瓜[Lagenaria siceraria (Molina) Standl.]又名瓠子、长瓜、蒲瓜、夜开花、葫芦等，隶属葫芦科(Cucurbitaceae)葫芦属(Lagenaria)，为一年生攀缘性草本植物。瓠瓜是我国南方地区夏季重要的瓜类蔬菜作物，也是嫁接西瓜、黄瓜首选的砧木。黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)是近年来新传入我国的有害生物，由于该病毒传播迅速、危害严重，因此对瓠瓜生产造成极大的威胁。CGMMV属于芜菁花叶病毒科(Tymoviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的一种，主要侵染黄瓜、西瓜、甜瓜、瓠瓜、南瓜等葫芦科作物，造成的产量损失高达15%以上。CGMMV侵染植株后，主要引起叶片斑驳褪绿、花叶，果实出现水渍、纤维化。该病最早于1935年在英国黄瓜上发现，随后在德国、芬兰等许多国家都有报道, 曾对日本和韩国的西瓜和甜瓜生产造成毁灭性打击；CGMMV最早在2002年随种苗进口从日本传入我国，目前在多个省份的瓠瓜叶片、砧木种子上均已检测到CGMMV病毒。鉴于CGMMV对我国葫芦科作物的严重危害，农业部已经将CGMMV确定为全国农业植物检疫性有害生物，属国家三类检疫性病害(农业部第788号公告)。
选育抗病品种是防治瓠瓜CGMMV最经济有效的方法。获得抗CGMMV种质资源是抗CGMMV育种的前提和基础，而快速、可靠、定量的接种鉴定是实现这一目标的关键。目前，瓠瓜CGMMV抗性鉴定主要使用带病毒鲜叶汁液摩擦接种的方法，虽然操作简单，但难以保证病毒的单一性。此外，瓠瓜CGMMV症状复杂，几乎无法根据植株表现进行传统的分级描述，加上CGMMV侵染后有时会出现隐症表现，使得对CGMMV发病症状的准确评价成为鉴定瓠瓜种质抗性的主要限制因素。但是，目前缺乏一种客观、定量的方法准确评价不同瓠瓜种质资源对CGMMV的抗病能力。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种瓠瓜CGMMV接种鉴定和定量分析抗性的方法，该方法首先利用携带侵染性克隆载体的菌液以子叶压触法接种瓠瓜幼苗，进而利用ELISA技术检测接种后两个时间段内瓠瓜植株体内的CGMMV吸光值，根据CGMMV的含量变化情况，综合评价不同瓠瓜种质的抗CGMMV能力，从而代替基于发病症状的表型鉴定。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种定量评价瓠瓜抗CGMMV能力的方法，该方法使用携带侵染性克隆的菌液，采用子叶压触法接种鉴定，该方法包括以下的步骤：
1）使用携带CGMMV侵染性克隆载体的农杆菌菌液，接种工作液为OD600=1的农杆菌菌液稀释100倍；
2）子叶压触法接种：将待鉴定材料播于营养钵内，置于温度和光照可控的玻璃温室内培养，光照时间为16h，白天温度控制在25-30℃，晚上控制在20-25℃；待幼苗子叶平展至一叶一心期接种，用1ml注射器吸取菌液后按压子叶背面至菌液缓慢均匀渗透入叶脉，防止穿透叶片，每个植株的2片子叶各产生1个接种点，接种后控制植株生长环境温度，白天25-30℃，晚上20-25℃，设置携带空载体的浸润缓冲液作为接种对照；
3）CGMMV病毒含量检测：接种15天后进行第一次取样，选择标准为顶芽下第一片平展的叶子，每份材料可取3-5个单株的叶片混合，使用液氮研磨后放入15ml的离心管中，分别在装入样品前后对离心管称重；接种25天后进行第二次取样，取样标准和处理方式与第一次一致；利用CGMMV专化的双抗体夹心ELISA技术测定样品中CGMMV病毒含量，每份样品加入10ml提取液，设置阴性对照、阳性对照和无样品提取液对照，按ELISA操作步骤进行，利用酶标仪读取样品在405nm波长光下的吸光值；
4）CGMMV抗性评价：利用样品吸光值反映其CGMMV的含量，计算方法为：
（样品实测吸光值-阴性对照吸光值）/样品重，
样品重=放入样品后离心管重-空离心管重；
若某一材料1g样品的吸光值超过阴性对照吸光值2倍以上时，即认为该样品为感病，若其吸光值小于或等于阴性对照2倍时，则认为该样品为抗病；
根据两个时间段内样品吸光值的变化情况综合评价某一材料的CGMMV抗性能力，评估方法为：第二次样品吸光值-第一次样品吸光值，若差值为正数，表明在两次取样间隔的时间段内，CGMMV病情进一步扩展加重；若差值为负数，表明该材料的CGMMV病情扩展较慢或得到一定程度的抑制；两次吸光值及其差值均较小的材料，判定为相对抗病的材料。
作为优选，所述的携带侵染性克隆载体由全长6243 bp 的CGMMV序列融合到带35S启动子和核酶Rz的载体pCB301-CH制备得到，携带侵染性载体的为EHA105农杆菌菌株。
本发明的有益效果是：
(1)采用携带侵染性克隆的农杆菌菌液，可以保证CGMMV病毒单一性，不同批次接种病毒的浓度和侵染活性的一致性。
(2)采用CGMMV专化的双抗体夹心ELISA技术测定病毒含量，与传统的基于发病症状分级描述相比，可以避免因表型复杂造成的分级不确定性，鉴定结果更准确、客观。
(3)接种后选择2个时间点动态监测植株体内病毒含量，可以反映病毒入侵植株后在体内的扩展情况，可以更真实、系统的评价某一材料的抗病能力。
具体实施方式
实施例1
不同浓度的侵染性克隆菌液接种效果分析：
(1)植物材料：杭州长瓜，田间表现为感CGMMV。
(2)接种鉴定：将杭州长瓜种子播种于营养钵内，置于玻璃温室内生长，光照时间为16h，白天控温25-30℃，夜晚控温20-25℃。接种工作液为OD600=1的菌液稀释10、100、1000、10000倍，即OD600=0.1、0.01、0.001、0.0001四种浓度。幼苗生长至一叶一心期后采用子叶压触法接种，每个单株产生2个接种点，每个浓度接种4株，同时选择4株接种浸润缓冲液（携带空载体的农杆菌））作为对照(ck)。接种后15天、25天后分别取样，选择标准为顶芽下第一片平展的叶子，液氮研磨、称重，加入10ml提取液，利用CGMMV专化的ELISA技术检测CGMMV，在405nm波长光下利用酶标仪检测样品吸光值。采用发明内容3的计算方法对各样品测定吸光值进行分析。
(3)鉴定结果分析：如表1所示，随着接种浓度的加大，杭州长瓜体内的病毒含量也逐步增加，OD600=0.1浓度接种的杭州长瓜在2个时间点上体内病毒含量最多，10天内病毒复制量也最大；OD600=0.0001浓度接种后病毒侵染症状最轻，OD600=0.01和OD600=0.001浓度的接种效果居中。接种浓度过高，可能造成所有材料均严重发病，难以区分不同材料的抗病能力；反之，浓度过低可能造成所有材料均表现抗病，无法筛选到真正的抗病材料，综合考虑，OD600=0.01和OD600=0.001的接种浓度较为合适。
表1. 不同浓度接种后CGMMV含量
实施例2
瓠瓜抗CGMMV种质资源鉴定
(1)植物材料：173份瓠瓜种质资源。
(2)接种鉴定：所有材料统一播于营养钵内，每份材料种6-10株，分别排成2列，置于玻璃温室内生长。使用OD600=0.01浓度的菌液，在各材料子叶平展后至一叶一心期接种，用1ml针筒按压子叶背面至菌液均匀渗透入叶片，接种后白天控温25-30℃，夜晚控温20-25℃。接种15天后对所有材料进行第一次取样，选择标准为顶芽下第一片平展的叶子，每份材料每列植株取样后混在一起，各形成2份样品，液氮研磨后称重，每份加入15ml提取液，按ELISA操作步骤进行试验，在405nm波长光下利用酶标仪检测各样品吸光值。接种25天后进行第二次取样，所有检测步骤与第一次实验一致。采用发明内容3的计算方法对各样品测定吸光值进行分析。
(3)鉴定结果分析：鉴定的173份瓠瓜材料中，两次鉴定的吸光值之间差值变异幅度很大，从OD405=-5.60到11.10，其中差值为正数的有147份材料，差值为负数的有26份材料。对单个材料而言，两个时间段取样检测的吸光值之间差值只能反映在这一时间段内CGMMV病情的发展情况，并不能完全反映该材料对CGMMV的抗病能力。为了准确评估不同材料的抗病能力，本发明认为两次吸光值及其差值均较小的材料，有可能是较为抗病的材料，以此为标准，发现有11个材料较为抗病(表2)。进一步结合其整株表型，发现这些材料症状均较轻，叶片上无明显绿脉、斑点及褪绿等典型症状，说明这些材料确实抗CGMMV，同时也说明本发明的方法可以替代表型鉴定的方法，直观、定量的反映瓠瓜种质的真实抗性。
表2 利用本发明的方法鉴定出的抗CGMMV的瓠瓜种质
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