一种快速室内鉴定向日葵抗列当水平的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种室内条件下快速诱导向日葵列当萌发的方法，即培养皿滤纸法，及其在快速向日葵抗列当水平鉴定中的应用。

背景技术：

向日葵列当(Orobanche cumana Wallr)又称毒根草，是一年生草本寄生性种子植物，属双子叶植物，列当科,主要为害向日葵、西瓜、甜瓜、豌豆、蚕豆、胡萝卜、芹菜、烟草、亚麻、番茄等。向日葵列当是目前严重威胁向日葵产业发展的一个主要病害，在我国的向日葵产区均有发生，但以新疆、内蒙古地区发生最为严重。向日葵被列当寄生后，向日葵植株矮小、瘦弱，不能形成花盘，最后导致全株枯死。筛选和培育抗列当的向日葵品种是目前最为有效的防治列当的措施。而在室内条件下建立一种快速筛选和鉴定不同向日葵品种的抗列当水平的体系是向日葵抗列当育种的前提和基础。目前已有的营养钵鉴定法在操作过程中有很多的缺点，如该方法需要大量列当种子和土壤按一定比例进行混合；在后期列当数量统计前的洗涤工作，需要大量的人力和时间；该体系不利于观察列当的各个发育阶段。本实验室建立的一种室内条件下快速鉴定向日葵抗列当水平的方法-培养皿滤纸法能够避免营养钵鉴定法的上述缺点，且这一方法的鉴定结果和田间的试验结果有非常好的一致性，因此，能够快速鉴定不同向日葵品种的抗列当水平。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种室内条件下快速诱导向日葵列当萌发的方法，即培养皿滤纸法，旨在解决目前列当种子萌发缓慢，萌发及寄生过程难以观察，实验周期长重复性差的问题，同时建立室内条件下快速诱导向日葵列当萌发的方法还可以应用在快速向日葵抗列当水平鉴定中。

本发明的目的在于提供一种室内条件下快速诱导向日葵列当萌发的方法，即培养皿滤纸法，该方法包括以下几个步骤：

步骤一：挑选饱满的向日葵种子用0.1％的次氯酸钠消毒3min，再加入75％的酒精消毒3min，然后用无菌水冲洗3次并浸泡在无菌水中2小时后取出，用湿润纱布覆盖喷水保湿，5天左右向日葵出芽。将预先催芽的向日葵幼苗置于铺有滤纸的13×13cm的塑料方皿中培养。

步骤二：向日葵列当种子的清洁和消毒后用向日葵幼苗的根系分泌进行物预处理。把从田间采集回来的向日葵列当的种子过筛网后加入蒸馏水清洗，风干后的种子中加入1ml 0.1％的次氯酸钠消毒3min，再加入75％的酒精消毒3min，最后用无菌水冲洗3次。用广口瓶水培向日葵幼苗，培养三周后，通过过滤灭菌搜集向日葵根系的分泌物。将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀的平铺在滤纸上并用上面收集的向日葵根系分泌物完全湿润滤纸。用封口膜封好培养皿后，在23-28℃黑暗的条件下放置7-10天，然后用于接种向日葵。

步骤三：向日葵列当种子接种。向日葵幼苗在方形培养皿中3-5天后，新生根系健壮时，将预处理好的向日葵列当种子随同滤纸一并移入有向日葵幼苗的培养皿中，用封口膜将培养皿封好后放置在光照培养箱中培养。每两天加蒸馏水一次，保证滤纸处于湿润的状态。

步骤四：列当种子的萌发和寄生瘤的形成的观察和寄生率的计数。接种1周后，在20X解剖镜观察向日葵列当种子的萌发数量；接种3周后用肉眼观察向日葵列当寄生瘤状结构的形成，并利用下面的公式计算列当种子的寄生率。

寄生率(％)＝[寄生瘤形成的数量(个)/接种列当种子数量(粒)]x100

本发明提供的室内条件下快速诱导向日葵列当萌发的方法，能在方形培养皿中将向日葵幼苗和向日葵列当进行共培养，诱导向日葵列当的萌发并与向日葵形成寄生关系，无需清洗即可在镜下或肉眼观察萌发过程和寄生结构。本发明达到了简捷、易行、快速诱导向日葵列当萌发的目的，能够应用在向日葵品种对列当抗性水平鉴定的实验中，实用性强、具有较强的推广与应用价值。

附图说明

图1：本发明提供的一种室内条件下快速诱导向日葵列当萌发的方法的流程图；

图2：方形培养皿中培养的向日葵幼苗；

图3：显微镜下观察向日葵列当种子的萌发；

图4：寄生瘤的形成；

图5：两种不同方法鉴定不同向日葵品种的抗列当的水平。

具体实施方式

实施例1

图1展示了本发明提供的一种室内条件下快速诱导向日葵列当萌发的方法的流程图，该方法具体步骤的操作方法如下述：

1.向日葵列当种子的消毒及预处理

1.1.向日葵列当种子的清洁

把从田间采集回来的向日葵列当的种子过筛网(直径0.18mm)以去除杂质。把去除杂质的向日葵列当种子收集放入1.5ml离心管中(1/3体积)后加入蒸馏水，并在12000r/min下离心15分钟。弃上清液后将沉淀物平铺在滤纸上，自然吹干后用毛笔轻轻扫下，存放在1.5ml离心管中备用。

1.2.向日葵列当种子的消毒处理

向上面已经清洁的向日葵列当种子中加入1ml 0.1％的次氯酸钠(1.5ml离心管)，充分震荡后静置3min。12000r/min离心后弃掉上清液，向沉淀物中再加入1ml 75％的酒精，充分震荡后，静置3min。离心弃上清后，用无菌水冲洗3次。待列当种子自然晾干后进行预处理。

1.3向日葵种子的催芽

挑选饱满的向日葵种子放于9cm的培养皿中，加入5ml 0.1％的次氯酸钠充分震荡后，静置3min。然后倒掉消毒液后再向培养皿中加入5ml 75％的酒精，充分震荡后，静置3min。倒掉75％酒精后用无菌水冲洗3次并将消毒处理的向日葵种子浸泡在无菌水中。2小时后，取出向日葵种子放入培养皿中，并用湿润纱布盖住向日葵种子，然后把湿润的毛巾盖在纱布上进行保湿。保湿期间每天向毛巾上喷水一次。待向日葵种子出芽后(5天左右)即可用于列当种子的接种处理。

1.4向日葵根系分泌物的收集

将鹅卵石用清水冲洗3次(确保其上面没有杂质和泥沙)后放入铝饭盒中，与250ml的广口瓶一起高温灭菌。然后，在灭菌的广口瓶中放入2/3体积的灭菌的鹅卵石。把已经催芽的向日葵幼苗接种在广口瓶中，用脱脂棉固定好根系后加入灭菌水将向日葵根系全部淹没。培养三周后，通过过滤灭菌收集向日葵根系的分泌物，分装在50ml离心管中放入-4℃中保存。

1.5向日葵列当种子的预处理

在直径9cm的培养皿中铺上用无菌水湿润的滤纸，然后，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀的平铺在滤纸上并用上面搜集保存的向日葵根系分泌物完全湿润滤纸。用封口膜封好培养皿后，在23-28℃黑暗的条件下放置7-10天，然后用于接种向日葵。

2.向日葵列当种子接种

把脱脂棉均匀的平铺在13×13cm的塑料方皿中，然后在上面覆盖一层滤纸，用蒸馏水将培养皿中的脱脂棉和滤纸浸湿后待用。把预先催芽的向日葵幼苗放入培养皿中(3株/皿)，用少量湿润的脱脂棉将幼苗的根系盖上(用于固定向日葵幼苗)，并在脱脂棉上面覆盖上一层湿润的滤纸(保证根系向下生长)(图2)。将培养皿直立竖放在光照培养箱中(白天28℃光照、光照强度66％；晚上18℃,保持黑暗条件，培养箱的相对湿度为50％)。3-5天后，将上面预处理好的向日葵列当种子随同滤纸一并移入有向日葵幼苗的培养皿中，用封口膜将培养皿封好后放置在光照培养箱中培养。每两天加蒸馏水一次，保证滤纸处于湿润的状态。1周后可以进行观察。

3.列当种子的萌发和寄生瘤的形成的观察和寄生率的计数

接种1周后，在20X解剖镜观察向日葵列当种子的萌发数量(图3)；接种3周后用肉眼观察向日葵列当寄生瘤状结构的形成(图4)，并利用下面的公式计算列当种子的寄生率。

寄生率(％)＝[寄生瘤形成的数量(个)/接种列当种子数量(粒)]x100

4.培养皿滤纸法鉴定向日葵抗列当水平的准确性

为了进一步确定培养皿滤纸法鉴定结果的准确性，我们对龙食葵2号、LD5009陇葵杂2号和赤KY11-23四个向日葵品种的抗列当水平在田间和室内条件下进行了鉴定，并比较了培养皿滤纸法鉴定结果的准确性。结果图5所示。田间条件下，龙食葵2号和LD5009的寄生率分别为89.0％和91.0％,为高感列当向日葵品种；而陇葵杂2号的寄生率分别为56％，为感列当品种；而赤KY11-23的寄生率为26.67％，为高抗列当品种。而利用培养皿滤纸法对上述4个向日葵品种进行的抗列当水平的鉴定结果表明龙食葵2号和LD5009的寄生率分别为94.33％和97.67％；而陇葵杂2号和赤KY11-23寄生率分别为53.33％和27.67％。培养皿滤纸法的鉴定结果和田间鉴定的结果有很好的一致性。因此我们认为培养皿滤纸法能够在室内条件下准确而快速的鉴定不同向日葵品种对列当的抗性水平。