快速测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性成分的方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性成分的方法，该方法采用超高效液相色谱?质谱联用技术对肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷二种活性成分进行定量测定，经方法学考察试验，确认本方法，分析速度更快（5分钟内完成测试），灵敏度高、重现性好，是同时测定肉苁蓉中二种活性成分含量的更快速有效手段。
【专利说明】
快速测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性成分的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种快速测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性成分的方法，尤其 涉及利用超高效液相色谱-质谱联用技术同时快速分析测定肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖 苷活性成分含量的方法。
【背景技术】
[0002] 肉灰蓉（Cistanche deserticola Ma)为列当科 Orobanchaceae 肉灰蓉属 Cistanche Hoffmg.et Link，其药用部分为干燥肉质莖，具有补肾阳，益精血，润肠通便之 功效，其主要的药效成分为苯乙醇苷类化合物。已有文献报道检测肉苁蓉中的二种主要成 分但运行时间相对较长，最长的需要60分钟才能将二个组分分开，本方法采用质谱检测器， 而且在色谱柱，流速，运行时间上都不同于以下报道的文献，特别是把运行时间缩短至5分 钟。
[0003] 在2004年中国药学杂志39(10):740-741中见报道HPLC同时测定肉苁蓉药材中松 果菊苷和毛蕊花糖苷的含量(张思巨），所用YMC-Pack 0034(5圓，25*4.6111111)色谱柱，301€ 柱温，CH3CN-MeOH-l %HAc( 10:15:75)为流动相，流速0.7mL/min，检测波长334nm，运行时间 40分钟。中国中药杂志2005，30(11): 839-841中报道的管花肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊糖苷 的含量测定（陈敏），所用色谱柱为Agilent Eclipse DB-C18(4.6*250mm，5wii)，柱温，流动 相及检测波长并无改进，只是流速改为0.6mL/min，运行时间25分钟。2007年的中国药学杂 志岛津杯全国药物分析优秀论文评选交流会中有一篇报道HPLC测定苁蓉通便口服液中松 果菊苷和毛蕊花糖苷的含量(刘兰生），Hypersil C18(4.6mmX250mm，5wii);流动相：乙腈-甲醇一 1%醋酸溶液（10:10:80);柱温，检测波长同前二年文献报道无改进;流速改为lmL/ min;运行时间为40分钟。
[0004] 2009的医学导报28(2): 231-232中报道的高效液相色谱法测定复方肉苁蓉口服液 松果菊苷与毛蕊花糖苷含量(康爱荣），该方法采用YMC-Pack 0DS-A(6.0mmX150mm，5Mi)色 谱柱，35°C柱温，流动相是甲醇-0.2%甲酸溶液，梯度洗脱，流速提高到1.0mL/min，检测波 长334nm不变，运行时间为30分钟。同年的中共现代药物应用15:14-16中报道的HPLC同时测 定壮元益生丸中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量（霍燕娴）采用高效液相色谱法，WYMC-? &〇奶034(250臟\4.6111111，5_)色谱柱为固定相，乙腈-甲醇-1%乙酸水溶液（10:13 :77)为 流动相，柱温为30°C，流速及检测波长都无变化，只是运行时间45分钟。
[0005] 在2010年的中草药41 (12): 1994-1995中报道的高效液相色谱法测定宽肠理气汤 中松果菊苷和毛蕊花糖苷(张岩），该方法采用色谱柱为Agilent C18(250mmX4.6mm，5iim)， 流动相为乙腈-1 %冰醋酸进行梯度洗脱，柱温升高到为40°C，流速检测波长仍无任何变化， 运行时间为35分钟。
[0006] 2013年中成药35(12): 2649-2653中报道的HPLC法测定蠲痹抗生丸中儿茶素、表儿 茶素、松果菊苷和毛蕊花糖苷(侯颖），Hypersil C18色谱柱(4.6mmX 150mm，5iim)，流速仍为 1. OmL/min，流动相A为1 %冰醋酸溶液，流动相B为乙腈-甲醇（1:4)，检测波长330nm，运行时 间8分钟。
[0007] 中国药师，2014(8): 1336-1338中报道的HPLC法测定强肾养心胶囊中松果菊苷和 毛蕊花糖苷的含量(陆才洋），采用色谱柱Shim-pack VP-ODS C18,流动相为甲醇-0.1%甲 酸溶液进行梯度洗脱，检测波长为330nm不变，流速同去年文献报道的并无变化，柱温为28 °C。运行时间35分钟。同年时珍国医国药5:1191-1193中报道的管花肉苁蓉不同生长时间和 部位的有效成分含量分析(杨太新），色谱柱Agilent Zorbax SB C18(150mmX4.6mm，5iim); 流动相：甲醇一0.1%甲酸梯度洗脱，流速检测波长同同年文献无区别，柱温35°C，运行时间 60分钟。
[0008] 在2015年有5篇文献报道类似的检测方法，世界科学技术-中医药，现代化17(3): 609-613中的HPLC法同时测定苁蓉总苷胶囊中松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量 (杨素徳），Waters C18色谱柱(4.6mmX 150mm，5iim)，流动相：甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗 脱;流速仍旧采用1.0mL/min;检测波长延用2013年文献报道的330nm;柱温30°C运行时间50 分钟。安徽农业科学中43(33): 171-173报道的HPLC测定肉苁蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖 苷的含量（田玉彪），Waters C18柱(4.6mm X 250mm，5_)，以甲醇-0.1 %甲酸水溶液为流动 相梯度洗脱;流速，检测波及柱温无任何变化，运行时间为40分钟；中国药师8，1404-1406中 报道的一测多评法测定肉苁蓉中2种有效成分含量（任荣军），Ultimate-C18(250mmX 4.6_，5麗）；流动相：甲醇以)-0.1%甲酸(8)，梯度洗脱;流速，检测波长及柱温均无变化； 运行时间45分钟。
[0009] 同年药典更新至以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1% 甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱;检测波长为330nm，运行时间27分钟。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于，提供一种快速分析测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性 成分的方法。该方法采用超高效液相色谱-质谱联用技术对肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷 二种活性成分进行定量测定，经方法学考察试验，确认本方法，分析速度更快(5分钟内完成 测试），灵敏度高、重现性好，是同时测定肉苁蓉中二种活性成分含量的更快速有效手段。
[0011] 本发明所述的一种快速测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性成分的方法，利 用高效液相色谱-质谱条件，具体操作按下列步骤进行：
[0012] a、超高效液相色谱条件：色谱柱:Hypersil G0LD，C18 100X2.1mm，1.9iim;流动相 体积百分比为A-〇. 1 %甲酸水溶液，B-甲醇；按时间Omin，3. Omin，4. Omin，4. lmin，5. Omin， 分别用浓度为80%，28%，28%，80%，80%的A-0.1%甲酸水溶液和浓度为20%，72%， 72%，20%，20%的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速:0.2mL/min;柱温:室温;进样量:5yL;
[0013] b、质谱条件:离子源电压:-3000v;离子源温度:200°C ;鞘气:35arb;辅助气:8arb; 离子传输毛细管温度:350°C ;离子源类型：电喷雾离子源，毛蕊花糖苷保留时间3.7分钟，母 离子m/z 623.154,特征碎片离子162.229和461.374(为定量离子）；松果菊苷保留时间是 3.3分钟，母离子m/z 785.189,特征碎片离子是m/z 477.305和623.471 (为定量离子）； [0014] c、对照品溶液的制备：精密称取各组分l.OOmg，分别用甲醇溶解定容至lmL，作为 对照品溶液储备液；
[0015 ] d、样品溶液的制备:参照中国药典2015版；
[0016] e、标准曲线的绘制:精密移取松果菊苷和毛蕊花糖苷二种活性成分，用稀释剂为 体积比80: 20的水：甲醇分别稀释103，5 X 103，104,5 X 104，105，5 X 105倍，得到混标溶液;按 色谱条件进行超超高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得各组分标准 曲线，计算回归方程；
[0017] f、精密度试验：连续进样6针，测得峰面积RSD 0.59 %-0.79%，相对保留时间 RSD0.11%-0.13% ；
[0018] g、重复性试验:取肉苁蓉粉末lg，共7份，精密称定，按步骤d提取并分析；
[0019] h、稳定性试验:取步骤d中同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8h进样，测定其中 松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，并计算RSD值；
[0020] i、样品含量测定:精密吸取样品待测液，按色谱条件进行超高效液相色谱-质谱分 析，并将峰面积带入标准曲线，分别计算松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明标样中样品的谱图，其中RT:3.70为肉苁蓉有效成分毛蕊花糖苷，RT: 3.26为肉苁蓉有效成分松果菊苷；
[0022]图2为本发明实例样品中的谱图，其中RT:3.70为肉苁蓉有效成分毛蕊花糖苷，RT: 3.27为肉苁蓉有效成分松果菊苷。
【具体实施方式】 [0023] 实施例
[0024] 本发明所述的一种快速测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性成分的方法，具 体操作按下列步骤进行：
[0025] 仪器条件：
[0026] 超高效液相色谱条件:色谱柱:Hypersil GOLD,C18 100X2.1mm，1.9iim;流动相： A-0.1 %甲酸水溶液;B-甲醇;洗脱程序如下:0-3分钟，A 80%-28% ; 3-4分钟，A 28% ;4.0-4 ? 1分钟A 28 % -80 % ; 4 ? 1-5 ? 0分钟A 80 % ;流速:0 ? 2mL/min;柱温:室温;进样量:5yL;
[0027]质谱条件:离子源电压:-3000v;离子源温度:200°C ;鞘气:35arb;辅助气:8arb;离 子传输毛细管温度:350°C ;电喷雾离子源
[0028]
[0029]对照品溶液的制备:精密称取各组分l.OOmg，分别用甲醇溶解定容至lmL，作为对 照品溶液储备液；
[0030]样品溶液的制备:参照中国药典2015版；
[0031]标准曲线的绘制:精密移取松果菊苷和毛蕊花糖苷二种活性成分，用稀释剂为体 积比80:20的水：甲醇分别稀释103，5 X 103，104,5 X 104,105，5 X 105倍，得到混标溶液;按色 谱条件进行超超高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得各组分标准曲 线，计算回归方程；
[0032] 精密度试验：连续进样6针，测得峰面积RSD 0.59%-0.79%，相对保留时间 RSD0 ? 11 % -0 ? 13 % ;测得回收率为97 ? 64 % -107 ? 36 %，相对标准偏差RSD 1 ? 56 % -3 ? 88 % ;
[0033]
[0034] 重复性试验:取肉苁蓉粉末约lg，共7份，精密称定，按样品溶液的制备(参照中国 药典2015版)提取并分析，结果为：
[0036]稳定性试验:取重复性试验中同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8h进样，测定其 中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，并计算RSD值分别为0.6%，0.5% ;
[0037]样品含量测定：精密吸取样品待测液，按色谱条件进行超高效液相色谱-质谱分 析，并将峰面积带入标准曲线，分别计算松果菊苷的含量为15.08-18.96mg/g，毛蕊花糖苷 的含量为 5.06-5.48mg/g。
【主权项】
1. 一种快速测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性成分的方法，其特征在于利用高 效液相色谱-质谱条件，具体操作按下列步骤进行： a、 超高效液相色谱条件:色谱柱：Hypersil G0LD，C18 100X2.1mm，1.9ym;流动相体 积百分比为A-0.1%甲酸水溶液，B-甲醇;按时间0min，3.0min，4.0min，4.1min，5.0min， 分别用浓度为80%，28%，28%，80%，80%的A-0.1%甲酸水溶液和浓度为20%，72%，72%，20%，20% 的甲醇溶液进行梯度洗脱，流速:〇. 2mL/min;柱温:室温;进样量:5yL; b、 质谱条件:离子源电压:-3000v;离子源温度:200°C ;鞘气：35arb;辅助气:8arb;离子 传输毛细管温度:350°C ;离子源类型：电喷雾离子源，毛蕊花糖苷保留时间3.7分钟，母离子 m/z 623.154,特征碎片离子162.229和461.374;松果菊苷保留时间是3.3分钟，母离子m/z 785.189，特征碎片离子是m/z 477.305和623.471; c、 对照品溶液的制备:精密称取各组分l.OOmg，分别用甲醇溶解定容至lmL，作为对照 品溶液储备液； d、 样品溶液的制备:参照中国药典2015版； e、 标准曲线的绘制：精密移取松果菊苷和毛蕊花糖苷二种活性成分，用稀释剂为体积 比80: 20的水：甲醇分别稀释103，5 X 103，104，5 X 104，105，5 X 105倍，得到混标溶液;按色谱 条件进行超超高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得各组分标准曲 线，计算回归方程； f、 精密度试验:连续进样6针，测得峰面积RSD 0.59%-0.79%，相对保留时间RSD 0.11%- 0.13%； g、 重复性试验:取肉苁蓉粉末lg，共7份，精密称定，按步骤d提取并分析； h、 稳定性试验:取步骤d中同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、81!进样，测定其中松果 菊苷和毛蕊花糖苷的含量，并计算RSD值； i、 样品含量测定：精密吸取样品待测液，按色谱条件进行超高效液相色谱-质谱分析， 并将峰面积带入标准曲线，分别计算松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。
【文档编号】G01N30/02GK106053626SQ201610319728
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】李洪敏, 牟书勇, 伏玉
【申请人】中国科学院新疆生态与地理研究所