本发明涉及在编码cd163蛋白的基因中包含至少一个修饰的染色体序列的非人动物及其后代。本发明进一步涉及含有这种修饰的染色体序列的动物细胞。动物和细胞对病原体(包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv))具有增强的抗性。动物和后代具有cd163基因的染色体修饰，从而抑制prrsv进入和复制，并且所得动物显示出对由病毒引起的疾病和综合征的抗性。本发明进一步涉及使用这种方法制备以产生抗病原体动物和动物种群的育种方法。本发明还涉及用于涉及直接注射胚胎的cd163基因编辑的方法和对病原体(如prrsv)具有抗性的动物、始祖动物(founderanimal)和系的开发方法。
背景技术：
：：猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)属于一组哺乳动物动脉炎病毒，其也包括鼠乳酸脱氢酶增高病毒(murinelactatedehydrogenase-elevatingvirus)，猿出血热病毒(simianhemorrhagicfevervirus)和马动脉炎病毒(equinearteritisvirus)。动脉炎病毒具有与病毒发病相关的重要特性，包括巨噬细胞的趋向性以及引起严重疾病和持续感染的能力。由感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)引起的临床疾病综合征于1987年在美国首次被报道(keffaber，1989)，后来1990年在欧洲被报道(wensvoort等，1991)。感染prrsv会导致呼吸疾病，包括咳嗽和发烧、妊娠后期的生殖障碍以及生长性能下降。病毒还参与各种多种微生物疾病综合征的相互作用，同时维持终生亚临床感染(rowland等，2012)。自从出现以来，prrs已经成为北美、欧洲和亚洲中商业猪最重要的疾病，只有澳大利亚和南极洲的洲没有该疾病。仅在北美，prrsv相关损失估计每年花费生产者664亿美元(holtkamp等，2013)。在2006年中，一种更为严重形式的疾病称为高致病性prrs(hp-prrs)，使得全中国的猪种群数量减少。遗传多样性限制了有效控制和消除疾病所需的疫苗的开发。虽然天然抗性的遗传选择可能是一种选择，但迄今为止结果是有限的(boddicker等，2014)。北美和欧洲病毒之间的分子比较将所有prrsv分离株分别置于两种基因型中的一种，即2型或1型。即使这两种基因型在核苷酸水平上只有约70％的一致性(nelsen等，1999)，但是两者都具有cd163阳性细胞的趋向性，可建立长期感染并产生类似的临床症状。cd163是由9个清道夫受体半胱氨酸富集(srcr)结构域组成的130kda1型膜蛋白(fabriek等，2005)。猪cd163含有17个外显子，其编码一个肽信号序列，该肽信号序列后面接有9个srcr结构域、2个连接子结构域(也称为脯氨酸丝氨酸苏氨酸(pst)结构域，位于srcr6和srcr9之后)和1个后面接有短细胞质尾巴的细胞质结构域。cd163的表面表达受限于单核-巨噬细胞谱系的细胞。蛋白首先在人组织中被鉴定，因为其能够结合血红蛋白-触珠蛋白(hbhp)复合物(kristiansen等，2001)。hbhp清除是cd163的主要功能，位于srcr3(madsen等，2004)。巨噬细胞在hbhp降解后释放的代谢物包括胆红素、co和游离铁。cd163的一个重要功能是预防由游离血红蛋白引起的氧化毒性(kristiansen等，2001；soares等，2009)。作为prrsv受体的cd163首先由calvert等描述(2007年)。用包括猿，人，犬和小鼠在内的多种物种的cd163cdna转染非容纳细胞系可使细胞容纳prrsv感染(calvert等，2007)。除cd163外，第二种受体蛋白cd169(也称为唾液酸粘附素或siglec1)被鉴定为参与形成与gp5-基质(m)异源二聚体)的初始相互作用的初级prrsv受体，即病毒粒子表面上的主要蛋白(delputte等，2002)。在该模型中，cd163与gp2，3，4异源三聚体在内体区室(endosomalcompartment)中的后续相互作用介导了未包衣和病毒基因组释放进入细胞质(vanbreedam等，2010，allende等，1999)。先前描述prrsv感染肺泡巨噬细胞的模型鉴定了siglec1(cd169)作为巨噬细胞表面上的主要病毒受体；然而，与野生型猪相比，先前使用siglec1-/-猪的工作显示病毒复制没有差异(prather等，2013)。这些结果支持先前的体外研究，表明缺乏表面cd169和cd163的抗prrsv细胞系在用cd163质粒转染后支持病毒复制(welch等，2010)。prrsv发病机理(特别是在分子水平)和流行病学两者的许多特征都很难理解，因此使得控制工作困难。目前生产者经常用修饰活减毒的菌株或杀死病毒疫苗对猪接种prrsv疫苗，但目前疫苗通常不能提供令人满意的保护。这是由于菌株变化和免疫系统刺激不足造成的。除了担心可用的prrsv疫苗的功效之外，有强有力的证据表明，目前使用的修饰活疫苗可以持续存在于个体猪和猪群中并积累突变(mengeling等,am.j.vet.res,60(3):334–340(1999))，正如已经在猪的实验性感染之后用毒性野外分离株所证明的(rowland等,virology,259:262–266(1999))。此外，已经显示疫苗病毒在接种过的公猪的精液中流出(christopher-hennings等,am.j.vet.res,58(1):40–45(1997))。作为接种疫苗的替代方法，一些专家正在倡导一种育种群体的“测试和消除”策略(deeandmolitor,vet.rec.,143:474–476(1998))。这种策略的成功应用取决于将所有急性或持续感染prrsv的猪都去除，然后进行严格控制以防止病毒再次引入。与此策略相关的困难和大部分费用是由于对关于持续性prrsv感染的发病机理知之甚少，因此没有可靠的技术来鉴定持续感染的猪。可以看出，本领域中存在开发诱导动物的prrsv抗性的策略的需要。技术实现要素：提供了在编码cd163蛋白的基因中包含至少一个修饰的染色体序列的非人动物、其后代以及动物细胞。还提供了产生对病原体感染的易感性降低的动物或谱系的育种方法。该方法包含遗传修饰卵母细胞或精子细胞以将在编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列引入到卵母细胞和精子细胞的至少一个中，并用精子细胞使卵母细胞受精以产生含有在编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列的受精卵。或者，该方法包含遗传修饰受精卵以将在编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列引入到受精卵中。该方法进一步包含将受精卵移植到代孕雌性动物中，其中，怀孕和足月分娩产生后代动物，筛选后代动物对病原体的易感性，以及选择与在编码cd163蛋白的基因中不包含修饰的染色体序列的动物相比对病原体具有降低的易感性的后代动物。还提供了通过育种方法制成的动物种群。进一步提供增加家畜动物对病原体感染的抗性的方法。该方法包含遗传编辑来自编码cd163蛋白的基因的至少一个染色体序列，因此与在编码cd163蛋白的基因中不包含编辑的染色体序列的家畜动物中的cd63蛋白产生或活性相比，cd163蛋白产生或活性降低。本文提供的编码cd163蛋白的基因中的染色体序列的修饰降低了动物，后代，细胞或种群(例如猪类动物，后代，细胞或种群)对病原体(例如诸如猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的病毒)的易感性。在本文提供的任何动物，后代，细胞，种群和方法中，修饰的染色体序列可以导致动物，后代，细胞或种群基本上不产生功能性cd163蛋白。在本文提供的任何动物，后代，细胞，种群和方法中，修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的框内缺失。在本文提供的任何猪类动物，后代，细胞，种群和方法中，修饰的染色体序列可以包含seqidno：118。或者，在编码cd163蛋白的基因中的染色体序列的修饰可以包含：与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3147的124个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3146的123个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3147和3148之间的1个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3159的130个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3161的132个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸1525至核苷酸3030的1506个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2724至核苷酸4096的1373个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸4531的1387个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2440至核苷酸4160的1720个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失；或其任何组合。还提供了核酸。核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：(a)包含seqidno：47的核苷酸序列；(b)与seqidno：47的序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列，其中，相对于seqidno：47，所述核苷酸序列含有至少一个置换、插入或缺失；和(c)(a)或(b)的cdna序列。例如，核酸分子可以包含：(a)与seqidno：47的序列具有至少87.5％序列一致性的核苷酸序列，其中，相对于seqidno：47，所述核苷酸序列含有至少一个置换、插入或缺失；或(b)(a)的cdna序列。还提供了其它核酸。该核酸可以包含seqidno：98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，118或119。任何核酸分子可以是分离的核酸分子。其它目的和特征将部分显而易见，并在下文中部分指出。附图说明图1.用于修饰cd163的靶向载体和crispr。a图片描述了使用crispr靶向修饰的cd163基因的野生型外显子7，8和9。b图片示出了该靶向载体被设计为用编码cd163l的人srcr8的dna替换猪外显子7(cd163的猪结构域srcr5)。该靶向载体用于通过g418进行药物选择的转染。用于长程、左臂和右臂测定的pcr引物用对1230，3752，8791，7765和7775的箭头标记。c图片描述了与b组中所示的靶向载体相同的靶向载体，但是其中neo盒被去除。该靶向载体用于靶向已经抗新霉素的细胞中的cd163。用箭头说明用于小缺失测定的引物并标记为gcd163f和gcd163r。d图片强调了由crispr靶向的外显子。crispr10，131，256和282的位置由外显子7上向下的箭头表示。crispr数字表示内含子6和外显子7的内含子-外显子连接处的碱基对的数目。图2.用于修饰cd1d的靶向载体和crispr。a图片描述了由crispr靶向修饰的cd1d基因的野生型外显子3，4，5，6和7。b图片示出了该靶向载体被设计为用选择标记neo替换外显子3。该靶向载体与crispr结合用来修饰cd1d。用于长程、左臂和右臂测定的pcr引物用对3991，4363，7373和12806的箭头标记。c图片描述了由crispr靶向的外显子。crispr4800，5350，5620和5626的位置由外显子3上向下的箭头表示。用箭头说明用于小缺失测定的引物并标记为gcd1df和gcd1dr。图3.通过crispr/cas9和scnt产生cd163和cd1d敲除猪。a)用crispr/cas9和供体dna转染后体细胞中cd163的靶向缺失。野生型(wt)基因型导致6545个碱基对(bp)带。泳道1-6表示用具有cas9的crispr10和含有neo的供体dna单一转染的六个不同菌落。泳道1、4和5示出了1500-2000bp的大的纯合缺失。泳道2表示较小的纯合缺失。泳道3和6表示wt等位基因和两个等位基因的小缺失或双等位基因修饰。每个菌落的准确修饰只能通过对用于scnt的菌落进行测序来确定。一些泳道中的微弱的wt带可能表示来自相邻wt菌落的胎儿成纤维细胞的交叉污染。ntc＝没有模板的对照。b)用crispr/cas9和供体dna转染后体细胞中cd1d的靶向缺失。wt基因型导致8729bp的带。泳道1-4表示具有cd1d的500-2000bp缺失的菌落。泳道4似乎是wt菌落。ntc＝没有模板的对照。c)在研究期间由scnt产生的cd163敲除猪的图像。该雄性仔猪含有纯合的cd163的1506bp缺失。d)研究期间产生的cd1d猪的图像。这些仔猪含有cd1d的1653bp缺失。e)含有cd163的1506bp缺失的两窝scnt的基因型。泳道1-3(窝63)和1-4(窝64)表示来自每窝的每个仔猪的基因型。母猪表示scnt胚胎的雌性受体，wt表示野生型对照。ntc＝没有模板的对照。f)含有cd1d的1653bp缺失的两窝scnt的基因型。泳道1-7(窝158)和泳道1-4(窝159)表示每个仔猪的基因型。图4.crispr/cas9系统在猪胚胎中的作用。a)将不同浓度的crispr/cas9系统注射到合子中后的胚囊形成频率。crispr/cas9系统的毒性在10ng/μl时最低。b)当引入到合子中时，crispr/cas9系统可成功破坏胚囊中egfp的表达。原始放大倍数x4。c)使用crispr/cas9系统在egfp上产生的突变类型：wt基因型(seqidno：16)，#1(seqidno：17)，#2(seqidno：18)和#3(seqidno：19)。图5.crispr/cas9系统在猪胚胎中靶向cd163的作用。a)由crispr/cas9系统在cd163上产生的突变实例：wt基因型(seqidno：20)，#1-1(seqidno：21)，#1-4(seqidno：22)和#2-2(seqidno：23)。通过dna测序检查的所有胚胎在cd163(18/18)上显示突变。crispr131以粗体突出显示。b)测序读取由crispr/cas9系统引起的纯合缺失。图像表示来自a图片的携带cd163的2bp缺失的#1-4。图6.引入两种类型的crispr时的crispr/cas9系统的作用。a)用作为合子的crispr/cas9注射的胚囊中cd163的pcr扩增。泳道1、3、6和12示出了两种不同crispr之间设计的缺失。b)用作为合子的crispr/cas9注射的胚囊中cd1d的pcr扩增。当与cd163相比时，通过凝胶电泳测定cd1d具有较低的缺失频率(3/23)；泳道1、8和15示出了在cd1d中的明显缺失。c)当系统提供两种靶向cd163和egfp的crispr时，crispr/cas9系统成功靶向两种基因。示出了cd163和egfp的修饰：cd163wt(seqidno：24)，cd163#1(seqidno：25)，cd163#2(seqidno：26)，cd163#3(seqidno：27)，egfpwt(seqidno：28)，egfp#1-1(seqidno：29)，egfp#1-2(seqidno：30)，egfp#2(seqidno：31)和egfp#3(seqidno：32)。图7.通过crispr/cas9系统注射到合子中所产生的cd163敲除猪。a)来自敲除猪的cd163的pcr扩增；在仔猪67-2和67-4中检测到明显的缺失迹象。b)具有代孕的cd163敲除猪的图像。所有的动物都是健康的，没有任何异常迹象。c)cd163敲除猪的基因型。野生型(wt)序列如seqidno：33所示。两头动物(来自窝67-1(seqidno：34)和67-3(seqidno：37))携带cd163中的纯合缺失或插入。另两头动物(来自窝67-2和67-4)携带cd163的双等位基因修饰：#67-2a1(seqidno：35)，#67-2a2(seqidno：36)，#67-4a1(seqidno：38)和#67-4a2(seqidno：39)。缺失是由于引入两个不同的具有cas9的crispr系统引起的。来自用于cd163的合子注射的动物没有显示出嵌合基因型。图8.通过crispr/cas9系统注射到合子中所产生的cd1d敲除猪。a)来自敲除猪的cd1d的pcr扩增；166-1示出了cd1d的嵌合基因型。166-2、166-3和166-4不显示扩增子的大小变化，但扩增子的测序显示出修饰。wtff＝野生型胎儿成纤维细胞。b)长程分析的pcr扩增示出了仔猪166-1和166-2中的一个等位基因的明显缺失。c)具有代孕的cd1d敲除猪的图像。d)cd1d敲除猪的序列数据；wt(seqidno：40)，#166-1.1(seqidno：41)，#166-1.2(seqidno：42)，#166-2(seqidno：43)，#166-3.1(seqidno：44)，#166-3.2(seqidno：45)和#166-4(seqidno：46)。外显子3中的atg起始密码子以粗体和小写显示。图9.急性prrsv感染期间的临床症状。每日评估cd163+/+(n＝6)和cd163-/-(n＝3)出现呼吸症状和发热的结果。图10.急性prrsv感染期间的肺组织病理学。来自野生型和敲除猪的h和e染色组织的代表性显微照片。左面图片显示单核细胞的水肿和浸润。来自敲除猪的右面图片显示正常肺的肺结构。图11.各种基因型中的病毒血症，请注意cd163-/-仔猪数据位于x轴。图12.无效、野生型和未表征的等位基因猪中的抗体产生。图13.单头猪中cd163的细胞表面表达。在未表征a、未表征b和cd163+/+图片中右侧出现的线表示cd163抗体，而在这些图片的左侧出现的线是没有抗体的对照(背景)。注意到在cd163-/-动物中，cd163染色与背景对照重叠，并且未表征的等位基因中的cd163染色大致在wt水平和背景之间的一半(也注意到这是对数标度，从而小于～10％)。图14.来自三头代表性猪和无抗体对照的肺泡巨噬细胞上的cd169水平(fitc标记的抗cd169)。图15.各种基因型的病毒血症。请注意δ43氨基酸仔猪数据位于x轴。图16.用作参考序列(seqidno：47)的野生型cd163外显子7-10的基因组序列。该序列包括外显子7上游3000bp至外显子10的最后一个碱基。下划线区域分别示出了外显子7，8，9和10的位置。图17.由猪肺泡巨噬细胞(pam)表面cd163的水平测量以说明几种cd163基因修饰、每种修饰的预测蛋白产物和每种修饰的相对巨噬细胞表达的cd163基因修饰的图。黑色区域表示内含子，白色区域表示外显子。阴影区域表示hcd163l1外显子11模拟物，猪外显子7的同系物。灰色区域表示与pgkneo构建体合成的内含子。图18.猪cd163蛋白和基因序列的图。a)cd163蛋白srcr(椭圆形)和pst(正方形)结构域以及相应的基因外显子。b)猪cd163srcr5(seqidno：120)与人cd163l1srcr8(seqidno：121)同系物的比较。图19.在野生型和cd163修饰猪的pam上表面表达cd163和cd169的代表性结果。图a-e示出了如图17所示的cd163基因修饰的结果。对于d7(1467)和d7(1280)的合并数据显示在图片d中。图20.野生型和cd163修饰的猪的血清触珠蛋白水平。图21.野生型和hl11mpam对2型prrsv分离株感染的相对允许度。图22.用1型和2型prrsv分离株感染cd163修饰的猪。图23.用2型病毒感染野生型(wt)和cd163修饰猪的病毒载量。具体实施方式本文提供了动物和用于产生具有cd163基因修饰并且对prrsv及其它相关的呼吸道病毒感染具有抗性的基因编辑动物的方法。该动物具有失活或以其它方式调节cd163基因活性的染色体修饰(插入或缺失)。prrsv进入细胞和病毒复制需要cd163。因此，当进行试验时，无效cd163动物显示对prrsv感染的抗性。这些动物可以使用基因编辑中的任一种实验方案来创建。本文还提供了用于制备猪类动物的方法，其包含向猪类动物细胞或猪类胚胎中引入与细胞的染色体靶位点特异性结合并引起双链dna断裂或以其它方式使用基因编辑方法(例如规律成簇间隔短回文重复(crispr)/cas系统，转录激活因子样效应子核酸酶(talen)，锌指核酸酶(zfn)，重组酶融合蛋白或大范围核酸酶)失活或降低其中的cd163基因或蛋白的活性的试剂。本文还描述了与能够实现cd163基因座内的特定核酸序列的剪切和/或整合的多肽串联的一个或多个特定cd163基因座的应用。与能够实现cd163基因座的剪切和/或整合的多肽或rna串联的cd163基因座的应用的示例包括选自由锌指蛋白，大范围核酸酶，tal结构域，talen，rna引导的crispr/cas重组酶，亮氨酸拉链，以及本领域技术人员已知的其它酶组成的组。特定实例包括包含位点特异性dna结合结构域多肽和剪切结构域多肽(例如核酸酶)的嵌合(“融合”)蛋白，例如包含锌指多肽和foki核酸酶多肽的zfn蛋白。本文描述了包含特异性结合cd163基因的dna结合结构域的多肽。这样的多肽还可以包含核酸酶(剪切)结构域或半结构域(例如归巢核酸内切酶，包括具有修饰的dna结合结构域的归巢核酸内切酶)和/或连接酶结构域，使得多肽可以诱导靶向的双链断裂，和/或促进在中断位点感兴趣的核酸的重组。靶向cd163基因座的dna结合结构域可以是dna剪切功能结构域。前述多肽可用于在一个或多个cd163基因座处将外源核酸引入到宿主生物体(例如动物物种)的基因组中。dna结合结构域可以包含具有一个或多个锌指(例如2，3，4，5，6，7，8，9或更多个锌指)的锌指蛋白，其被改造(非天然存在)以结合cd163基因内的任何序列。本文所述的任何锌指蛋白可以与靶基因的编码序列内或相邻序列(例如启动子或其它表达元件)内的靶位点结合。锌指蛋白可以结合cd163基因中的靶位点。定义单位、前缀和符号可以用它们的si接受形式表示。除非另有说明，否则核酸以5'至3'的方向从左至右书写，氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。在说明书中列举的数字范围包括定义范围的数字，并包括在定义范围内的每个整数。在本文中氨基酸可以通过其公知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号被提及。同样，核苷酸可以用它们通常被接受的单字母代码来表示。除非另有规定，否则本文所用的软件，电气和电子术语可以如“ieee电气和电子术语标准辞典”(1993年第5版)中所定义的。以下定义的术语通过参考整个说明书而更全面地被定义。如本领域技术人员理解的，为了任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文列举的所有范围还包括任何和所有可能的子范围以及其子范围的组合，以及组成该范围的各个值，特别是整数值。所引用的范围包括该范围内的每个特定值，整数，小数或等同。任何列出的范围都可以被容易地识别为足以描述和使相同范围被分解为至少相等的二分之一，三分之一，四分之一，五分之一或十分之一。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等。当介绍本发明的元件或其优选实施方式时，冠词“一个”，“一种”，“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个元件。术语“包含”，“包括”和“具有”旨在是包含性的，并且意味着除了列出的元件之外可以存在额外元件。术语“和/或”是指项目中的任一个，项目的任何组合或者与该术语相关联的所有项目。本领域技术人员容易理解短语“一个或多个”，特别是当在其使用的上下文中阅读时。“结合蛋白”是能够与另一分子结合的蛋白。结合蛋白可以结合例如dna分子(dna结合蛋白)、rna分子(rna结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。在蛋白结合蛋白的情况下，它可以与自身结合(形成同源二聚体，同源三聚体等)和/或其可以结合一种不同的蛋白或蛋白的一个或多个分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有dna结合、rna结合和蛋白结合活性。术语“保守性修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，“保守性修饰的变体”是指编码氨基酸序列的相同或保守性修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子gca，gcc，gcg和gcu都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子可被改变成所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”并且代表保守性修饰的变异的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也参照遗传密码描述了核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的aug，和通常为色氨酸的唯一密码子的ugg)可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个描述的多肽序列中，并且在本发明的范围内。对于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别置换、缺失或添加(其改变、添加或缺失单个氨基酸或在编码序列中的小百分比氨基酸)是“保守性修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸的氨基酸置换。因此，例如，可以如此改变选自由1至15组成的整数组中的任何数目的氨基酸残基。因此，例如可以进行1，2，3，4，5，7或10次改变。保守性修饰的变体通常提供与它们所来源的未修饰的多肽序列相似的生物学活性。例如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为其天然底物的天然蛋白质的至少30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。以下六组各自含有互为保守置换的氨基酸：[1]丙氨酸(a)，丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；[2]天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；[3]天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；[4]精氨酸(r)，赖氨酸(k)；[5]异亮氨酸(i)，亮氨酸(l)，甲硫氨酸(m)，缬氨酸(v)；和[6]苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，色氨酸(w)。另参见creighton(1984)proteinsw.h.freemanandcompany。术语“crispr”代表“规律成簇间隔短回文重复”。术语“cas9”是指“crispr相关蛋白9”。术语“crispr/cas9”或“crispr/cas9系统”是指用于基因工程的可程序性核酸酶系统，其包括cas9蛋白或其衍生物，以及一个或多个可提供cas9的crisprrna(crrna)和反式活化rna(tracrrna)功能的非编码rna。crrna和tracrrna可以单独地使用，也可以组合产生“引导rna”(grna)。crrna或grna提供与基因组靶标互补的序列。下文进一步描述crispr/cas9系统。本文中提到的从核苷酸x到核苷酸y的核苷酸序列中的缺失是指该范围内的所有核苷酸已被缺失，包括x和y。因此，例如，短语“与seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失”是指3317至3147核苷酸中的每一个都已被缺失，包括核苷酸3317和3147。“抗病性”是动物的一个特征，其中，所述动物避免作为动物-病原体相互作用(例如猪和prrsv之间的相互作用)的结果的疾病症状，也就是说，防止病原体引起动物疾病和相关的疾病症状，或者降低临床体征的发生率和/或严重程度或减少临床症状。本领域技术人员应理解的是，本文公开的组合物和方法可以与本领域可用于保护动物免受病原体攻击的其它组合物和方法一起使用。就指定的核酸而言，“编码”或“编码的”是指包含用于翻译成指定蛋白的信息。编码蛋白的核酸可以包含在核酸的翻译区内的插入序列(例如内含子)中，或者可以缺少这种插入的非翻译序列(例如，如在cdna中)。蛋白编码的信息通过使用密码子来指定。通常，氨基酸序列由核酸使用“通用”遗传密码编码。当合成制备或改变核酸时，可以利用待表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好。如本文所用，“基因编辑”，“基因编辑的”，“遗传编辑”和“基因编辑效应子”是指使用归巢技术与天然存在或人工改造的核酸酶，也称为“分子剪刀”、“归巢核酸内切酶“或”靶向核酸内切酶“。核酸酶在基因组的期望位置产生特定的双链染色体断裂(dsb)，在一些情况下利用细胞的内源机制修复由同源重组(hr)和/或非同源末端连接(nhej)的自然过程诱导的断裂。基因编辑效应子包括锌指核酸酶(zfn)，转录激活因子样效应子核酸酶(talen)，规律成簇间隔短回文重复/cas9(crispr/cas9)系统和大范围核酸酶(例如重新设计为归巢核酸内切酶的大范围核酸酶)，这些术语还包括使用转基因程序和技术，包括例如其中改变是缺失或相对较小的插入(通常小于20nt)和/或不引入来自外来物种的dna。该术语还包括后代动物，例如由最初基因编辑的动物通过有性杂交或无性繁殖产生的后代动物。如本文所用，关于核酸的“异源”是源自外来物种的核酸，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预在组成和/或基因组位置上基本上由其天然形式而被修饰。例如，与异源结构基因可操作连接的启动子来自与衍生出结构基因的物种不同的物种，或者如果来自同一物种，则其中一个或两个基本上由其原始形式而被修饰。异源蛋白可能源自外来物种，或者如果来自同一物种，则通过有意的人为干预基本上由其原始形式而被修饰。如本文所用，“归巢dna技术”，“归巢技术”和“归巢核酸内切酶”涵盖允许特定分子靶向特定dna序列的任何机制，所述特定dna序列包括锌指(zf)蛋白，转录激活因子样效应子(tale)大范围核酸酶，和crispr/cas9系统。本文中术语“增加的抗性”和“降低的易感性”是指，但不限于，与病原体感染相关的临床体征或临床症状的发病率和/或严重程度的统计学显著降低。例如，“增加的抗性”或“降低的易感性”可以指与具有未修饰的染色体序列的对照动物相比包含在编码cd163蛋白的基因中的至少一个修饰的染色体序列的动物中与prrsv感染相关的临床体征或临床症状的发病率和/或严重程度的统计学显著降低。术语“临床症状的统计学显著降低”是指，但不限于，在用感染剂进行试验后，编辑组受试者中至少一种临床症状的发生频率比未编辑的对照组低至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少70％。如本文所用，术语“敲入”是指用转基因或用具有相同结构修饰的相同的内源基因替换内源基因，但保留内源基因的转录控制。“敲除”是指破坏基因的结构或调节机制。敲除可通过靶向载体、替换载体或打靶载体(hit-and-runvector)的同源重组或基因捕获载体的随机插入而产生，导致基因功能的完全、部分或条件丧失。术语“动物”包括任何非人动物，例如家畜(例如家畜动物)。术语“家畜动物”包括传统上在家畜饲养中饲养的任何动物，例如猪类动物，牛类动物(例如肉奶牛)，绵羊类动物，山羊类动物，马类动物(例如马或驴)，水牛，骆驼或禽类动物(例如鸡，火鸡，鸭，鹅，珍珠鸡或乳鸽)。术语“家畜动物”不包括大鼠，小鼠或其它啮齿动物。如本文所使用，与野生型序列相比，术语“突变”包括多核苷酸的核苷酸序列中的改变，例如基因或编码dna序列(cds)。该术语包括，但不限于，置换、插入、移码、缺失、倒位、易位、重复、剪接供体位点突变、点突变等。如本文所用，“可操作连接”包括提及两个核酸序列(例如启动子序列和第二序列)之间的功能性连接，其中，启动子序列启动并介导对应于第二序列的dna序列的转录。一般而言，可操作连接是指所连接的核酸序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连续地连接两个蛋白编码区。如本文所用，“多核苷酸”包括提到的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或保守性修饰的变体；该术语还可以指具有天然核糖核苷酸的基本性质的类似物，因为它们在严格杂交条件下与基本上与天然存在的核苷酸相同的核苷酸序列杂交和/或允许翻译成与天然存在的核苷酸(一种或多种)相同的氨基酸(一种或多种)。多核苷酸可以是天然或异源结构或调控基因的全长或子序列。除非另有说明，否则该术语包括提及的特定序列及其互补序列。因此，具有因稳定性或其它原因而修饰的主链dna或rna是本文所用的术语“多核苷酸”。另外，包含不常见碱基(例如肌苷)或修饰的碱基(例如三苯甲基化碱基)的dna或rna(仅举两个实例)是本文所用术语的多核苷酸。可以理解的是，对本领域技术人员已知的用于许多有用目的的dna和rna已经进行了各种各样的修饰。本文使用的术语多核苷酸包括这样的化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞的dna和rna特征的化学形式(除其它外，包括简单和复杂的细胞)。术语“多肽”，“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语也可以应用于保守性修饰的变体以及其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人造化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。这种天然存在的氨基酸类似物的基本性质是，当掺入到蛋白中时，蛋白对引发相同蛋白但完全由天然存在的氨基酸组成的抗体具有特异性反应。术语“多肽”，“肽”和“蛋白”还包括修饰，包括但不限于糖基化，脂质连接，硫酸化，谷氨酸残基的γ-羧化，羟基化和adp-核糖基化。众所周知，如上所述，可以理解的是，多肽不总是完全线性的。例如，由于泛素化，多肽可以是分枝的，并且它们可以是环状的，有或没有分枝，通常是由于翻译后事件，包括天然处理事件和由人操作带来的不会自然发生的事件。圆形的、分支的和分支环状的多肽也可以通过非翻译天然过程和完全合成的方法来合成。此外，本发明考虑使用本发明蛋白的含甲硫氨酸的和不含甲硫氨酸的氨基末端变体。本文中，“降低临床体征的发生率和/或严重程度”或“减少临床症状”是指，但不限于，与野生型感染相比，减少组中感染的受试者的数量，减少或消除表现出感染的临床体征的受试者的数量，或降低存在于一个或多个受试者中的任何临床体征的严重程度。例如，这些术语包括感染，肺病理学，病毒血症，抗体产生，减少病原体负荷，病原体脱落，病原体传播减少或减少prrsv的任何症状的临床体征。与不具有在cd163基因中的修饰且被感染的受试者相比，本发明的一种或多种动物的这些临床体征优选降低至少10％。更优选地，本发明受试者的临床体征降低至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，甚至更优选至少50％。术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，是指掺入到蛋白、多肽或肽(统称为“蛋白”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括可以以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的天然氨基酸的非天然类似物。术语“选择性杂交”包括提及的在严格杂交条件下将一个核酸序列与另一核酸序列或其它生物制剂杂交。当使用基于杂交的检测系统时，选择与参考核酸序列互补的核酸探针，然后通过选择合适的条件，探针和参考序列选择性地彼此杂交或结合以形成双链分子。术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括提及的在该条件下探针与其靶序列杂交比与其它序列杂交可检测程度更高(例如至少2倍于背景)的条件。严格条件是依赖于序列的，并且在不同情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，任选地小于500个核苷酸的长度。通常，严格条件将是这样的条件，其中，盐浓度在ph7.0至8.3时小于约1.5mna离子，通常约0.01至1.0mna离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度至少约为30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)至少约为60℃。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现。特异性通常是杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于dna/dna杂合体，热熔点(tm)可以由meinkothandwahl,anal.biochem.,138:267-284(1984)的方程式近似计算：tm[℃]＝81.5+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％形式)-500/l；其中，m是单价阳离子的摩尔浓度，％gc是dna中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％形式是杂交溶液中甲酰胺的百分比，且l是碱基对中杂交体的长度。tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和ph下)。对于每1％的错配，tm降低约1℃；因此可以调整tm、杂交和/或洗涤条件以与期望的一致性的序列杂交。例如，如果寻找具有>90％一致性的序列，则tm可以降低10℃。通常，严格条件选择为比特定序列及其补体在限定的离子强度和ph下的tm低约5℃。然而，苛刻严格条件可以利用比tm低1至4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比tm低6至10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比tm低11至20℃的杂交和/或洗涤。使用方程式、杂交和洗涤组合物以及所需的tm，普通技术人员将会理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变异是固有描述的。在tijssen,laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology--hybridizationwithnucleicacidprobes,parti,chapter2"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",elsevier,newyork(1993)；和currentprotocolsinmolecularbiology,chapter2,ausubel,etal.,eds.,greenepublishingandwiley-interscience,newyork(1995)中找到了关于核酸杂交的广泛指南。“taledna结合结构域”或“tale”是包含一个或多个tale重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与tale与其同源靶dna序列的结合。单个“重复单元”(也称为“重复”)通常长度为33-35个氨基酸，并且与天然存在的tale蛋白内的其它tale重复序列呈现至少一些序列同源性。锌指和tale结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如通过天然存在的锌指或tale蛋白的识别螺旋区的工程(改变一个或多个氨基酸)。因此，工程dna结合蛋白(锌指或tale)是非天然存在的蛋白。工程dna结合蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的dna结合蛋白是在自然界中不存在的蛋白，其设计/组成主要来源于合理的标准。合理的设计标准包括应用置换规则和计算机化算法来处理存储现有zfp和/或tale设计和绑定数据的信息的数据库中的信息。参见例如美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；也参见wo98/53058；wo98/53059；wo98/53060；wo02/016536和wo03/016496以及美国公开号20110301073。如本文所用，“载体”包括提及的用于转染宿主细胞的核酸，其中可以插入多核苷酸。载体通常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。“野生型”是指那些尚未经遗传编辑或以其它方式进行遗传修饰的动物和由其衍生的胚囊、胚胎或细胞，并且通常是由天然存在的品系开发的自交系和远缘系。“锌指dna结合蛋白”(或结合结构域)是蛋白或更大蛋白内的结构域，其通过一个或多个锌指以序列特异性的方式结合dna，所述锌指是结构域内通过锌离子配位而稳定其结构的氨基酸序列区域。术语锌指dna结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或zfp。“选择的”锌指蛋白或tale是在自然界中不存在的蛋白，其产生主要来自经验过程，如噬菌体展示、相互作用捕获或杂交选择。参见例如美国专利号5,789,538；美国专利号5,925,523；美国专利号6,007,988；美国专利号6,013,453；美国专利号6,200,759；wo95/19431；wo96/06166；wo98/53057；wo98/54311；wo00/27878；wo01/60970；wo01/88197，wo02/099084和美国专利申请号20110301073。以下术语用于描述本发明的多核苷酸/多肽与参考多核苷酸/多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列一致性”和(d)“序列一致性百分比”。(a)如本文所用，“参考序列”是用作与本发明的多核苷酸/多肽进行序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，作为全长cdna或基因序列的片段，或完整的cdna或基因序列。(b)如本文所用，“比较窗口”包括提及的多核苷酸/多肽序列的连续和指定片段，其中，多核苷酸/多肽序列可以与参考序列进行比较，并且其中，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸/多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即空位)以使两个序列最佳比对。通常，比较窗口的长度是至少20个连续的核苷酸/氨基酸残基，并且任选地可以是30，40，50，100或更长。本领域技术人员理解的是，为了避免由于在多核苷酸/多肽序列中包含空位而与参考序列具有高度相似性，通常引入空位罚分，并从匹配数中减去空位罚分。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过smithandwaterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过needlemanandwunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过pearsonandlipman,proc.natl.acad.sci.85:2444(1988)的相似性搜索方法进行；并通过这些算法的计算机化实现，包括但不限于：intelligenetics，mountainview，加利福尼亚的pc/gene程序中的clustal；gap，bestfit，blast，fasta和tfasta以及gcgwisconsin遗传学软件包版本10(可从accelrysinc.，9685scrantonroad，sandiego，加利福尼亚，美国获得)中的相关程序。higginsandsharp,gene73:237-244(1988)；higginsandsharp,cabios5:151-153(1989)；corpet,etal.,nucleicacidsresearch16:10881-90(1988)；huang,etal.,computerapplicationsinthebiosciences8:155-65(1992),andpearson,etal.,methodsinmolecularbiology24:307-331(1994)充分描述了clustal程序。可以用于数据库相似性搜索的blast程序家族包括：针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的blastn；针对蛋白数据库序列的核苷酸查询序列的blastx；针对蛋白数据库序列的蛋白查询序列的blastp；针对核苷酸数据库序列的蛋白查询序列的tblastn；以及针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列tblastx。参见currentprotocolsinmolecularbiology,chapter19,ausubel,etal.,eds.,greenepublishingandwiley-interscience,newyork(1995)；altschuletal.,j.mol.biol.,215:403-410(1990)；and,altschuletal.,nucleicacidsres.25:3389-3402(1997)。进行blast分析的软件例如是通过国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov/)公开可用的。这个算法已经在许多出版物中被充分描述。参见例如altschulsfetal.,gappedblastandpsi-blast:新一代蛋白质数据库搜索程序,25nucleicacidsres.3389(1997)；国家生物技术信息中心，ncbi手册[internet]第16章：blast序列分析工具(mcentyrej,ostellj,eds.,2002)，可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk21097/pdf/ch16.pdf获得。还详细描述了氨基酸序列的blastp程序(参见henikoff&henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa89:10915)。除了计算百分比序列一致性之外，blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如karlin&altschul,proc.nat'l.acad.sci.usa90:5873-5877(1993))。可以采用许多低复杂度的滤波器程序来减少这种低复杂度的比对。例如，seg(wootenandfederhen,comput.chem.,17:149-163(1993))和xnu(claverieandstates,comput.chem.,17:191-201(1993))低复杂度滤波器单独或组合使用。除非另有说明，否则本文提供的核苷酸和蛋白一致性/相似性值是使用gap(gcg版本10)在默认值下计算的。gap(全球比对程序)也可用于比较本发明的多核苷酸或多肽与参考序列。gap使用needleman和wunsch(j.mol.biol.48：443-453，1970)的算法来找到两个完整序列的比对，其使匹配的数目最大化并使空位的数目最小化。gap表示最佳比对家族中的一员。这个家族可能有很多成员，但其它成员没有更好的质量。gap显示了比对的四个品质因数：质量、比率、一致性和相似性。质量是为了比对序列而最大化的度量。比率是质量除以较短片段的基数。百分比一致性是实际匹配符号的百分比。百分比相似性是相似符号的百分比。跨越空位的符号被忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评分相似性。威斯康星遗传学软件包版本10中使用的评分矩阵是blosum62(参见henikoff&henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa89:10915)。序列的多重比对可以使用具有默认参数(gappenalty＝10，gap长度罚分＝10)的比对的clustal方法(higgins和sharp(1989)cabios.5：151-153)进行。使用clustal方法的成对比对的默认参数包括ktuple1，gappenalty＝3，window＝5和diagonalssaved＝5。(c)如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列一致性”或“一致性”包括提及的两个序列中的残基，当在特定的比较窗口上比对以获得最大对应性时，两个序列中的残基是相同的。当提及蛋白质使用序列一致性的百分比时，认识到不相同的残基位置经常因保守性氨基酸置换而不同，其中，氨基酸残基置换具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不会改变分子的功能特性。当保守性置换序列不同时，可以向上调整序列一致性百分比以校正置换的保守性质。据说这种保守性置换所不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。通常这涉及将保守性置换评分为部分而不是完全错配，从而增加序列一致性百分比。因此，例如，其中，相同的氨基酸被赋予1分并且非保守性置换被赋予0分，保守性置换被赋予0和1之间的分数。保守性置换的评分可以根据meyersandmiller,computerapplic.biol.sci.,4:11-17(1988)的算法计算。例如在程序pc/gene(intelligenetics，mountainview，california，usa)中实施的那样。(d)如本文所用，“序列一致性百分比”是指通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即空位)与参考序列(其不包含添加或缺失)相比以用于两个序列的最佳比对。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数来计算百分比以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目并将结果乘以100以得到序列一致性百分比。在编码cd163蛋白的基因中具有修饰的染色体序列的动物和细胞cd163具有17个外显子，并且蛋白由具有9个清道夫受体半胱氨酸富集(srcr)结构域的细胞外区域、跨膜片段和短的胞质尾部组成。几种不同的变体是由单个基因的差异性剪接产生的(ritter等，1999a；ritter等，1999b)。大多这种变异是由细胞质尾部的长度来解释的。cd163具有许多重要功能，包括作为触珠蛋白-血红蛋白清道夫受体。消除血液中的游离血红蛋白是cd163的重要功能，因为血红素组可能是非常有毒的(kristiansen等，2001)。cd163具有促进内吞作用的细胞质尾部。该尾部的突变导致触珠蛋白-血红蛋白复合物摄取降低(nielsen等，2006)。c163的其它功能包括作为tweak受体(srcr1-4和6-9)，细菌受体(srcr5)，非洲猪病毒受体(sanchez-tones等，2003)的成红细胞粘附(srcr2)和作为免疫调节剂的潜在作用(如在vangorp等，2010a中讨论的)。鉴于这些重要功能，以前认为完全敲除cd163会得到不可行的或将严重危害的动物(参见例如pct公开号2012/158828)。cd163是清道夫受体半胱氨酸富集(srcr)超家族的成员，由胞内结构域和9个胞外srcr结构域组成。在人中，cd163介导的经由srcr3的血红蛋白-血红素摄取的内吞作用保护细胞免受氧化应激(schaer等，2006a；schaer等，2006b；schaer等，2006c)。cd163还作为肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导剂(tweak：srcr1-4和6-9)，病原体受体(非洲猪瘟病毒；细菌：srcr2)和成红细胞结合(srcr2)的受体。cd163在许多不同病原体的感染中起作用，因此，本发明不限于对prrsv感染的易感性降低的动物，而且还包括对任何病原体的易感性降低的动物，所述病原体依赖于cd163来感染细胞或稍后在细胞中复制和/或持久存在。prrsv的感染过程始于与肺泡巨噬细胞表面的硫酸乙酰肝素的初始结合。在2013年之前，认为对唾液酸粘附素(siglec1，也被称为cd169或sn)稍后发生安全结合。然后通过网格蛋白介导的内吞作用使病毒内化。另一个分子，即cd163，则促进病毒在内体中的脱壳(vanbreedam等，2010a)。病毒基因组被释放且细胞被感染。本文描述的是在编码cd163蛋白(例如插入或缺失(“indel”))的基因中包含至少一个修饰的染色体序列的动物及其后代以及细胞，该序列赋予动物对病原体(例如prrsv)感染的改善或完全的抗性。申请人已经证明cd163是prrsv感染中的关键基因，并且已经产生了始祖抗性动物和系。本公开内容提供了在编码cd163蛋白的基因中包含至少一个修饰的染色体序列的遗传修饰的动物、其后代或动物细胞。本发明不包括以前被假定为对prrsv抗性关键的siglec1(cd169)基因的失活或编辑。编辑的染色体序列可以是(1)失活的，(2)修饰的，或(3)包含导致无效突变的整合序列。失活的染色体序列被改变，使得与prrsv感染相关的cd163蛋白功能受损、降低或消除。因此，包含失活的染色体序列的经遗传编辑的动物可被称为“敲除”或“有条件敲除”。类似地，包含整合序列的经遗传编辑的动物可被称为“敲入”或“有条件敲入”。此外，包含修饰的染色体序列的经遗传编辑的动物可以包含靶点突变或其它修饰，从而产生改变的蛋白产物。简而言之，所述方法可以包含将编码靶向锌指核酸酶的至少一种rna分子和任选的至少一种辅助多核苷酸引入到胚胎或细胞中。该方法进一步包含温育胚胎或细胞以允许锌指核酸酶的表达，其中，通过锌指核酸酶引入到靶向染色体序列的双链断裂由易错的非同源末端连接dna修复过程或同源性导向的dna修复过程而修复。使用靶向锌指核酸酶技术编辑与编码生殖细胞发育相关的蛋白的染色体序列的方法是快速、精确和高效的。或者，所述方法可以包含使用crispr/cas9系统以修饰基因组序列。为了使用cas9以修饰基因组序列，可以将蛋白直接递送至细胞。或者，可将编码cas9的mrna递送至细胞，或者将提供编码cas9的mrna的表达的基因递送至细胞。另外，靶标特异性crrna和tracrrna可以直接递送至细胞，或靶标特异性grna可以递送至细胞(这些rna也可以通过构建来表达这些rna的基因而产生)。靶位点的选择和crrna/grna的设计在本领域中是众所周知的。关于grna的构建和克隆的讨论可以在http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/crispr-reagent-description-rev20140509.pdf中找到。至少一个cd163基因座可以用作位点特异性编辑的靶位点。位点特异性编辑可以包括从基因座插入外源核酸(例如包含编码感兴趣多肽的核苷酸序列的核酸)或缺失核酸。例如，外源核酸的整合和/或部分基因组核酸的缺失可以修饰基因座，从而产生破坏的cd163基因(即cd163蛋白活性降低)。本文提供了在编码cd163蛋白的基因中包含至少一个修饰的染色体序列的非人动物、所述动物的后代以及动物细胞。提供了在编码cd163蛋白的基因中包含至少一个修饰的染色体序列的非人动物或其后代或动物细胞。修饰的染色体序列导致动物、后代或细胞基本上不产生功能性cd163蛋白。提供了另一种在编码cd163蛋白的基因中包含至少一个修饰的染色体序列的非人动物或其后代或动物细胞。修饰的染色体序列包含在编码cd163蛋白的基因中的框内缺失。提供了在编码cd163蛋白的基因中包含至少一个修饰的染色体序列的猪类动物或其后代或猪类细胞。修饰的染色体序列包含：(a)seqidno：118；或(b)选自由以下组成的组的修饰：与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3147的124个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3146的123个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3147和3148之间的1个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3159的130个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3161的132个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸1525至核苷酸3030的1506个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2724至核苷酸4096的1373个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸4531的1387个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2440至核苷酸4160的1720个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失；及其任何组合。与在编码cd163蛋白的基因中不包含修饰的染色体序列以致病原体感染的动物、后代或细胞相比，在编码cd163蛋白的基因中的染色体序列中的修饰降低了动物、后代或细胞对病原体(例如诸如prrsv的病毒)感染的易感性。例如在编码cd163蛋白质的基因中的染色体序列中的修饰可以降低动物、后代或细胞对1型prrsv病毒、2型prrsv或1型和2型prrsv病毒两者的易感性。在编码cd163蛋白的基因中的染色体序列中的修饰会降低动物、后代或细胞对prrsv分离株的易感性，prrsv分离株选自由nvsl97-7895，ks06-72109，p129，vr2332，co90，az25，mlv-resprrs，ks62-06274，ks483(sd23983)，co84，sd13-15，雷垒斯塔德(lelystad)，03-1059，03-1060，sd01-08，4353pz及其组合组成的组。动物或后代可以是胚胎、幼年或成年。类似地，细胞可以包含胚胎细胞，源自幼年动物的细胞或源自成年动物的细胞。动物或后代可以包含家养动物。同样，细胞可以包含源自家养动物的细胞。家养动物可以包含家畜动物，例如猪类动物，牛类动物(例如肉牛或奶牛)，绵羊类动物，山羊类动物，马类动物(例如马或驴)，水牛，骆驼或禽类动物(例如鸡，火鸡，鸭，鹅，珍珠鸡，或乳鸽)。家畜动物优选是牛或猪类动物，最优选是猪类动物。动物或后代可以包含遗传编辑的动物。细胞可以包含遗传编辑的细胞。动物或细胞可以使用归巢核酸内切酶进行遗传编辑。归巢核酸内切酶可以是天然存在的内切核酸酶，但是优选是合理设计的非天然存在的归巢内切核酸酶，其具有已经设计的dna识别序列，使得内切核酸酶靶向编码cd163蛋白的基因中的染色体序列。因此，归巢核酸内切酶可以是设计的归巢内切核酸酶。归巢核酸内切酶可以包含例如规律成簇间隔短回文重复(crispr)/cas9系统，转录激活因子样效应子核酸酶(talen)，锌指核酸酶(zfn)，重组酶融合蛋白，大范围核酸酶，或其组合。动物或细胞优选是使用crispr/cas9系统进行遗传编辑的动物或细胞。与非编辑动物相比，遗传编辑的动物、其后代或遗传编辑的细胞优选对病原体(例如诸如prrsv的病毒)表现出增加的抗性。例如经遗传编辑的动物可以对1型prrsv病毒、2型prrsv或对1型和2型prrsv病毒两者表现出增加的抗性。经遗传编辑的动物可以对prrsv分离株表现出增加的抗性，prrsv分离株选自由nvsl97-7895，ks06-72109，p129，vr2332，co90，az25，mlv-resprrs，ks62-06274，ks483(sd23983)，co84，sd13-15，雷垒斯塔德，03-1059，03-1060，sd01-08，4353pz及其组合组成的组。动物、后代或细胞对于修饰的染色体序列可以是杂合的。或者，动物、后代或细胞对于修饰的染色体序列可以是纯合的。在任何动物、后代或细胞中，修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因中的插入、编码cd163蛋白的基因中的缺失或其组合。例如，修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因中的缺失(例如框内缺失)。或者，修饰的染色体序列可以在编码cd163蛋白的基因中包含插入。与缺乏插入或缺失的动物、后代或细胞中的cd163蛋白产生或活性相比，插入或缺失可以引起cd163蛋白产生或活性降低。插入或缺失可导致动物、后代或细胞产生基本上无功能的cd163蛋白。“基本上无功能的cd163蛋白”是指动物、后代或细胞中的cd163蛋白水平是不可检测的，或者如果可检测到的话，则比不包含插入或缺失的动物、后代或细胞中观察到的水平低至少约90％。当动物、后代或细胞包含猪类动物、后代或细胞时，修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的外显子7中的修饰，编码cd163蛋白的基因的外显子8，与编码cd163蛋白的基因的外显子7或外显子8邻接的内含子或其组合。修饰的染色体序列适当地包含在编码cd163蛋白的基因的外显子7中的修饰。编码cd163蛋白的基因的外显子7中的修饰可以包含缺失(例如外显子7中的框内缺失)。或者，编码cd163蛋白的基因的外显子7中的修饰可以包含插入。在任何猪类动物、后代或细胞中，修饰的染色体序列可以包含seqidno：118。或者，修饰的染色体序列可以包含选自由以下组成的修饰：与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3147的124个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3146的123个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的核苷酸在3147和3148之间的1个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3159的130个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3161的132个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸1525至核苷酸3030的1506个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2724至核苷酸4096的1373个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸4531的1387个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2440至核苷酸4160的1720个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失；或其组合。例如，修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3147的124个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3146的123个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3147和3148之间的1个碱基对插入。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3159的130个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3161的132个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸1525至核苷酸3030的1506个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2724至核苷酸4096的1373个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸4531的1387个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2440至核苷酸4160的1720个碱基对缺失。修饰可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含上述插入和缺失的任何组合。seqidno：47提供了从野生型猪cd163基因的外显子7上游3000个碱基对(bp)至该基因外显子10的最后一个碱基的区域的核苷酸序列。在此使用seqidno：47作为参考序列，如图16所示。当猪类动物、后代或细胞包含与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入时，2个碱基对插入可以包含二核苷酸ag的插入。当猪类动物、后代或细胞包含与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3147和3148之间的1个碱基对插入时，1个碱基对插入可以包含单个腺嘌呤残基的插入。当猪类动物、后代或细胞包含与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入时，7个碱基对插入可以包含序列tactact(seqidno：115)。当猪类动物、后代或细胞包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失，12个碱基对插入可以包含序列tgtggagaattc(seqidno：116)。当猪类动物、后代或细胞包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入，11个碱基对插入可以包含序列agccagcgtgc(seqidno：117)。当在编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列包含缺失时，缺失优选包含框内缺失。框内缺失是不引起三联体阅读框移位的缺失，从而导致蛋白产物具有一个或多个氨基酸的内部缺失，但不被截断。假设剪接发生正确，外显子内的三个碱基对或三个碱基对的倍数的缺失可导致框内突变。预期本文所述的猪类动物和细胞的以下indel会导致框内缺失，因为猪cd163基因的外显子7内的缺失是三的倍数：与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸1525至核苷酸3030的1506个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2724至核苷酸4096的1373个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3146的123个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸4531的1387个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入；以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2440至核苷酸4160的1720个碱基对缺失。因此，在猪类动物、后代和细胞中，在编码cd163蛋白的基因中的插入或缺失可以包含选自由与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸1525至核苷酸3030的1506个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2724至核苷酸4096的1373个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3146的123个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸4531的1387个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2440至核苷酸4160的1720个碱基对缺失；及其组合组成的组的外显子7中的框内缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含选自由以下组组成的插入或缺失：与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失；及其组合。例如，猪类动物、子代或细胞可以包含与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失。猪类动物，后代或细胞可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含本文所述的任何修饰的染色体序列的任何组合。例如，猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的seqidno：118；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的seqidno：118；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。猪动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488到核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的seqidno：118；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸在3149和3150之间的2个碱基对插入，以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。包含任何上述插入或缺失的猪类动物、后代或细胞可以包含在插入或缺失之外的与seqidno：47具有高度序列一致性的染色体序列。因此，例如，猪类动物、后代或细胞可以包含在插入或缺失之外的染色体序列的区域中与seqidno：47具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，99.9％或100％序列一致性的染色体序列。猪类动物、后代或细胞可以包含染色体序列，所述染色体序列包含seqidno：98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，118或119。如以下示例中进一步描述的，seqidno：98-114和119提供了对应于在seqidno：47中提供的野生型猪cd163的区域的核苷酸序列，并且包括在本文中描述的猪cd163染色体序列中的插入或缺失。seqidno：118提供了相对应在seqidno：47中提供的野生型猪cd163的区域的序列，其中，外显子7已经被编码人cd163样1蛋白(hcd163l1)的srcr8的同系物的合成外显子替代。例如，猪类、后代、动物或细胞可以包含含有seqidno：98，101，105，109，110，112，113或114的染色体序列。seqidno：98，101，105，109，110，112，113和114提供了猪cd163染色体序列的外显子7中的框内缺失的核苷酸序列。作为另一个实例，猪类动物、后代或细胞可以包含含有seqidno：103，111或119的染色体序列。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的11个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的2个碱基对插入以及377个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的124个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的123个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含1个碱基对插入。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的130个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的132个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含1506个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含7个碱基对插入。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的1280个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的1373个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含1467个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对内含子6缺失，以及在核苷酸4488处的12个碱基对插入和外显子7中另外的129个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的28个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的1387个碱基对缺失。猪类动物、后代或细胞可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的1382个碱基对缺失以及11个碱基对插入和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的1720个碱基对缺失。包含编码cd163蛋白的基因中的至少一个修饰的染色体序列的任何细胞可以包含精子细胞。或者，任何这些细胞可以包含卵细胞(例如受精卵)。包含编码cd163蛋白的基因中的至少一个修饰的染色体序列的任何细胞可以包含体细胞。例如，任何细胞可以包含成纤维细胞(例如胎儿成纤维细胞)。核酸在cd163基因座的靶向整合外源核酸在cd163基因座的位点特异性整合可以通过本领域技术人员已知的任何技术来完成。例如，外源核酸在cd163基因座的整合可以包含使细胞(例如组织或生物体中的分离细胞或细胞)与包含外源核酸的核酸分子接触。这样的核酸分子可以包含侧接外源核酸的核苷酸序列，其促进核酸分子与至少一个cd163基因座之间的同源重组。促进同源重组的侧接外源核酸的核苷酸序列可以与cd163基因座的内源核苷酸互补。或者，促进同源重组的侧接外源核酸的核苷酸序列可以与先前整合的外源核苷酸互补。多个外源核酸可以整合在一个cd163基因座上，例如基因堆叠中。可以通过宿主细胞的内源性细胞机制(例如但不限于内源dna和内源性重组酶)促进(例如催化)cd163基因座处的核酸整合。或者，可以通过提供给宿主细胞的一种或多种因子(例如多肽)促进核酸在cd163基因座上的整合。例如，通过使多肽与宿主细胞接触，或者通过在宿主细胞内表达多肽，可以提供核酸酶(一种或多种)，重组酶(一种或多种)和/或连接酶多肽(独立地或作为嵌合多肽的一部分)。因此，可将包含编码至少一种核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽的核苷酸序列的核酸同时或依次与待整合的在cd163基因座位点特异性的核酸引入到宿主细胞中，其中，所述至少一种核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽由宿主细胞中的核苷酸序列表达。dna结合多肽位点特异性整合可以通过利用能够识别和结合特定核苷酸序列的因子来实现，例如在宿主生物体的基因组中。例如，许多蛋白包含能够以位点特异性方式识别和结合dna的多肽结构域。由dna结合多肽识别的dna序列可以被称为“靶”序列。即使是在多肽中所表达的而不是由最初分离该结构域的蛋白所表达的，能够以位点特异性方式识别并与dna的结合的多肽结构域通常正确地折叠并独立地以位点特异性的方式与dna结合。类似地，即使当存在于大的dna结构(例如染色体)中时，尤其是，当靶序列所在的位点是已知可溶于可溶性细胞蛋白(例如基因)的一种时，用于通过dna结合多肽识别和结合的靶序列通常能够被这样的多肽识别和结合。尽管从天然存在的蛋白鉴定的dna结合多肽通常结合离散的核苷酸序列或模体(例如共有识别序列)，但方法存在并且是本领域已知的用于修饰许多这样的dna结合多肽以识别不同的核苷酸序列或模体。dna结合多肽包括，例如但不限于：锌指dna结合结构域；亮氨酸拉链；upadna结合结构域；gal4；tal；lexa；tet抑制剂；laci和类固醇激素受体。例如，dna结合多肽可以是锌指。单个的锌指模体可以被设计成针对并特异性结合到任何大范围的dna位点上。通过将α-螺旋插入到靶dna双螺旋的大沟中使得标准的cys2his2(以及非标准的cys3his)锌指多肽与dna结合。由锌指识别dna是模块化的；每个指主要接触靶标中的三个连续的碱基对，并且多肽中的几个关键残基会介导识别。通过靶向核酸内切酶中包括的多个锌指dna结合结构域，靶向核酸内切酶的dna结合特异性可以进一步提高(因此也可以提高由此赋予的任何基因调节作用的特异性)。参见例如urnov等(2005)nature435:646-51。因此，可以工程化并利用一个或多个锌指dna结合多肽，使得引入到宿主细胞的靶向核酸内切酶与宿主细胞基因组内独特的dna序列相互作用。优选地，锌指蛋白是非天然存在的，因为它被工程化以结合选择的靶位点。参见，例如beerli等(2002)naturebiotechnol.20:135-141；pabo等(2001)ann.rev.biochem.70:313-340；isalan等(2001)naturebiotechnol.19:656-660；segal等(2001)curr.opin.biotechnol.12:632-637；choo等(2000)curr.opin.struct.biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273和美国专利申请号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化的锌指结合结构域可以具有新的结合特异性。工程方法包括但不限于合理的设计和各种类型的选择。合理的设计包括，例如，使用包含三联(或四联)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中，每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定的三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关。参见，例如美国专利号6,453,242和6,534,261。包括噬菌体展示和双杂交系统的示例性选择方法在美国专利号5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；and6,242,568；以及wo98/37186；wo98/53057；wo00/27878；wo01/88197和gb2,338,237中公开。另外，例如在wo02/077227中已经描述了锌指结合结构域的结合特异性的增强。此外，如在这些及其它参考文献中所公开的，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可以使用任何合适的连接子序列连接在一起，包括例如长度为5个或更多个氨基酸的连接子。另参见美国专利号6,479,626；6,903,185和7,153,949中长度为6个或更多个氨基酸的示例性连接子序列。本文所述的蛋白可以包括蛋白的单个锌指之间的合适连接子的任何组合。靶位点的选择：zfp和用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的，并且在美国专利号6,140,0815；789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；wo95/19431；wo96/06166；wo98/53057；wo98/54311；wo00/27878；wo01/60970；wo01/88197；wo02/099084；wo98/53058；wo98/53059；wo98/53060；wo02/016536和wo03/016496中详细描述。此外，如在这些及其它参考文献中公开的，锌指结构域和/或多指的锌指蛋白可以使用任何合适的连接子序列连接在一起，包括例如长度为5个或更多个氨基酸的连接子。另参见美国专利号6,479,626；6,903,185和7,153,949中长度为6个或更多个氨基酸的示例性连接子序列。本文所述的蛋白可以包括蛋白的单个锌指之间的合适连接子的任何组合。或者，dna结合多肽是来自gal4的dna结合结构域。gal4是酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)中的一种模块化反式激活因子，但它也可以作为许多其它生物体的反式激活因子。参见例如sadowski等(1988)nature335:563-4。在该调控系统中，编码酿酒酵母中半乳糖代谢途径酶的基因的表达受到可用碳源的严格调控johnston(1987)microbiol.rev.51:458-76。这些代谢酶的转录控制由正调控蛋白gal4和gal4特异性结合的17bp对称dna序列(上游激活序列(uas))之间的相互作用介导。天然gal4由881个氨基酸残基组成，具有99kda的分子量。gal4包含功能上自主的结构域，它们的组合活性在体内说明了gal4的活性maandptashne(1987)cell48:847-53)；brentandptashne(1985)cell43(3pt2):729-36。gal4的n-末端65个氨基酸包含gal4dna结合结构域keegan等(1986)science231:699-704；johnston(1987)nature328:353-5。序列特异性结合需要与存在于dna结合结构域中的6个cys残基配位的二价阳离子的存在。通过与dna螺旋的大沟直接接触且在17bpuas的每个末端使得含有配位阳离子结构域与保守的ccg三联体相互作用并识别。marmorstein等(1992)nature356:408-14。蛋白的dna结合功能在启动子附近定位c-末端转录激活结构域，使得激活结构域可以指导转录。可以使用的另外的dna结合多肽包括例如但不限于来自avrbs3诱导型基因的结合序列；来自avrbs3诱导型基因或由其工程化的合成结合序列(例如upadna结合结构域)的共有结合序列；tal；lexa(参见例如brent&ptashne(1985)，同上)；lacr(参见例如labowetal.(1990)mol.cell.biol.10:3343-56；baim等(1991)proc.natl.acad.sci.usa88(12):5072-6)；类固醇激素受体(ellliston等(1990)j.biol.chem.265：11517-121)；tet抑制剂(美国专利号6,271,341)和在四环素(tc)存在(但不是缺乏)的情况下结合tet操纵子序列的突变tet抑制剂；nf-κb的dna结合结构域；以及wang等(1994)proc.natl.acad.sci.usa91(17):8180-4描述的调控系统的组成部分，其利用gal4(激素受体)和vp16的融合。本文所述的方法和组合物中使用的一种或多种核酸酶的dna结合结构域可以包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)tal效应子dna结合结构域。参见例如美国专利公开号2011/0301073。或者，核酸酶可以包含crispr/cas系统。这样的系统包括编码系统的rna组分的crispr(规律成簇间隔短回文重复)基因座和编码蛋白的cas(crispr相关)基因座(jansen等,2002.mol.microbiol.43:1565-1575；makarova等,2002.nucleicacidsres.30:482-496；makarova等,2006.biol.direct1:7；haft等,2005.ploscomput.biol.1:e60)。微生物宿主中的crispr基因座含有cas基因以及能够编程crispr介导的核酸剪切的特异性的非编码rna元件的组合。ii型crispr是最好表征的系统之一，并且在四个连续步骤中在自然界中进行靶dna双链断裂。首先，从crispr基因座转录两个非编码rna即pre-crrna阵列和tracrrna。其次，tracrrna与pre-crrna的重复区域杂交，并将pre-crrna的加工介导成含有单个间隔区序列的成熟crrna。第三，成熟的crrna：tracrrna复合物通过在crrna上的间隔子和与原始间隔子邻接模体(pam)相邻的靶dna上的原始间隔子之间的wastson-crick碱基配对将cas9引导至靶dna中，这是靶识别的额外要求。最后，cas9介导靶dna的剪切以在原始间隔子内产生双链断裂。为了使用crispr/cas系统以产生靶向插入和缺失，两个非编码rna(crrna和tracrrna)可以被称为引导rna(grna)的单一rna替换。crispr/cas系统的活性包含三个步骤：(i)在称为“适应”的过程中，将外源dna序列插入到crispr阵列以防止未来的攻击，(ii)相关蛋白的表达以及阵列的加工和表达，然后(iii)rna介导的与外来核酸的干扰。在细菌细胞中，几种cas蛋白参与了crispr/cas系统的天然功能，并且起到插入外源dna等功能的作用。cas蛋白可以是天然存在的cas蛋白的“功能衍生物”。天然序列多肽的“功能衍生物”是具有与天然序列多肽相同的定性生物学特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与相应的天然序列多肽相同的生物学活性。本文考虑的生物学活性是功能衍生物将dna底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、共价修饰及其融合体。cas多肽或其片段的合适衍生物包括但不限于cas蛋白或其片段的突变体、融合体、共价修饰。包括cas蛋白或其片段的cas蛋白以及cas蛋白或其片段的衍生物可以从细胞中获得或化学合成或通过这两种方法的组合来获得。细胞可以是天然产生cas蛋白的细胞，或者天然产生cas蛋白并被遗传工程化以产生更高表达水平的内源cas蛋白或由外源导入的核酸产生cas蛋白的细胞，该核酸编码与内源性cas相同或不同的cas。在某些情况下，细胞不会天然产生cas蛋白并被遗传工程化以产生cas蛋白。dna结合多肽可以特异性识别并结合包含在宿主生物体的基因组核酸内的靶核苷酸序列。在一些实例中，可以在宿主基因组中发现任何数目的靶核苷酸序列的离散情况。靶核苷酸序列在生物体的基因组内可能是稀有的(例如，少于约10，约9，约8，约7，约6，约5，约4，约3，约2或约1拷贝的靶序列可能存在于基因组中)。例如，靶核苷酸序列可以位于生物体基因组内的独特位点。靶核苷酸序列可以例如但不限于相对于彼此随机分散在整个基因组中；位于基因组中的不同连锁群中；位于相同的连锁群中；位于不同的染色体上；位于相同的染色体上；位于基因组中在生物体中类似条件下表达的位点处(例如，在相同或基本上功能相同的调节因子的控制下)；并且在基因组中彼此紧密地定位(例如，靶序列可以包含在以基因组座整合为多联体的核酸内)。靶向核酸内切酶特异性识别并结合靶核苷酸序列的dna结合多肽可以包含在嵌合多肽中，以便赋予嵌合多肽上靶序列的特异性结合。在实例中，这样的嵌合多肽可以包含例如但不限于核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽，这些多肽如上所述。包含dna结合多肽和核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽的嵌合多肽还可以包含其它功能多肽模体和/或结构域，例如但不限于：位于嵌合蛋白中的功能多肽之间的间隔子序列；前导肽；将融合蛋白靶向细胞器(例如细胞核)的肽；被细胞酶剪切的多肽；肽标签(例如myc，his等)；和不干扰嵌合多肽功能的其它氨基酸序列。嵌合多肽中的功能多肽(例如dna结合多肽和核酸酶多肽)可以可操作地连接。嵌合多肽的功能多肽可以通过它们从编码至少框内相互连接的功能多肽的单一多核苷酸的表达而可操作地连接，从而产生编码嵌合蛋白的嵌合基因。或者，嵌合多肽的功能多肽可以通过其它方式(例如通过独立表达的多肽的交联)可操作地连接。特异性识别并结合靶核苷酸序列的dna结合多肽或导向rna可以包含在天然分离蛋白(或其突变体)内，其中，天然分离蛋白或其突变体还包含核酸酶多肽(并且还可以包含重组酶和/或连接酶多肽)。这样的分离蛋白的实例包括talen，重组酶(例如cre，hin，tre和flp重组酶)，rna导向的crispr/cas9和大范围核酸酶。如本文所用，术语“靶向核酸内切酶”是指包含dna结合多肽或导向rna和核酸酶多肽的天然或工程化分离的蛋白及其突变体，以及包含dna结合多肽或导向rna和核酸酶的嵌合多肽。可以使用任何包含dna结合多肽或特异性识别并结合包含在cd163基因座内的靶核苷酸序列的导向rna(例如因为靶序列包含在基因座的天然序列内，或者因为靶序列例如通过重组已被引入到基因座中)的靶向核酸内切酶。合适的嵌合多肽的一些实例包括但不限于以下多肽的组合：锌指dna结合多肽；foki核酸酶多肽；tale结构域；亮氨酸拉链；转录因子dna结合模体；以及从例如但不限于talen，重组酶(例如cre，hin，reca，tre和flp重组酶)，rna导向的crispr/cas9，大范围核酸酶分离的dna识别和/或剪切结构域；和本领域技术人员已知的其它多肽。具体实例包括包含位点特异性dna结合多肽和核酸酶多肽的嵌合蛋白。可以通过本领域技术人员已知的方法工程化嵌合多肽，以改变嵌合多肽内包含的dna结合多肽的识别序列，从而将嵌合多肽靶向至特定的感兴趣核苷酸序列。嵌合多肽可以包含dna结合结构域(例如锌指，tal效应子结构域等)和核酸酶(剪切)结构域。剪切结构域对于dna结合结构域可以是异源的，例如锌指dna结合结构域和来自核酸酶的剪切结构域或talendna结合结构域和剪切结构域、或大范围核酸酶dna结合结构域和来自不同核酸酶的剪切结构域。异源剪切结构域可以由任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。剪切结构域所衍生自的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见例如2002-2003catalogue,newenglandbiolabs,beverly,mass.和belfort等(1997)nucleicacidsres.25:3379-3388。另外剪切dna的酶是已知的(例如51核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺dna酶i；微球菌核酸酶；酵母ho核酸内切酶；也参见linn等(eds.)nucleases,coldspringharborlaboratorypress,1993)。这些酶(或其功能片段)中的一种或多种可以用作剪切结构域和剪切半结构域的来源。类似地，如上所述，剪切半结构域可以源自需要二聚化以进行剪切活性的任何核酸酶或其部分。通常，如果融合蛋白包含剪切半结构域，则需要两个融合蛋白进行剪切。或者，可以使用包含两个剪切半结构域的单一蛋白。两个剪切半结构域可以源自相同的核酸内切酶(或其功能片段)，或者每个剪切半结构域可以源自不同的核酸内切酶(或其功能片段)。此外，两个融合蛋白的靶位点优选相对于彼此设置，使得两个融合蛋白与它们各自的靶位点的结合位于例如通过二聚化使剪切半结构域彼此空间定向以形成功能剪切结构域的剪切半结构域。因此，靶位点的近边缘可以被5-8个核苷酸或15-18个核苷酸分开。然而，任何整数个核苷酸或核苷酸对都可以介于两个靶位点之间(例如2至50个核苷酸对或更多)。一般来说，剪切位点位于靶位点之间。限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够与dna(在识别位点)进行序列特异性结合，并且在结合位点处或附近剪切dna，例如使得一个或多个外源序列(供体/转基因)整合在结合(靶)位点处或附近。某些限制酶(例如iis型)在从识别位点移除的位点剪切dna，并具有可分离的结合结构域和剪切结构域。例如，在其一条链上来自其识别位点的9个核苷酸和在另一条链上来自其识别位点的13个核苷酸处，iis型酶foki催化dna的双链剪切。参见，例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及李等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:4275-4279；li等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:2764-2768；kim等(1994a)proc.natl.acad.sci.usa91:883-887；kimetal.(1994b)j.biol.chem.269:31,978-31,982。因此，融合蛋白可以包含来自至少一种iis型限制性酶的剪切结构域(或剪切半结构域)和一个或多个锌指结合结构域，其可以或不可以被工程化。剪切结构域与结合结构域可分离的示例性iis型限制性酶是foki。该特定的酶作为二聚体是有活性的。bitinaite等(1998)proc.natl.acad.sci.usa95:10,570-10,575。因此，为了本公开的目的，在公开的融合蛋白中使用的foki酶的部分被认为是剪切半结构域。因此，对于使用锌指-foki融合物的靶向双链剪切和/或细胞序列的靶向替换，可以使用两种各自包含foki剪切半结构域的融合蛋白来重构有催化活性的剪切结构域。或者，也可以使用含有dna结合结构域和两个foki剪切半结构域的单个多肽分子。剪切结构域或剪切半结构域可以是保留剪切活性或保留多聚化(例如二聚化)以形成功能剪切结构域能力的蛋白的任何部分。美国专利公开号2007/0134796中描述了示例性iis型限制性酶。另外的限制性酶还含有可分离的结合结构域和剪切结构域，并且这些酶可以由本公开所预期。参见例如roberts等(2003)nucleicacidsres.31:418-420。剪切结构域可以包含一个或多个工程化剪切半结构域(也称为二聚化结构域突变体)，其最小化或防止同源二聚化，例如如美国专利公开号2005/0064474；2006/0188987和2008/0131962中所述的。或者，可以使用所谓的“分裂酶”技术(参见例如美国专利公开号20090068164)在核酸靶位点处体内组装核酸酶。这样的分裂酶组分可以在分离的表达构建体上表达，或者可以在一个开放阅读框中连接，其中，例如通过自剪切2a肽或ires序列分离各个组分。组分可以是单个锌指结合结构域或大范围核酸酶核酸结合结构域的结构域。锌指核酸酶嵌合多肽可以包含定制设计的锌指核酸酶(zfn)，其可以被设计为递送靶向位点特异性双链dna断裂，其中可整合外源核酸或供体dna(参见美国专利公开号2010/0257638)。zfn是含有来自限制性核酸内切酶(例如foki)的非特异性剪切结构域和锌指dna结合结构域多肽的嵌合多肽。参见例如huang等(1996)j.proteinchem.15:481-9；kim等(1997a)proc.natl.acad.sci.usa94:3616-20；kim等(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:1156-60；kim等(1994)procnatl.acad.sci.usa91:883-7；kim等(1997b)proc.natl.acad.sci.usa94:12875-9；kim等(1997c)gene203:43-9；kimet等(1998)biol.chem.379:489-95；nahonandraveh(1998)nucleicacidsres.26:1233-9；smith等(1999)nucleicacidsres.27:674-81。zfn可以包含非规范锌指dna结合结构域(参见美国专利公开号2008/0182332)。foki限制性核酸内切酶必须通过核酸酶结构域二聚化以剪切dna并引入双链断裂。因此，含有来自这种核酸内切酶的核酸酶结构域的zfn也需要核酸酶结构域的二聚化以剪切靶dna。mani等(2005)biochem.biophys.res.commun.334:1191-7；smith等(2000)nucleicacidsres.28:3361-9。zfn的二聚化可以通过两个相邻的、相反定向的dna结合位点id来促进。用于将外源核酸位点特异性整合到宿主的至少一个cd163基因座中的方法可以包含向宿主的细胞中引入zfn，其中，zfn识别并结合靶核苷酸序列，其中，靶核苷酸序列包含在宿主的至少一个cd163基因座内。在某些实例中，在至少一个cd163基因座以外的任何其它位置，靶核苷酸序列不包含在宿主的基因组内。例如，zfn的dna结合多肽可被工程化以识别并结合在至少一个cd163基因座内鉴定的靶核苷酸序列(例如通过测序cd163基因座)。用于将外源核酸位点特异性整合到宿主的至少一个cd163性状基因座且包含向宿主的细胞中引入zfn的方法可以包含向细胞中引入外源核酸，其中，通过zfn与靶序列的位点特异性识别和结合(以及随后包含cd163基因座的核酸的剪切)来促进将外源核酸重组成包含至少一个cd163基因座的宿主核酸。用于在cd163基因座整合的可选外源核酸用于在cd163基因座整合的外源核酸包括：用于在至少一个cd163基因座中位点特异性整合的外源核酸，例如但不限于orf；包含编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列的核酸；和包含上述的其中至少一个或两个的载体。因此，特定的核酸包括编码多肽的核苷酸序列、结构核苷酸序列和/或dna结合多肽识别和结合位点。用于位点特异性整合的可选外源核酸如上所述，提供了外源序列(也称为“供体序列”或“供体”或“转基因”)的插入，例如用于多肽的表达、突变基因的校正或增加野生型基因的表达。显而易见的是，供体序列通常与其所在的基因组序列不相同。供体序列可以含有两侧为两个同源区域的非同源序列以允许在感兴趣的位置进行有效的同源性定向修复(hdr)。另外，供体序列可以包含含有与细胞染色质中感兴趣区域不同源的序列的载体分子。供体分子可以含有几个不连续的与细胞染色质同源的区域。例如，为了靶向插入通常不存在于感兴趣区域中的序列，所述序列可以存在于供体核酸分子中，并且侧接与感兴趣区域中的序列同源的区域。供体多核苷酸可以是单链或双链的dna或rna，并且可以以线性或环状形式引入到细胞中。参见例如美国专利公开号2010/0047805，2011/0281361，2011/0207221和2013/0326645。如果以线性形式引入，则可以通过本领域技术人员已知的方法来保护供体序列的末端(例如通过核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加到线性分子的3'末端，和/或将自身互补寡核苷酸连接到一个或两个末端。例如，参见chang等(1987)proc.natl.acad.sci.usa84:4959-4963；nehls等(1996)science272:886-889。保护外源多核苷酸免于降解的其它方法包括但不限于加入末端氨基基团和使用修饰的核苷酸间连接键，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和o-甲基核糖或脱氧核糖残基。可以将多核苷酸引入到细胞作为具有附加序列(例如复制起点，启动子和编码抗生素抗性的基因)的载体分子的一部分。此外，供体多核苷酸可以作为裸核酸引入，如与诸如脂质体或泊洛沙姆的试剂复合的核酸，或者可以通过病毒(例如腺病毒，aav，疱疹病毒，逆转录病毒，慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(idlv))递送。通常整合供体以使其由整合位点处的内源启动子驱动表达，即驱动整合供体的内源基因(例如cd163)表达的启动子。然而，显而易见的是，供体可以包含启动子和/或增强子，例如组成型启动子或诱导型或组织特异性启动子。此外，虽然不需要表达，但外源序列还可以包括转录或翻译调控序列，例如启动子，增强子，绝缘子，内部核糖体进入位点，编码2a肽和/或聚腺苷酸化信号的序列。可以以位点特异性方式整合到至少一个cd163基因座中以修饰cd163基因座的外源核酸包括，例如但不限于，包含编码感兴趣多肽的核苷酸序列的核酸；包含农艺性状基因的核酸；包含编码rnai分子的核苷酸序列的核酸；或破坏cd163基因的核酸。可以将外源核酸整合到cd163基因座上以修饰cd163基因座，其中，所述核酸包含编码感兴趣多肽的核苷酸序列，使得核苷酸序列在来自cd163基因座的宿主中表达。在一些实例中，感兴趣多肽(例如外来蛋白)以商业数量由编码感兴趣多肽的核苷酸序列表达。在这样的实例中，感兴趣多肽可以从宿主细胞、组织或生物质中提取。包含编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列可以通过操作(例如连接)编码靶向核酸内切酶内包含的多肽的天然核苷酸序列来工程化。例如，可以检查编码包含dna结合多肽的蛋白的基因的核苷酸序列，以鉴定对应于dna结合多肽的基因的核苷酸序列，并且该核苷酸序列可以用作编码包含dna结合多肽的靶向核酸内切酶的核苷酸序列的元件。或者，可以使用靶向核酸内切酶的氨基酸序列来推断编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列，例如根据遗传密码的简并性。在包含编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列的示例性核酸分子中，编码核酸酶多肽的第一多核苷酸序列的最后一个密码子和编码dna结合多肽的第二多核苷酸序列的第一个密码子可以通过任何数量的核苷酸三联体分离，例如，不编码内含子或“停止”。同样地，编码会编码dna结合多肽的第一多核苷酸序列的核苷酸序列的最后一个密码子和编码核酸酶多肽的第二多核苷酸序列的第一个密码子可以通过任何数量的核苷酸三联体分离。编码核酸酶多肽的第一个多核苷酸序列的最后一个密码子(即核酸序列中的大部分3')和编码dna结合多肽的第二多核苷酸序列可以与另一个与其直接相邻的多核苷酸编码序列的第一个密码子进行相位寄存(phase-register)融合，或者通过不超过短肽序列与其分离，例如由合成的核苷酸连接子(例如，可能已经用于实现融合的核苷酸连接子)编码的短肽序列。这种额外的多核苷酸序列的实例包括，例如但不限于，标签、靶向肽和酶促剪切位点。同样，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列的大部分5'(在核酸序列中)的第一个密码子可以与其直接相邻的多核苷酸编码序列的最后一个密码子进行相位寄存融合，或者通过不超过短肽序列与其分离。分离靶向核酸内切酶(例如dna结合多肽和核酸酶多肽)中编码功能多肽的多核苷酸序列的序列可以例如由任何序列组成，使得编码的氨基酸序列不可能显著改变靶向核酸内切酶的翻译。由于已知的核酸酶多肽和已知的dna结合多肽的自主性质，插入的序列不会干扰这些结构的相应功能。其它敲除方法本领域已知的各种其它技术可以用于使基因失活以制备敲除动物和/或将核酸构建体引入到动物中以产生始祖动物并制备动物系，其中，敲除或核酸构建体被整合到基因组中。这样的技术包括但不限于原核显微注射(美国专利号4,873,191)，逆转录病毒介导的基因移植到生殖系(vanderputten等(1985)proc.natl.acad.sci.usa82,6148-1652)，基因靶向胚胎干细胞(thompson等(1989)cell56,313-321)，胚胎电穿孔(lo(1983)mol.cell.biol.3,1803-1814)，精子介导的基因移植(lavitranoetal.(2002)proc.natl.acad.sci.usa99,14230-14235；lavitrano等(2006)reprod.fert.develop.18,19-23)和体细胞的体外转化，例如卵丘细胞或乳腺细胞，或成人，胎儿或胚胎干细胞，然后进行核移植(wilmut等(1997)nature385,810-813和wakayama等(1998)nature394,369-374)。原核显微注射，精子介导的基因移植和体细胞核移植是特别有用的技术。经过基因组修饰的动物是这样的动物，其中，其所有细胞都具有遗传修饰，包括其生殖系细胞。当使用产生在其遗传修饰中嵌合动物的方法时，该动物可以是近交的，且可以选择基因组修饰的后代。例如，如果其细胞在胚囊状态下被修饰，或者当单细胞被修饰时可以发生基因组修饰，克隆可以用来制备嵌合动物。经修饰以使它们没有性成熟的动物可以是纯合的或杂合的以进行修饰，这取决于所使用的具体方法。如果特定的基因通过敲除修饰而失活，则通常需要纯合子。如果特定的基因通过rna干扰或显性负向策略而失活，那么杂合性通常是足够的。通常，在胚胎/合子显微注射中，将核酸构建体或mrna引入到受精卵中；使用1或2个细胞受精卵作为含有来自精子头的遗传物质的核结构，并且卵在原生质内是可见的。原核分期受精卵可以在体外或体内获得(即从供体动物的输卵管手术回收)。体外受精卵可以按如下方式生产。例如，猪的卵巢可以在屠宰场收集，并在运输过程中保持在22-28℃。卵巢可以被洗涤和分离以进行卵泡吸出，并且可以使用18号针在真空下将4-8mm范围内的卵泡吸入到50ml锥形离心管中。卵泡液和吸出的卵母细胞可以通过用商购tl-hepes(minitube,verona,wis.)预过滤器漂洗。可以选择由紧凑的卵丘块包围的卵母细胞并置于补充有0.1mg/ml半胱氨酸，10ng/ml表皮生长因子，10％猪卵泡液，50μm2-巯基乙醇，0.5mg/mlcamp，10iu/ml孕马血清促性腺激素(pmsg)和10iu/ml人绒毛膜促性腺激素(hcg)的tcm-199oocyte成熟培养基(minitube,verona,wis.)中，在38.7℃和5％co2的潮湿空气中约22小时。随后，可以将卵母细胞移至新鲜的不含camp、pmsg或hcg的tcm-199成熟培养基中并再温育22小时。通过在0.1％透明质酸酶中涡旋1分钟可以使成熟的卵母细胞剥离其卵丘细胞。对于猪，成熟的卵母细胞可以在minitube5孔受精盘中的500μlminitubeporcproivf培养基系统(minitube,verona,wis.)中受精。准备体外受精(ivf)时，可以将新鲜收集或冷冻的公猪精液洗涤并重悬于porcproivf培养基中至400000个精子。精子浓度可以通过计算机辅助精液分析(spermvision,minitube,verona,wis.)来分析。最终的体外授精可以在10μl体积中进行，终浓度为约40个活动的精子/卵母细胞，取决于公猪。所有受精的卵母细胞可以在38.7℃温育并在5.0％二氧化碳气氛下6小时。人工授精后6小时，ncsu-23可以将推定的受精卵洗涤两次，并移至0.5ml同样的培养基中。这种系统通常可以在大多数公猪中产生20-30％的胚囊，且10-30％的多精受精率。线性化的核酸构建体或mrna可被注射到原核之一或细胞质中。然后可以将注射的卵移植到雌性受体(例如进入雌性受体的输卵管中)，并允许在雌性受体中发育以产生转基因或基因编辑的动物。具体而言，体外受精胚胎可以以15000×g离心5分钟以沉淀脂质以使原核可视化。可以使用eppendorffemtojet注射器注射胚胎，并且可以培养直至胚囊形成。可以记录胚胎裂解率和胚囊形成和质量。胚胎可以手术移植到异步受体的子宫内。通常，使用5.5英寸导管将100-200(例如150-200)个胚胎沉积到输卵管的壶腹-峡部交界处。手术后，可以进行实时怀孕的超声检查。在体细胞核移植中，可以将包括上述核酸构建体的转基因或基因编辑的细胞例如胚胎卵裂球(embryonicblastomere)，胎儿成纤维细胞(fetalfibroblast)，成人耳成纤维细胞或颗粒细胞引入到去核卵母细胞以建立合并细胞。卵母细胞可以通过在极体附近进行部分透明带切割来去核，然后在切割区域压出细胞质。典型地，使用具有尖锐斜尖端的注射移液管将转基因或基因编辑的细胞注射到在减数分裂2处停滞的去核卵母细胞中。在一些惯例中，在减数分裂2处停滞的卵母细胞被称为卵。在产生猪或牛胚胎(例如通过融合和激活卵母细胞)后，在活化后约20-24小时将胚胎移植至雌性受体的输卵管中。参见例如cibelli等(1998)science280,1256-1258和美国专利号6,548,741，7,547,816，7,989,657或6,211,429。对于猪，在胚胎移植后大约20-21天，可以对受体雌性进行怀孕检查。可以使用标准育种技术来产生对于来自最初的杂合性始祖动物的失活基因纯合的动物。然而，纯合性可能不是必需的。本文所述的基因编辑的猪可以与其它感兴趣的猪一起育种。一旦已经产生基因编辑的动物，可以使用标准技术评估内源核酸的失活。初步筛选可以通过southern印迹分析来完成以确定是否发生失活。对于southern分析的描述，参见sambrook等1989,molecularcloning,alaboratorymanual,secondedition,coldspringharborpress,plainview的9.37-9.52节；n.y.聚合酶链式反应(pcr)技术也可以用于初步筛选pcr是指其中靶核酸被扩增的程序或技术。通常，来自感兴趣区域的末端或更远的末端的序列信息被用于设计与待扩增的模板的相反链序列相同或相似的寡核苷酸引物。pcr可用于扩增来自dna以及rna的特定序列，包括来自总基因组dna或总细胞rna的序列。引物通常长度为14至40个核苷酸，但是长度可以从10个核苷酸至数百个核苷酸。pcr描述于例如pcrprimer：alaboratorymanual,ed.dieffenbach和dveksler,coldspringharborlaboratorypress,1995。也可以通过连接酶链式反应，链替代扩增，自我维持序列复制或基于核酸序列的扩增来扩增核酸。参见例如lewis(1992)geneticengineeringnews12,1；guatelli等(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:1874和weiss(1991)science254:1292。在胚囊阶段，胚胎可以通过pcr、southern杂交和splinkerettepcr分析单独处理以用于分析(参见例如dupuy等procnatlacadsciusa(2002)99:4495)。干扰rna各种干扰rna(rnai)系统是已知的。双链rna(dsrna)诱导同源基因转录物的序列特异性降解。rna诱导的沉默复合物(risc)将dsrna代谢成小的21-23个核苷酸的小干扰rna(sirna)。risc含有双链rnase(dsrnase，例如dicer)和ssrnase(例如argonaut2或ago2)。risc利用反义链作为导向来寻找可剪切的目标。sirna和microrna(mirna)都是已知的。在遗传编辑的动物中使基因失活的方法包含诱导针对靶基因和/或核酸的rna干扰，从而减少靶基因和/或核酸的表达。例如，外源核酸序列可以诱导针对编码多肽的核酸的rna干扰。例如，可以使用与靶dna同源的双链小干扰rna(sirna)或小发夹rna(shrna)以降低该dna的表达。sirna的构建体可以如例如fire等(1998)nature391:806；romanoandmasino(1992)mol.microbiol.6:3343；cogonietal.(1996)emboj.15:3153；cogoniandmasino(1999)nature399:166；misquittaandpaterson(1999)proc.natl.acad.sci.usa96:1451和kennerdellandcarthew(1998)cell95:1017中所述的产生。用于shrna的构建体可以如mcintyre和fanning(2006)bmcbiotechnology6：1中所述的生产。通常，shrna被转录为含有互补区域的单链rna分子，其可以退火并形成短发夹。发现针对特定基因的单个个别功能sirna或mirna的概率很高。例如，sirna的特定序列的可预测性是约50％，但是可以以很好的信心制备许多干扰rna，至少它们中的一个将是有效的。可以使用表达针对编码cd163基因的rnai的体外细胞、体内细胞或遗传编辑的动物(例如家畜动物)。rnai可以例如选自由sirna，shrna，dsrna，risc和mirna组成的组。诱导系统诱导系统可用于灭活cd163基因。已知各种诱导型系统允许基因失活的空间和时间控制。已经证实几种在猪类动物体内具有功能。诱导型系统的实例是四环素(tet)-启动子系统，其可用于调节核酸的转录。在该系统中，将突变的tet抑制剂(tetr)与单纯疱疹病毒vp16反式激活蛋白的激活结构域融合以产生受tet或多西环素(dox)调控的四环素控制的转录激活子(tta)。在不存在抗生素的情况下，转录是最小的，而在存在tet或dox的情况下，转录被诱导。替代诱导系统包括蜕皮激素或雷帕霉素系统。蜕皮激素是一种昆虫蜕皮激素，其生产由蜕皮激素受体的异二聚体和超气门基因(usp)的产物控制。通过用蜕皮激素或蜕皮激素类似物如脱皮甾酮a(muristeronea)的处理来诱导表达。施用于动物以触发诱导系统的试剂被称为诱导剂。四环素诱导系统和cre/loxp重组酶系统(组成型或诱导型)是更常用的诱导型系统之一。四环素诱导系统涉及四环素控制的反式激活因子(tta)/反向tta(rtta)。在体内使用这些系统的方法涉及产生遗传编辑的动物的两个系。一个动物系在选择的启动子的控制下表达激活因子(tta，rtta或cre重组酶)。另一个动物系表达受体，其中感兴趣的基因(或待修饰的基因)的表达在tta/rtta反式激活因子的靶序列(或侧接loxp序列)的控制下。交配两个动物提供基因表达的控制。四环素依赖性调控系统(tet系统)依赖于两种组分，即反式激活因子(tta或rtta)和以四环素依赖性方式控制四环素控制下游cdna表达的tta/rtta依赖性启动子。在不存在四环素或其衍生物(如多西环素)的情况下，tta结合teto序列，以允许依赖性启动子的转录激活tta。然而，在多西环素的存在下，tta不能与其靶标相互作用，并且不发生转录。使用tta的tet系统被称为tet-off，因为四环素或多西环素允许转录下调。四环素或其衍生物的施用允许体内转基因表达的时间控制。rtta是tta的变体，在没有多西环素的情况下不起作用，但需要存在用于反式激活的配体。这个tet系统因此被称为tet-on。tet系统已经在体内用于几种转基因的可诱导表达，编码例如报道基因、致癌基因或涉及信号级联的蛋白质。cre/lox系统使用cre重组酶，cre重组酶通过两个相距较远的cre识别序列(即loxp位点)之间的交换来催化位点特异性重组。引入两个loxp序列(称为敲除dna)之间的dna序列通过cre介导的重组切除。使用空间对照(具有组织或细胞特异性启动子)或时间控制(具有诱导系统)控制转基因和/或基因编辑的动物中的cre表达，导致两个loxp位点之间的dna切除的控制。一个应用是用于条件性基因失活(条件性敲除)。另一种途径是用于蛋白过表达，其中，在启动子序列和感兴趣dna之间插入敲除终止密码子。遗传编辑的动物直到cre被表达才能表达转基因，导致敲除终止密码子的切除。该系统已被用于b淋巴细胞中组织特异性肿瘤发生和受控抗原受体表达。诱导型cre重组酶已经被开发出来。诱导型cre重组酶仅通过施用外源配体而被激活。诱导型cre重组酶是含有原始cre重组酶和特异性配体结合结构域的融合蛋白。cre重组酶的功能活性取决于能够与融合蛋白中的这个特定结构域结合的外部配体。可以使用包含处于诱导系统控制下的cd163基因的体外细胞、体内细胞或遗传编辑的动物(例如家畜动物)。动物的基因修饰可以是基因组的或嵌合的。诱导型系统可以例如选自由tet-on，tet-off，cre-lox和hif1α组成的组。载体和核酸可以将多种核酸引入到细胞中用于敲除目的，用于基因的失活以获得基因的表达，或用于其它目的。如本文所用，术语核酸包括dna、rna和核酸类似物以及是双链或单链(即有义或反义单链)的核酸。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处被修饰以改善例如核酸的稳定性、杂交性或溶解性。在碱基部分的修饰包括脱氧胸腺嘧啶核苷的脱氧尿苷、5-甲基-2'-脱氧胸腺嘧啶核苷和5-溴-2'-脱氧胸腺嘧啶核苷的脱氧尿苷。糖部分的修饰包括核糖的2'羟基修饰以形成2'-o-甲基或2'-o-烯丙基糖。可以修饰脱氧核糖磷酸骨架以产生其中每个碱基部分与六元吗啉代环或肽核酸连接的吗啉代核酸，其中，脱氧磷酸骨架被伪肽骨架替换且保留四个碱基。参见summerton和weller(1997)antisensenucleicaciddrugdev.7(3):187和hyrup等(1996)bioorgan.med.chem.4:5。另外，脱氧磷酸骨架可以用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架，亚磷酰胺或烷基磷酸三酯骨架替换。靶核酸序列可以可操作地连接至调控区域如启动子。调控区域可以是猪调控区域或可以来自其它物种。如本文所用，可操作地连接是指以这种方式调控区域相对于核酸序列的定位以允许或促进靶核酸的转录。任何类型的启动子可以可操作地连接至靶核酸序列。启动子的实例包括但不限于组织特异性启动子，组成型启动子，诱导型启动子和对特定刺激物有反应或无反应的启动子。合适的组织特异性启动子可以导致核酸转录物在β细胞中的优先表达，并且包括例如人胰岛素启动子。其它组织特异性启动子可以导致在例如肝细胞或心脏组织中优先表达，并且可以分别包括白蛋白或α-肌球蛋白重链启动子。可以使用促进不具有显著组织或时间特异性的核酸分子表达的启动子(即组成型启动子)。例如，也可以使用β-肌动蛋白启动子如鸡β-肌动蛋白基因启动子，泛素启动子，minicags启动子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子或3-磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子，以及病毒启动子如单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)启动子，sv40启动子或巨细胞病毒(cmv)启动子。例如，鸡β肌动蛋白基因启动子和cmv增强子的融合体可以用作启动子。例如参见xu等(2001)hum.genether.12:563和kiwaki等(1996)hum.genether.7:821。可用于核酸构建体的其它调控区域包括但不限于聚腺苷酸化序列，翻译控制序列(例如内部核糖体进入片段，ires)，增强子，诱导型元件或内含子。这样的调控区域可能不是必需的，虽然它们可以通过影响转录，mrna的稳定性，翻译效率等来增加表达。可以根据需要将这样的调控区域包括在核酸构建体中以获得细胞中核酸的最佳表达。然而，如果没有这些附加元件，有时可以获得足够的表达。可以使用编码信号肽或选择性标记的核酸构建体。可以使用信号肽，使得编码的多肽被导向特定的细胞位置(例如细胞表面)。选择性标记的非限制性实例包括嘌呤霉素，更昔洛韦(ganciclovir)，腺苷脱氨酶(ada)，氨基糖苷磷酸转移酶(neo，g418，aph)，二氢叶酸还原酶(dhfr)，潮霉素-b-磷酸转移酶，胸苷激酶(tk)和叶黄素-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xgprt)。这样的标记对于选择培养物中稳定的转化体是有用的。其它选择性标记包括荧光多肽，例如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。编码选择性标记的序列可以侧接重组酶(例如cre或flp)的识别序列。例如，选择性标记可以侧接loxp识别位点(由cre重组酶识别的34-bp识别位点)或frt识别位点，使得选择性标记可以从构建体中切除。参见orban,等proc.natl.acad.sci.(1992)89:6861,关于cre/lox技术的综述，以及brand和dymecki,dev.cell(2004)6:7。含有选择性标记基因插入的cre-或flp-激活转基因的转座子也可用于获得具有条件性转基因表达的动物。例如，驱动标记/转基因表达的启动子可以是普遍存在的或组织特异性的，这将导致标记在f0动物(例如猪)中普遍存在或组织特异性表达。转基因的组织特异性激活可以例如通过将以普遍存在的标记中断的表达转基因的猪与以组织特异性方式表达cre或flp的猪交配，或者通过将以组织特异性方式表达标记中断的转基因的猪与以普遍存在表达cre或flp重组酶的猪交配来完成。转基因的受控表达或标记的受控切除允许转基因的表达。外源核酸可以编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包括编码设计为促进所编码的多肽进行后续操作(例如以促进定位或检测)的“标签”的标签序列。标签序列可以插入到编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签位于多肽的羧基端或氨基端。编码标签的非限制性实例包括谷胱甘肽s-转移酶(gst)和flagtm标签(kodak,newhaven,conn.)。可以使用sssicpg甲基化酶(newenglandbiolabs,ipswich,mass.)甲基化核酸构建体。通常，核酸构建体可以与缓冲液中的s-腺苷甲硫氨酸和sssicpg-甲基化酶一起在37℃温育。超甲基化可以通过将构建体与一个单位的hinp1i核酸内切酶在37℃温育1小时并通过琼脂糖凝胶电泳分析来确认。可以使用各种技术将核酸构建体引入到任何类型的胚胎、胎儿或成年动物细胞中，包括例如生殖细胞如卵母细胞或卵，祖细胞，成年或胚胎干细胞，原始生殖细胞；肾细胞例如pk-15细胞，胰岛细胞，β细胞，肝细胞；或成纤维细胞如真皮成纤维细胞。技术的非限制性实例包括使用转座子系统，可以感染细胞的重组病毒，或者能够将核酸递送至细胞的脂质体或其它非病毒方法，例如电穿孔、显微注射或磷酸钙沉淀。在转座子系统中，核酸构建体的转录单位，即与外源核酸序列可操作地连接的调控区域，侧接转座子的反向重复序列。一些转座子系统，包括例如“睡美人”(参见美国专利号6,613,752和美国公开号2005/0003542)；“青蛙王子”(miskey等(2003)nucleicacidsres.31:6873)；tol2(kawakami(2007)genomebiology8(suppl.1):s7；minos(pavlopoulos等(2007)genomebiology8(suppl.1):s2)；hsmar1(miskey等(2007))molcellbiol.27:4589)和已开发的“护照”以将核酸引入到细胞中，包括小鼠，人和猪细胞。“睡美人”转座子是特别有用的。转座酶可作为与外源核酸在相同的核酸构建体上编码的蛋白递送，且可以引入到分离的核酸构建体上或作为mrna(例如体外转录的和加帽的mrna)提供。也可将隔离子元件包含在核酸构建体中以保持外源核酸的表达并抑制宿主基因的不希望的转录。参见例如美国公开号2004/0203158。通常，隔离子元件位于转录单元的每侧，并且位于转座子的反向重复序列的内部。隔离子元件的非限制性实例包括基质附着区-(mar)型隔离子元件和边界型隔离子元件。例如参见美国专利号6,395,549，5,731,178，6,100,448和5,610,053以及美国公开号2004/0203158。可以将核酸掺入到载体中。载体是一个广泛的术语，包括任何特定的被设计为从携带者移植到靶dna的dna片段。载体可以被称为表达载体或载体系统，其是为了将dna插入到基因组或其它靶向dna序列(例如附加体，质粒，甚至病毒/噬菌体dna片段)中所需的一组组分。诸如病毒载体(例如逆转录病毒，腺伴随病毒和整合噬菌体病毒)的载体系统和用于动物中基因递送的非病毒载体(例如转座子)具有两个基本组分：1)由dna(或逆转录成cdna的rna)组成的载体以及2)识别载体和dna靶序列并将载体插入到靶dna序列中的转座酶、重组酶或其它整合酶。载体通常含有一个或多个表达盒，其包含一个或多个表达控制序列，其中，表达控制序列分别是控制和调控另一个dna序列或mrna的转录和/或翻译的dna序列。许多不同类型的载体是已知的。例如，质粒和病毒载体，如逆转录病毒载体是已知的。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点，合适的启动子和任选的增强子，必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列和5'侧翼非转录序列。载体的实例包括：质粒(其也可以是另一种载体的携带者)，腺病毒，腺伴随病毒(aav)，慢病毒(例如修饰的hiv-1，siv或fiv)，逆转录病毒(例如asv，alv或momlv)和转座子(例如，“睡美人”，p元件，tol-2，“青蛙王子”，piggybac)。如本文所用，术语核酸是指rna和dna，包括例如cdna，基因组dna，合成的(例如化学合成的)dna，以及天然存在的和化学修饰的核酸，例如合成碱基或替代骨架。核酸分子可以是双链或单链(即有义或反义单链)。始祖动物，动物系，性状和繁殖可以通过本文所述的克隆及其它方法产生始祖动物。始祖对于遗传修饰可以是纯合的，如在合子或原代细胞经历纯合修饰的情况中。同样，始祖也可以做成杂合子。在包含编码cd163蛋白的基因中至少一个修饰的染色体序列的动物的情况下，所述始祖优选是杂合的。始祖可能进行基因组修饰，这意味着其基因组中的所有细胞都经过了修饰。当载体被引入到胚胎中的多个细胞中的一个，典型地在胚囊阶段时可能发生始祖的嵌合修饰。可以测试嵌合动物的后代以鉴定经基因组修饰的后代。当产生一个可以繁殖性或辅助繁殖技术，异质性或纯合后代持续表达的修饰的动物池时，动物系建立。在家畜中，已知许多等位基因与各种性状例如生产性状，类型性状，可加工性状及其它功能性状相连接。技术人员习惯于监测和量化这些性状，例如visscher等livestockproductionscience,40(1994)123-137，美国专利号7,709,206，美国2001/0016315，美国2011/0023140和美国2005/0153317。动物系可以包括的性状选自由生产性状，类型性状，可加工性状，生育力性状，母性性状和抗病性状组成的组中的性状。其它性状包括重组基因产物的表达。具有期望一种或多种性状的动物可以被修饰以防止其性成熟。由于动物是不育的，直到成熟，因此可以调控性成熟作为控制动物传播的手段。因此，可以提供被育种或修饰为具有一种或多种性状的动物给受体，降低受体育种动物的风险，并适当地将这些性状价值提供给自己。例如，动物的基因组可以是遗传修饰的，其中，修饰包含性成熟基因的失活，其中，野生型动物中的性成熟基因表达对性成熟选择性因子。可以通过施用化合物来治疗动物以补救由基因表达丧失引起的缺陷，从而诱导动物性成熟。需要施用化合物诱导性成熟的动物的育种可以有利地在治疗设施处完成。治疗设施可以在良好控制的库存上实施标准化的协议以有效地生产一致的动物。动物后代可被分配到多个位置而被饲养。因此，农场和农民(包括牧场和牧场主的术语)可以整理具有指定范围年龄和/或重量和/或性状的期望数量的后代，并且在期望的时间和/或位置交付它们。受体例如农民，然后可以饲养动物，并按期望将它们递送到市场。具有失活性成熟基因的遗传修饰的家畜动物可被递送(例如到一个或多个位置，到多个农场)。动物可以具有约1天至约180天的年龄。动物可具有一种或多种性状(例如表达所期望性状或高价值性状或新型性状或重组性状的性状)。育种方法和增加动物对感染抗性和动物种群的方法本文提供了一种育种以产生降低病原体感染易感性的动物或谱系的方法。该方法包含基因修饰卵母细胞或精子细胞以将编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列引入到卵母细胞和精子细胞中的至少一个中，并且用精子细胞使卵母细胞受精以产生含有编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列的受精卵。或者，该方法包含基因修饰受精卵以将编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列引入到受精卵中。该方法进一步包含将受精卵移植到代孕者雌性动物中，其中，妊娠期和分娩期产生后代动物；筛选所述后代动物对病原体的易感性；并且选择与在编码cd163蛋白的基因中不包含修饰的染色体序列的动物相比对病原体易感性降低的后代动物。提供了另一种育种以产生降低病原体感染易感性的动物或谱系的方法。该方法包含基因修饰卵母细胞或精子细胞以将编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列引入到卵母细胞和精子细胞中的至少一个中，并且用精子细胞使卵母细胞受精以产生含有编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列的受精卵。或者，该方法包含基因修饰受精卵以将编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列引入到受精卵中。该方法进一步包含将受精卵移植到代孕者雌性动物中，其中，妊娠期和分娩期产生后代动物；筛选所述后代动物对病原体的易感性；并且选择与在编码cd163蛋白的基因中不包含修饰的染色体序列的动物相比对病原体易感性降低的后代动物。修饰的染色体序列导致后代动物产生基本上无功能的cd163蛋白。提供了另一种育种以产生降低病原体感染易感性的动物或谱系的方法。该方法包含基因修饰卵母细胞或精子细胞以将编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列引入到卵母细胞和精子细胞中的至少一个中，并且用精子细胞使卵母细胞受精以产生含有编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列的受精卵。或者，该方法包含基因修饰受精卵以将编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列引入到受精卵中。该方法进一步包含将受精卵移植到代孕者雌性动物中，其中，妊娠期和分娩期产生后代动物；筛选所述后代动物对病原体的易感性；并且选择与在编码cd163蛋白的基因中不包含修饰的染色体序列的动物相比对病原体易感性降低的后代动物。修饰的染色体序列包含在编码cd163蛋白的基因中的框内缺失。病原体优选包含病毒，例如prrsv。例如，修饰可以降低对1型prrsv病毒，2型prrsv，或1型和2型prrsv病毒两者的易感性。该修饰可以降低对选自由nvsl97-7895，ks06-72109，p129，vr2332，co90，az25，mlv-resprrs，ks62-06274，ks483(sd23983)，co84，sd13-15，雷垒斯塔德，03-1059，03-1060，sd01-08，4353pz及其组合组成的组的prrsv分离株的易感性。动物可以是胚胎、青少年或成人。动物可以包含家养动物。驯化的动物可以包含家畜，例如猪类动物，牛类动物(例如肉牛或奶牛)，绵羊类动物，山羊类动物，马类动物(例如马或驴)，水牛，骆驼或禽类动物(例如鸡，火鸡，鸭，鹅，珍珠鸡，或乳鸽)。家畜优选是牛或猪类动物，最优选是猪类动物。遗传修饰卵母细胞，精子细胞或受精卵的步骤可以包含卵母细胞，精子细胞或受精卵的遗传编辑。遗传编辑可以包含使用归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶可以是天然存在的核酸内切酶，但是优选是合理设计的非天然存在的具有已设计的dna识别序列的归巢核酸内切酶，使得核酸内切酶靶向编码cd163蛋白的基因中的染色体序列。因此，归巢核酸内切酶可以是设计的归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶可以包含例如规律成簇间隔短回文重复(crispr)/cas9系统，转录激活因子样效应子核酸酶(talen)，锌指核酸酶(zfn)，重组酶融合蛋白，大范围核酸酶，或其组合)。遗传编辑优选包含使用crispr/cas9系统。卵母细胞、精子细胞或受精卵对于修饰的染色体序列可以是杂合的。或者，卵母细胞、精子细胞或受精卵对于修饰的染色体序列可以是纯合的。修饰的染色体序列可以包含编码cd163蛋白的基因中的插入，编码cd163蛋白的基因中的缺失或其组合。例如，修饰的染色体序列包含编码cd163蛋白的基因中的缺失(例如框内缺失)。或者，修饰的染色体序列可以包含编码cd163蛋白的基因中的插入。与缺乏插入或缺失的动物中的cd163蛋白产生或活性相比，插入或缺失可以引起cd163蛋白产生或活性的降低。插入或缺失可以导致动物产生基本上无功能的cd163蛋白。“基本上无功能的cd163蛋白”是指动物、后代或细胞中的cd163蛋白水平是不可检测的，或者如果可检测到的话，比不包含插入或缺失的动物、后代或细胞中观察到的水平低至少约90％。当动物是猪类动物时，修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的外显子7，编码cd163蛋白的基因的外显子8，与编码cd163蛋白的基因的外显子7或外显子8邻接的内含子或其组合中的修饰。修饰的染色体序列适当地包含在编码cd163蛋白的基因的外显子7中的修饰。编码cd163蛋白的基因的外显子7中的修饰可以包含缺失(例如外显子7中的框内缺失)。或者，编码cd163蛋白的基因的外显子7中的修饰可以包含插入。当动物是猪类动物时，修饰的染色体序列可以包含：(a)seqidno：118。或者(b)选自由以下组成的修饰：与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3147的124个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3146的123个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的核苷酸在3147和3148之间的1个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3159的130个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3030至核苷酸3161的132个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸1525至核苷酸3030的1506个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2724至核苷酸4096的1373个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸4531的1387个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2440至核苷酸4160的1720个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失；或其组合。当与参考序列seqidno：47相比猪类动物包含在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入时，2个碱基对插入可以包含二核苷酸ag的插入。当与参考序列seqidno：47相比猪类动物包含在核苷酸3147和3148之间的1个碱基对插入时，1个碱基对插入可以包含单个腺嘌呤残基的插入。当与参考序列seqidno：47相比猪类动物包含在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入时，7个碱基对插入可以包含序列tactact(seqidno：115)。当与参考序列seqidno：47相比猪类动物包含从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；12个碱基对插入可以包含序列tgtggagaattc(seqidno：116)。当与参考序列seqidno：47相比猪类动物包含从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失时，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入，11个碱基对插入可以包含序列agccagcgtgc(seqidno：117)。当编码cd163蛋白的基因中的修饰的染色体序列包含缺失时，缺失优选包含框内缺失。因此，在动物是猪类动物的情况下，编码cd163蛋白的基因中的插入或缺失可以包含外显子7中的框内缺失，所述外显子7选自由以下组成的组：与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸1525至核苷酸3030的1506个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2724至核苷酸4096的1373个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3024至核苷酸3146的123个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸4531的1387个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113开始的11个碱基对插入；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2440至核苷酸4160的1720个碱基对缺失；及其组合。当动物是猪类动物时，插入或缺失可以选自由以下组成的组：与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失；与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失；及其组合。例如，修饰的染色体序列可以包含与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及在同一等位基因上的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3145至核苷酸3172的28个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3015至核苷酸3466的452个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含本文所述的任何修饰的染色体序列的任何组合。例如，修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3148和核苷酸3149之间的7个碱基对插入；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的核苷酸3148至核苷酸3149之间的7个碱基对插入；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3113至核苷酸4494的1382个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸3113处开始的11个碱基对插入。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的seqidno：118；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的seqidno：118；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的seqidno：118；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对缺失，其中，缺失的序列被替换为从核苷酸488开始的12个碱基对插入，并且其中，还存在与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中的129个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的在核苷酸3149和3150之间的2个碱基对插入，以及与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2573至核苷酸2949的377个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失；以及在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的与参考序列seqidno：47相比的从核苷酸3137至核苷酸3147的11个碱基对缺失。包含上述任何插入或缺失的修饰的染色体序列可以包含在插入或缺失之外与seqidno：47具有高度序列一致性的染色体序列。因此，例如卵母细胞，精子细胞或受精卵可以包含具有与在插入或缺失之外的染色体序列的区域中的seqidno：47至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，至少99.9％或100％序列一致性的染色体序列。修饰的染色体序列可以包含含有seqidno：98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，118或119的染色体序列。如以下示例中进一步描述的，seqidno：98-114和119提供了在seqidno：47中提供的野生型猪cd163的对应区域的核苷酸序列，并且包括在本文中描述的猪cd163染色体序列中的插入或缺失。seqidno：118提供了与seqidno：47提供的野生型猪cd163的区域对应的区域的序列，其中，外显子7已经被编码人cd163样1蛋白(hcd163l1)的srcr8的同系物的合成外显子替代。例如，修饰的染色体序列可以包含含有seqidno：98，101，105，109，110，112，113或114的染色体序列。seqidno：98，101，105，109，110，112，113或114提供了猪cd163染色体序列的外显子7中的框内缺失的核苷酸序列。作为另一个实例，修饰的染色体序列可以包含含有seqidno：103，111或119的染色体序列。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的11个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的2个碱基对插入以及377个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的124个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的123个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含1个碱基对插入。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的130个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的132个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含1506个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含7个碱基对插入。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的1280个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的1373个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含1467个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含从核苷酸488至核苷酸2417的1930个碱基对内含子6缺失，以及在核苷酸4488处的12个碱基对插入和外显子7中另外的129个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的28个碱基对缺失和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的1387个碱基对缺失。修饰的染色体序列可以包含在编码cd163蛋白的基因的一个等位基因中的1382个碱基对缺失以及11个碱基对插入和在编码cd163蛋白的基因的另一个等位基因中的1720个碱基对缺失。在任何育种方法中，选择的动物可以用作始祖动物。在任何育种方法中，受精可以包括人工授精。还提供了通过任何育种方法制备的动物种群。动物种群优选对病原体例如病毒例如prrsv感染具有抗性。例如，种群可以对1型prrsv病毒，2型prrsv，或1型和2型prrsv病毒两者的感染具有抗性。种群可以对由选自由nvsl97-7895，ks06-72109，p129，vr2332，co90，az25，mlv-resprrs，ks62-06274，ks483(sd23983)，co84，sd13-15，雷垒斯塔德，03-1059，03-1060，sd01-08，4353pz及其组合组成的组的prrsv分离株感染具有抗性。还提供了增加家畜动物对病原体感染抗性的方法。该方法包含基因编辑来自编码cd163蛋白的基因的至少一个染色体序列，从而与在编码cd163蛋白的基因中不包含编辑的染色体序列的家畜动物中的cd63蛋白产生或活性相比，cd163蛋白产生或活性降低。病原体优选包含病毒(例如prrsv)。提供了增加家畜动物对病原体感染抗性的另一种方法。该方法包含遗传编辑来自编码cd163蛋白的基因的至少一个染色体序列，从而家畜动物产生基本上无功能的cd163蛋白。提供了增加家畜动物对病原体感染抗性的又一种方法。该方法包含遗传编辑来自编码cd163蛋白的基因的至少一个染色体序列以引入框内缺失，其中，与在编码cd163蛋白的基因中不包含编辑的染色体序列的家畜动物中的cd63蛋白产生或活性相比，家畜动物中cd163蛋白产生或活性降低。框内缺失可以是例如本文所描述的任何框内缺失。核酸提供了核酸。核酸分子可以包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：(a)包含seqidno：47的核苷酸序列；(b)与seqidno：47序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列相对于seqidno：47含有至少一个置换、插入或缺失；和(c)(a)或(b)的cdna序列。或者，所述核酸可以包含(a)与seqidno：47序列具有至少87.5％序列一致性的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列相对于seqidno：47含有至少一个置换、插入或缺失；和(b)(a)的cdna序列。本文所述的任何核酸分子可以是分离的核酸分子。例如，分离的核酸可以包含包含seqidno：47的核苷酸序列。或者，所述核酸可以包含与seqidno：47序列具有至少80％序列一致性的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列相对于seqidno：47含有至少一个置换、插入或缺失。核酸可以包含与seqidno：47序列具有至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或至少99.9％序列一致性的核苷酸序列。其中，所述核苷酸序列相对于seqidno：47含有至少一个置换、插入或缺失。所述核酸分子优选与seqidno：47序列具有至少87.5％的序列一致性，其中，所述核苷酸序列相对于seqidno：47含有至少一个置换、插入或缺失。与不包含置换、插入或缺失的核酸相比，置换、插入或缺失优选减少或消除cd163蛋白产生或活性。核酸可以包含seqidno：98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，118或119。例如，核酸可以包含seqidno：98，101，105，109，110，112，113或114。例如，核酸可以包含seqidno：103，111或119。核酸可以包含cdna。提供了其它核酸。核酸可以包含seqidno：98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，118或119。例如，核酸可以包含seqidno：98，101，105，109，110，112，113或114。作为另一个实例，核酸可以包含seqidno：103，111或119。已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明范围的情况下，可以进行修改和变化。实施例提供以下非限制性实施例来进一步说明本发明。实施例1：使用crispr/cas9系统已由体外衍生的卵母细胞和胚胎产生遗传工程猪最近报道描述的归巢核酸内切酶如锌指核酸酶(zfn)，转录激活因子样效应子核酸酶(talen)和规律成簇间隔短回文重复(crispr)/crispr相关(cas9)系统中的组分建议猪的遗传工程(ge)现在可能更有效率。靶向归巢核酸内切酶可以在基因组的特定位置诱导双链断裂(dsb)，并且如果提供供体dna，则通过非同源末端连接(nhej)或者刺激同源重组(hr)引起随机突变。如果供体dna与靶向核酸酶一起提供，则可以用归巢核酸内切酶通过hr实现基因组的靶向修饰。在体细胞中引入特异性修饰之后，通过scnt将这些细胞用于生产各种用途的ge猪。因此，归巢核酸内切酶是产生ge猪的有用工具。在不同的归巢核酸内切酶中，由原核生物改造而来的crispr/cas9系统似乎是一种有效的方法，且它被用作防御机制。在本质上，cas9系统需要三个组分：含有与靶序列(顺式抑制的rna[crrna])互补的区域的rna(～20个碱基)；含有与crrna互补的区域的rna(反式激活crrna[tracrrna])；和cas9，这种复合物中的酶蛋白组分。可以构建单个导向rna(grna)以起到碱基配对的crrna和tracrrna的作用。grna/蛋白复合物可以扫描基因组并在与crrna/grna互补的区域处催化dsb。与其它设计的核酸酶不同，只需要设计短寡聚体来构建靶向目标基因所需的试剂，而组装zfn和talen需要一系列克隆步骤。与目前用于基因破坏的标准方法不同，使用设计的核酸酶提供了使用合子作为ge起始材料的机会。家畜基因破坏的标准方法涉及培养细胞中的hr，随后通过体细胞核移植(scnt)重建胚胎。因为通过scnt产生的克隆动物有时显示发育缺陷的迹象，所以scnt/ge始祖的后代通常用于研究以避免混淆scnt异常和如果将始祖动物用于实验可能发生的表型。考虑到与啮齿类动物相比，猪的妊娠期较长，居住成本较高，因此降低育种需求有时间和成本的好处。最近的报告显示，将zfn和talen直接注射到猪合子中可以破坏内源基因并产生具有所需突变的仔猪。然而，只有约10％的仔猪表现出对靶基因的等位基因修饰，并且一些呈现了嵌合基因型。最近一篇文章表明，crispr/cas9系统可以诱导开发胚胎的突变，并以比zfn或talen更高的效率产生ge猪。然而，由crispr/cas9系统产生的ge猪也具有嵌合基因型。此外，上述所有研究都使用体内来源的受精卵进行实验，这需要大量的劳力和大量的母猪以获得足够数量的受精卵。本实施例描述了使用crispr/cas9系统经由注射体外来源的合子和随后通过scnt的体细胞修饰以产生ge猪的有效方法。靶向两种内源基因(cd163和cd1d)和一种转基因(egfp)，并且仅将体外来源的卵母细胞或合子分别用于scnt或rna注射。cd163似乎对猪繁殖与呼吸综合征病毒(一种已知会对猪业造成重大经济损失的病毒)的生产性感染是必需的。cd1d被认为是一种非经典的主要组织相容性复合体蛋白，并参与脂质抗原向不变自然杀伤t细胞的传递。这些基因缺陷的猪被设计成农业和生物医学模型。egfp转基因被用作概念验证实验和方法优化的靶标。材料和方法化学药品和试剂。除非另有说明，本研究中使用的所有化学药品均购自sigma公司。用于构建特定crispr的grna设计将导向rna设计为cd163的外显子7内对野生型cd163是独特的且不存在于结构域交换靶向载体(下文所述)中的区域，因此，crispr将导致野生型cd163内的dsb，而不是结构域交换靶向载体中的dsb。仅在四个位置中，靶向载体将引入会改变化脓性链球菌(spy)原始间隔子邻接模体(pam)的单核苷酸多态性(snp)。所有四个靶标被选择为包括：(seqidno：1)ggaaacccaggctggttggaggg(crispr10)，(seqidno：2)ggaactacagtgcggcactgtgg(crispr131)，(seqidno：3)cagtagcaccccgccctgacggg(crispr256)和(seqidno：4)tgtagccacagcagggacgtcgg(crispr282)。pam可以通过每个grna中的粗体字来标识。对于cd1d突变，对crispr靶标的搜索任意地限于初级转录物的前1000bp内的编码链。然而，repeatmasker[26](“猪”重复文库)鉴定了从初级转录物的943碱基开始的重复元件。然后，crispr靶标的搜索限于初级转录物的前942bp。由于最后的spypam位于873碱基处，所以搜索进一步限于初级转录物的前873bp。选择第一个靶标(crispr4800)是因为它与初级转录物中位于42碱基的起始密码子重叠(ccagcctcgcccagcgacatggg(seqidno：5))。选择两个额外的靶标(crispr5620和5626)，因为它们在任意选择的区域(ctttcatttatctgaactcaggg(seqidno：6)和ttatctgaactcagggtccccgg(seqidno：7))内是对第一选择的最远端。这些靶标重叠。关于起始密码子，最近端的spypam位于简单的序列中，其含有通过视觉评估确定的大量均聚序列。关于第一靶标选择，选择第四靶标(crispr5350)，因为它们是不含大量均聚区域(cagctgcagcatatatttaaggg(seqidno：8))的最近端靶标。设计的crrna的特异性通过在genbank中搜索相似的猪序列来确认。将寡核苷酸(表1)退火并克隆到含有两个表达盒，人密码子优化的化脓性链球菌(hspy)cas9和嵌合导向rna的p330x载体中。按照zhang实验室方案(http://www.addgene.org/crispr/zhang/)用bbsi(newenglandbiolabs)消化p330x。对于靶向egfp，在egfp起始密码子的前60bp内设计了两个靶向egfp编码序列的特异性grna。egfp1和egfp2grna都在反义链上，且egfp1直接靶向起始密码子。egfp1grna序列为ctcctcgcccttgctcaccatgg(seqidno：9)，egfp2grna序列为gaccaggatgggcaccaccccgg(seqidno：10)。表1.设计的crrna。引物1和引物2按照zhang方案退火。引物序列(5’–3’)seqidno.cd163101caccggaaacccaggctggttgga48cd163102aaactccaaccagcctgggtttcc49cd1631311caccggaactacagtgcggcactg50cd1631312aaaccagtgccgcactgtagttcc51cd1632561caccgcagtagcaccccgccctgac52cd1632562aaacgtcagggcggggtgctactgc53cd1632821caccgtgtagccacagcagggacgt54cd1632822aaacacgtccctgctgtggctacac55cd1d48001caccgccagcctcgcccagcgacat56cd1d48002aaacatgtcgctgggcgaggctggc57cd1d53501caccgcagctgcagcatatatttaa58cd1d53502aaacttaaatatatgctgcagctgc59cd1d56201caccgctttcatttatctgaactca60cd1d56202aaactgagttcagataaatgaaagc61cd1d56261caccgttatctgaactcagggtccc62cd1d56262aaacgggaccctgagttcagataac63egfp11caccgctcctcgcccttgctcacca64egfp12aaactggtgagcaagggcgaggagc65egfp21caccggaccaggatgggcaccaccc66egfp22aaacgggtggtgcccatcctggtcc67cd163和cd1d基因的供体dna的合成通过pcr由分离自胎儿成纤维细胞的dna扩增猪cd163和cd1d两者，所述dna将用于以后的转染以确保靶向载体和转染的细胞系之间的等基因匹配。简言之，使用正向引物ctctccctcactctaacctactt(seqidno：11)和反向引物tatttctctcacatggccagtc(seqidno：12)的lataq(clontech)用于扩增cd163的9538bp片段。该片段是dna序列验证的并用于构建结构域交换靶向载体(图1)。该载体包括在外显子7内的33个点突变，以便其编码与来自外显子11的人cd163l相同的氨基酸序列。替换外显子是315bp。此外，随后的内含子被替换为修饰的肌生成抑制素内含子b，该内含子b容纳可以用cre重组酶(cre)去除的选择性标记基因，并且之前已经证明了当携带保留的loxp位点时的正常剪接(wells，未发表的结果)。构建体的长臂是3469bp，包括结构域交换ds外显子。短臂为1578bp，包括外显子7和8(图1，b图片)。使用质粒尝试在第一次转染实验中替换外显子7的编码区域，并允许通过选择性标记(g418)靶向事件的选择。如果靶向发生，可以通过cre重组酶去除标记。然后使用已经含有不能被cre缺失的neo破坏的siglec1基因的细胞系修饰cd163ds-靶向载体。在这个靶向载体中，neo盒、loxp和肌生成抑制素内含子b被去除，并且只有ds外显子保留有wt长臂和短臂(图1的c图片)。使用正向引物ctctccctcactctaacctactt(seqidno：13)和反向引物gactggccatgtgagagaaata(seqidno：14)，用lataq扩增猪cd1d的基因组序列，产生8729bp的片段。将该片段进行dna测序，并用于构建图2所示的靶向载体。neo盒处于磷酸甘油激酶(pgk)启动子的控制下，并侧接引入用于选择的loxp序列。构建体的长臂为4832bp，短臂为3563bp，包括外显子6和7。如果成功的hr发生，外显子3、4和5将被去除并替换为neo盒。如果nhej修复发生不正确，那么将破坏外显子3。胎儿成纤维细胞收集在妊娠的第35天收集猪胎儿组织以产生细胞系。由大白家养交配株建立两个野生型(wt)男性和女性胎儿成纤维细胞系。在这些研究中也使用了先前已被修饰以含有neo盒(siglec1-/-遗传学)的雄性和雌性胎儿成纤维细胞。如上所述收集稍作修饰的胎儿成纤维细胞；在38.5℃下将来自每个胎儿的切碎组织在20ml消化培养基(含有l-谷氨酰胺和1g/ld-葡萄糖[cellgro]的dulbecco改良的eagle培养基[dmem](补充有200单位/ml胶原酶和25kunitz单位/mldnasei)))中消化5小时。消化后，将胎儿成纤维细胞洗涤并用dmem，15％胎牛血清(fbs)和40μg/ml庆大霉素培养。过夜培养后，将细胞进行胰蛋白酶化，并在-80℃下以等分试样在含有10％二甲基亚砜的fbs中冷冻并储存在液氮中。细胞转染和基因型转染条件与之前报道的基本相同。总是使用1μg恒定量的供体dna以及不同量的crispr/cas9质粒(下面列出)。在转染前，供体dna用mlui(cd163)(neb)或aflii(cd1d)(neb)线性化。在转染之前如前述的通过pcr确定建立的细胞系的性别。转染雄性和雌性细胞系，并在转染之间一起分析基因组修饰数据。在含有l-谷氨酰胺和1g/ld-葡萄糖(cellgro)并补充有15％fbs、2.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和10mg/ml庆大霉素的dmem中培养具有相似传代数(2-4)的胎儿成纤维细胞系2天并且生长至75％-85％汇合。用磷酸盐缓冲盐水(pbs)(lifetechnologies)洗涤成纤维细胞并胰蛋白酶化。一旦细胞分离，用电穿孔培养基(75％细胞培养液[120mmkcl，0.15mmcacl2，10mmk2hpo4，ph7.6，5mmmgcl2])和25％opti-mem(lifetechnologies)冲洗细胞。使用血细胞计数器定量细胞浓度。将细胞以600×g沉淀5分钟，并以1×106的浓度重悬浮于电穿孔培养基中。每个电穿孔在2mm间隙比色皿中使用200μl细胞，三次(1毫秒)方波脉冲通过btxecm2001在250v下施用。电穿孔后，将细胞重悬浮于上述dmem中。对于选择，转染后24小时加入600μg/mlg418(lifetechnologies)，并在第7天更换培养基。转染后第14天挑取菌落。如果使用g418选择，则以10000个细胞/板接种胎儿成纤维细胞，如果不使用g418选择，则以50个细胞/板接种胎儿成纤维细胞。胎儿成纤维细胞菌落通过使用高压灭菌真空脂施用密封在每个菌落周围的10mm高压灭菌克隆圆筒来收集。将菌落用pbs冲洗并通过胰蛋白酶收获；然后重悬于dmem培养基中。将重悬的菌落的一部分(1/3)移植至96孔pcr板中，剩余的(2/3)细胞在24孔板的孔中培养。将细胞沉淀重悬于6μl裂解缓冲液(40mmtris，ph8.9，0.9％tritonx-100，0.4mg/ml蛋白酶k[neb])中，在65℃温育30分钟以细胞裂解，随后通过在85℃10分钟以灭活蛋白酶k。pcr筛选ds和大的和小的缺失hr定向修复的检测。使用长程pcr来鉴定cd163或cd1d上的突变。使用三种不同的pcr测定来鉴定hr事件：将从供体dna中的cd163或cd1d序列跨越至右侧或左侧上的内源cd163或cd1d序列的区域的pcr扩增和扩增包含设计的供体dna的cd163或cd1d的大区域的长程pcr。由加入外源neo序列引起的1.8kb(cd1d)或3.5kb(cd163)pcr产物尺寸的增加被认为是hr-定向修复基因的证据。所有pcr条件包括95℃2分钟的初始变性，接着94℃30秒，50℃30秒和68℃7-10分钟的33个循环。根据制造商的建议，使用lataq进行所有测定。表2中示出了引物。表2.用于鉴定cd163和cd1d的hr定向修复的引物引物序列(5’–3’)seqidno.cd163长程测定引物1230fttgttggaaggctcactgtccttg68cd163长程测定引物7775racaactaaggtggggcaaag69cd163左臂测定引物1230fttgttggaaggctcactgtccttg70cd163左臂测定引物8491rggagctcaacattcttgggtcct71cd163右臂测定引物3752fggcaaaattttcatgctgaggtg72cd163右臂测定引物7765rgcacatcacttcgggttacagtg73cd1d长程测定引物f3991fcccaagtatcttcagttctgcag74cd1d长程测定引物r12806rtacaggtaggagagcctgttttg75cd1d左臂测定引物f3991fcccaagtatcttcagttctgcag76cd1d左臂测定引物7373rctcaaaaggatgtaaaccctgga77cd1d右臂测定引物4363ftgttgatgtggtttgtttgccc78cd1d右臂测定引物12806rtacaggtaggagagcctgttttg79小缺失测定(nhej)。通过crispr/cas9系统引入的预测切割位点侧翼的cd163或cd1d的pcr扩增来确定小缺失。扩增子尺寸分别为cd163和cd1d的435bp和1244bp。用lataqpcr扩增来自胚胎和胎儿成纤维细胞的裂解物。分析的pcr条件是95℃2分钟的初始变性，然后94℃30秒，56℃30秒和72℃1分钟的33个循环。对于转染细胞的基因型，通过琼脂糖凝胶电泳分离pcr扩增子以鉴定插入和缺失(indel)。对于胚胎基因型，随后对产生的pcr产物进行dna测序以使用pcr中所用的正向引物鉴定小缺失。引物信息如表3所示。表3.用于通过cd163和cd1d上的nhej鉴定突变的引物引物序列(5’–3’)seqidno.gcd163fggaggtctagaatcggctaagcc80gcd163rggctacatgtcccgtcaggg81gcd1dfgcaggccactaggcagatgaa82gcd1drgagctgacacccaagaagttcct83egfp1ggctctagagcctctgctaacc84egfp2ggacttgaagaagtcgtgctgc85体细胞核移植(scnt)为了产生scnt胚胎，使用来自本地屠宰场的母猪(sow)来源的卵母细胞(art，inc.)或小母猪(gilt)来源的卵母细胞。将母猪来源的卵母细胞在成熟培养基(具有2.9mmhepes，5μg/ml胰岛素，10ng/ml表皮生长因子[egf]，0.5μg/ml猪卵泡刺激素[p-fsh]，0.91mm丙酮酸，0.5mm半胱氨酸，10％猪卵泡液和25ng/ml庆大霉素的tcm-199)中过夜运输，并在24小时后移植到新鲜培养基中。成熟40-42小时后，通过在0.1％透明质酸酶的存在下涡旋以从卵母细胞中去除卵丘细胞。如下所述用于体外受精(ivf)的小母猪来源的卵母细胞是成熟的。在操作期间，将卵母细胞置于补充有7.0μg/ml细胞松弛素b的操作培养基(具有0.6mmnahco3，2.9mmhepes，30mmnacl，10ng/ml庆大霉素和3mg/mlbsa的tcm-199[lifetechnologies]，具有305mosm的渗透压)的操作培养基中。将极体连同相邻细胞质的一部分(可能含有中期ii板)去除，并且通过使用薄玻璃毛细管将供体细胞置于卵周隙空间中。然后使用btxelectrocellmanipulator(harvardapparatus)在具有两个dc脉冲(1秒间隔)的融合培养基(0.3m甘露醇，0.1mmcacl2，0.1mmmgcl2和0.5mmhepes)中在1.2kv/cm下301秒以融合重建的胚胎。融合后，融合的胚胎用200μm硫柳汞在黑暗中10分钟和8mm二硫苏糖醇中30分钟以充分活化。然后如前所述，将胚胎在用0.5μmscriptaid(s7817；sigma-aldrich)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂修饰的猪合子培养基pzm3-mu1中温育14-16小时。体外受精(ivf)对于ivf，来自青春期前小母猪的卵巢从屠宰场(farmlandfoodsinc.)获得。使用附着到10ml注射器的18-规格皮下注射针从中等尺寸(3-6mm)的卵泡中抽吸未成熟的卵母细胞。然后选择具有均匀黑的细胞质和完整的周围卵丘细胞的卵母细胞用于成熟。将大约50个卵丘卵母细胞复合物放置于含有500μl成熟培养基、tcm-199(invitrogen)(具有3.05mm葡萄糖，0.91mm丙酮酸钠，0.57mm半胱氨酸，10ng/mlegf，0.5μg/ml促黄体素(lh)，0.5μg/mlfsh，10ng/ml庆大霉素(apppharm)和0.1％聚乙烯醇)的孔中在38.5℃，5％co2的湿润空气中处理42-44小时。在成熟结束时，通过在0.1％透明质酸酶存在下涡旋3分钟从卵母细胞中去除周围的卵丘细胞。然后，将体外成熟的卵母细胞置于25-30个卵母细胞组中的50μlivf培养基液滴(含有113.1mmnacl，3mmkcl，7.5mmcacl2，11mm葡萄糖，20mmtris，2mm咖啡因，5mm丙酮酸钠，2mg/ml牛血清白蛋白[bsa]的改良型tris缓冲培养基)中。将100μl冷冻精液沉淀在3ml补充有0.1％bsa的dulbeccopbs中解冻。将冷冻的wt或新鲜的egfp精液在60％percoll中以6503g洗涤20分钟，并在改良的tris缓冲培养基中离心10分钟。在一些情况下，新鲜收集的先前描述的egfp转基因杂合的精液在pbs中洗涤三次。然后用ivf培养基将精液沉淀重悬浮至0.5×106细胞/ml。将五十微升的精液悬浮液引入到具有卵母细胞的液滴中。将配子在5％co2的空气环境中在38.5℃下温育5小时。受精后，将胚胎在pzm3-mu1中在38.5℃和5％co2的空气中温育。胚胎移植在第一次发情后，在第一天(scnt)或第六天(注射合子)将生成的产生gecd163或cd1d猪的胚胎移植到代孕者中。对于第6天的移植，在存在10ng/mlps48(stemgent，inc.)的情况下，将合子在pzm3-mu1中再培养五天。将胚胎手术移植到代孕者的输卵管的壶腹-峡部交界处。用于crispr/cas9系统的rna体外合成使用pcr扩增用于体外转录的模板dna(表4)。将用于细胞转染实验的crispr/cas9质粒作为pcr的模板。为了在合子中表达cas9，使用mmessagemmachineultra试剂盒(ambion)以产生cas9的mrna。然后使用poly(a)加尾试剂盒(ambion)将polya信号添加到cas9mrna中。crispr导向rna由megashortscript(ambion)产生。在1.5％琼脂糖凝胶上观察合成的rna的质量，然后稀释至终浓度为10ng/μl(均为grna和cas9)并分配到3μl等分试样中。表4.用于扩增体外转录模板的引物。在合子中显微注射设计的crispr/cas9系统使用femtojet显微注射器(eppendorf)将编码cas9和grna的信使rna在受精后14小时(推定的合子)注射到受精的卵母细胞的细胞质中。在nikon倒置显微镜(nikoncorporation；东京，日本)的加热台上的操作培养基中进行显微注射。然后用10ng/mlps48将注射的合子移植至pzm3-mu1中直至进一步使用。统计分析具有修饰的基因组的菌落的数量被分类为1，并且未修饰的基因组的菌落被分类为0。通过使用procglm(sas)来确定差异，0.05的p值被认为是显著的。平均值是以最小二乘平均值计算的。数据以数字平均值±sem表示。结果crispr/cas9介导的cd163和cd1d在体细胞中的敲除以2μg/μl供体dna的量测试靶向cd163的四种不同crispr质粒(导向物10，131，256和282)的效率(表5)。crispr282产生的平均克隆形成明显多于crispr10和256处理(p<0.05)。如上述的长程pcr检测，发现大部分缺失从503bp至多达1506bp，而不是如本来打算的通过hr的ds(图3，a图片)。这是没有预料到的，因为其它dna编辑系统的以前报道显示使用zfn在猪中的6-333bp的缺失小得多。crispr10和所有四种crispr的混合物导致具有比crispr256和282(表5，p<0.002)更多的修饰基因组的克隆。用crispr10和含有neo但与cd163无同源性的质粒转染导致无菌落呈现大的缺失。有趣的是，当没有任何crispr引入到供体dna中时，也检测到一个单等位基因缺失。该测定可能代表低估突变率，因为没有筛选出在转染的体细胞中在琼脂糖凝胶上不能检测到的测序的任何潜在的小缺失。表5.靶向cd163的四种不同crispr质粒(导向物10，131，256和282)的效率。以2μg至1μg的供体dna的量测试四种不同的crispr(示于图1中)。*4+供体dna的混合物表示0.5μg每种crispr与1μg供体dna的等量混合物。供体dna处理作为无crispr对照，10+neo处理说明在crispr处理中观察到的大缺失仅在cd163供体dna也存在时才存在。比较平均菌落/平板数而进行anova以评估crispr毒性和具有修饰基因组的菌落百分比。p值分别为0.025和0.0002。n/a＝没有重复进行这种处理，因此没有进行统计分析。一个具有hr的菌落表示部分的hr事件。a–c上标字母表示平均菌落数/平板数和具有修饰基因组的菌落百分比的处理之间的显著差异(p<0.05)。最初的目标是通过hr获得针对cd163的结构域交换(ds)靶向事件，但是crispr不增加靶向cd163的效率。应该注意的是，这种靶向载体的各种组合已被用于通过传统转染通过hr修饰cd163，并在筛选3399个菌落后导致0个靶向事件(whitworth和prather，未发表的结果)。用含有全部33个突变的hr的全长ds获得两只猪，试图将这些突变通过用crispr10和作为供体dna的ds-靶向载体转染导入。接着，测试无药物选择的crispr/cas9所诱导突变的效率；本研究中使用的胎儿成纤维细胞系已经具有neo抗性盒和siglec1敲除的整合。还测试了crispr/cas9和供体dna的比例是否会增加基因组修饰或导致高浓度的毒性效应。crispr131被选定用于该试验，因为在之前的实验中，其导致了大量的总菌落和具有修饰基因组的菌落百分比的增加。crispr131dna从3：1到20：1的量增加对胎儿成纤维细胞存活率没有显著影响。经nhej修饰基因组的菌落百分比在各种crispr浓度之间没有显著差异，但在10：1比例具有最高数量的nhej(表6，p＝0.33)。即使在crisprdna与供体dna(20：1)的最高比例的情况下，也没有观察到hr。表6.无药物选择的crispr/cas9所诱导突变的效率。在不使用g418选择的情况下，在先前修饰的细胞系中比较四种不同比例的供体dna与crispr131dna。a处理之间nhej修复的菌落百分比具有显著差异(p>0.05)。b随着crispr浓度的增加，基因组修饰菌落数量没有显著差异(p>0.33)。基于这种经验，试图在体细胞中靶向破坏cd1d。在雄性和雌性细胞中均设计并测试了四种不同的crispr。cd1d的修饰可以从三种应用的crispr中检测到，但是使用crispr5350并没有导致缺失大到足以通过琼脂糖凝胶电泳检测到的cd1d修饰(表7)。有趣的是，虽然提供了供体dna，但没有通过hr获得基因修饰。然而，观察到与cd163敲除实验相似的大缺失(图3，b图片)。当crispr/cas9不与供体dna一起使用时，没有检测到具有大缺失的cd1d靶向修饰。由crispr/cas9导向的靶向的cd1d修饰在雄性细胞菌落和雌性细胞菌落中分别为4/121和3/28。转染数据中仅包括可以通过琼脂糖凝胶电泳检测到的indel。表7.以2μg至1μg供体dna的量测试四种不同的crispr(示于图2中)。供体dna处理作为无crispr对照。使用ge细胞通过scnt产生cd163和cd1d猪将呈现cd163或cd1d修饰的细胞用于scnt以产生cd163和cd1d敲除的猪(图3)。用来自crispr/cas9系统转染的雄性和雌性胎儿成纤维细胞的scnt胚胎进行七次胚胎移植(cd163表8)，六次胚胎移植(cd163-noneo)和五次胚胎移植(cd1d)至受体小母猪中。受体小母猪的六头(cd163)，两头(cd163-noneo)和四头(cd1d)(表9)仍然怀孕至分娩期，分别导致85.7％，33.3％和80％的怀孕率。在cd163受体中，5头通过剖腹产分娩健康的仔猪。其中一头(o044)自然分娩。窝大小从一到八头。四头猪由于出生后不能繁殖而被安乐死。一头仔猪由于严重的腭裂而被安乐死。剩下的所有仔猪看起来都很健康(图3，c图片)。由图3的b图片所述的crispr10和供体dna转染的胎儿成纤维细胞所产生的两窝雄性仔猪在crispr10附近的外显子7中具有30bp缺失和另外前面的内含子的1476bp缺失，从而去除cd163的内含子6/外显子7连接处(图3，e图片)。表10总结了基因型和预测的翻译。由先前修饰的siglec1细胞的cd163-noneo转染获得一头雄性仔猪和一头雌性小母猪(4头仔猪)。所有五头仔猪都是siglec1和cd163的双敲除。雄性仔猪具有cd163的双等位基因修饰，其中一个等位基因外显子7缺失28bp，另一个等位基因缺失1387bp，该缺失包括外显子7的部分缺失以及外显子8和前面内含子的完全缺失，从而去除内含子外显子连接处。雌性仔猪具有cd163的双等位基因突变，其中，包括1382bp缺失，其中一个等位基因具有11bp插入，而另一个等位基因具有1720bp的cd163缺失。在表10中可以找到cd163修饰和预测的翻译的总结。在表11中可以找到通过crispr修饰的cd1d修饰和预测的翻译的总结。简言之，一个雌性和两个雄性窝出生，产生13头仔猪。一头仔猪出生后立即死亡。13头仔猪中的12头含有cd1d的双等位或纯合缺失(图3，f图片)。一头仔猪是wt。表8.cd163的胚胎移植数据。*cd163crisprnt系表示用通过转染修饰的胎儿成纤维细胞系通过nt所产生的胚胎。crispr注射的胚胎是在1细胞期用具有cas9rna的cd163导向rna注射的ivf胚胎。cd163crisprnt-noneo胎儿系表示用先前修饰的胎儿成纤维细胞通过nt所产生的胚胎，所述胎儿成纤维细胞是已经通过转染而不使用选择性标记被修饰的neo抗性系。mu指的是在材料和方法的ivf选择中描述的在密苏里大学吸出和成熟的小母猪卵母细胞。art是指按照材料和方法的scnt部分所述购买和成熟的母猪卵母细胞。表9.cd1d的胚胎移植数据。*cd1dcrisprnt系表示用通过转染修饰的胎儿成纤维细胞系通过nt所产生的胚胎。crispr注射的胚胎是在1细胞期用具有cas9rna的cd1d导向rna注射的ivf胚胎。mu指的是在材料和方法的ivf选择中描述的在密苏里大学吸出和成熟的小母猪卵母细胞。art是指按照材料和方法的scnt部分所述购买和成熟的母猪卵母细胞。表10.cd163修饰的猪的基因型和翻译预测。一些猪含有双等位基因类型的修饰，但只有一个等位基因被描述，另一个被修饰的等位基因没有被pcr扩增。*ko，敲除**不包括在内，因为仔猪被安乐死。在这一栏中的seqidno是指对于显示与seqidno：47有关的indel的序列的seqidno。a插入的序列是tactact(seqidno：115)b插入的序列是ag。c插入的序列是单个腺嘌呤(a)残基。d插入的序列是tgtggagaattc(seqidno：116)。e插入的序列是agccagcgtgc(seqidno：117)。表11.cd1d修饰的猪的基因型和翻译预测*ko，敲除猪合子中的crispr/cas9系统的效率基于使用crispr/cas9系统在体细胞中cd163和cd1d的靶向破坏，将该方法应用于猪胚胎发生。首先，测试crispr/cas9系统在胚胎发育中的有效性。将靶向egfp的crispr/cas9系统引入到用来自egfp转基因的杂合子公猪精液的受精合子中。注射后，监测随后的表达egfp的胚胎。测试了各种浓度的crispr/cas9系统，并观察到所递送的crispr/cas9系统的细胞毒性(图4，a图片)；crispr/cas9注射后的胚胎发育比对照低。然而，所检测的crispr/cas9的所有浓度均有效地产生了egfp的修饰，因为在crispr/cas9注射组中没有发现具有egfp表达的胚胎(图4，b图片)；未注射的对照胚胎中67.7％是绿色的，表明egfp的表达。当单个胚囊进行基因分型时，有可能在crispr结合位点附近鉴定小突变(图4，c图片)。基于毒性和有效性，将10ng/μl的grna和cas9mrna用于以下实验。当将设计为靶向cd163的crispr/cas9组分引入到假定合子中时，观察到在随后的胚囊中基因的靶向修饰。当单个胚囊对cd163的突变进行基因分型时，在所有胚胎中发现特定的突变(100％ge效率)。更重要的是，虽然胚胎可以发现纯合子或双等位基因修饰(分别为8/18和3/18)(图5)，但也检测到嵌合(单等位基因修饰)基因型(4/18胚胎)。用2ng/μlcas9和10ng/μlcrispr注射池中的一些胚胎(8/10)，并且在突变发生效率方面没有发现差异。接着，基于体外结果，引入代表不同grna的两种crispr在胚胎发生期间破坏cd163或cd1d以诱导靶基因的特异性缺失。因此，通过引入两个导向物，可以成功诱导设计的cd163和cd1d缺失。将设计的缺失定义为去除所引入的两个引导物之间的基因组序列的缺失。在接受两种靶向cd163的crispr的胚胎中，除了一种胚胎外都导致了cd163的靶向修饰。另外，发现5/13个胚胎在cd163上具有设计的缺失(图6的a图片)，并且10/13胚胎似乎具有以纯合或双等位方式的cd163修饰。用两种crispr靶向cd1d也是有效的，因为所有的胚胎(23/23)都显示cd1d的修饰。然而，设计的cd1d缺失只能在两个胚胎(2/23)中发现(图6，b图片)。还发现了23个胚胎中拥有嵌合基因型的胚胎5个，但其余的胚胎具有cd1d的纯合或双等位基因修饰。最后，测试了同一胚胎中是否有多个基因可以被crispr/cas9系统靶向。为此目的，在用杂合egfp精液受精的合子中进行靶向cd163和egfp两者。当来自所注射胚胎的胚囊对cd163和egfp进行基因分型时，发现在胚胎发生期间成功地靶向cd163和egfp。测序结果表明，通过用cas9引入多个crispr可以靶向多个基因(图6，c图片)。由crispr/cas9-注射合子生产cd163和cd1d突变体基于以前体外研究的成功，生产了一些crispr/cas9-注射的合子，并且每个受体移植了46-55个胚囊(因为这个数目已经显示出生产来自体外来源胚胎的猪是有效的)。进行了四次胚胎移植，两次分别用于cd163和cd1d，并获得每次修饰的妊娠。生产了四头健康的小猪，其携带cd163上的修饰(表8)。来自受体母猪ido083的所有仔猪(窝67)显示cd163的纯合或双等位基因修饰(图7)。两头仔猪表现出由所递送的两种crispr设计的cd163缺失。所有的仔猪都是健康的。对于cd1d，一次怀孕还生产了四头仔猪(来自受体母猪识别号o165的窝166)：一头雌性和三头雄性(表9)。一头仔猪(166-1)确实携带了cd1d的嵌合突变，其中包括一个完全去除了含有起始密码子的外显子3的362bp缺失(图8)。一头仔猪含有6bp插入，其中一个等位基因的2bp错配，另一个等位基因的大缺失。两个额外的仔猪具有双等位基因单bp插入。没有检测到cd163的嵌合突变。讨论通过为农业和生物医学提供更多的ge猪，ge猪生产效率的提高可以产生广泛的影响。上述数据表明，通过使用crispr/cas9系统可以高效生产具有特定突变的ge猪。crispr/cas9系统成功应用于修饰体细胞和植入前胚胎中的基因。当将crispr/cas9系统引入到体细胞中时，其成功地通过nhej诱导靶基因的靶向破坏，但不增加hr靶向的能力。单个crispr/cas9在体细胞中的靶向效率是可变的，这表明该导向的设计可以影响靶向效率。具体而言，当将crispr5350和cas9引入到体细胞中时，不可能发现cd1d的靶向修饰。这表明设计多种grna并在生产猪前验证其效率可能是有益的。供体dna缺乏的hr定向修复的原因尚不清楚。筛选转染了crispr和供体dna的886个菌落(cd163和cd1d两者)后，只有一个菌落具有部分hr事件的证据。结果表明，crispr/cas9系统与引入的供体dna一起工作，以引起意外的靶基因的大缺失，但不增加这两种特定靶向载体的hr效率。然而，大缺失观察的具体机制尚不清楚。我们的小组以前的报道表明，供体dna可以有效地与zfn一起用于诱导hr定向修复。类似地，当供体dna与crispr/cas9系统一起使用时，观察到了靶向效率的增加，但未观察到完全的hr定向修复。在先前使用zfn的研究中，观察到通过hr和nhej的组合可以发生靶向修饰，因为在zfn诱导dsb之后发现引入的供体dna的部分重组。一种解释可能是hr和nhej途径不是独立的，但可以共同作用以完成归巢核酸内切酶诱导的dsb后的修复过程。尽管在这些实验结果中没有发现统计学差异，但更高浓度的crispr可能提高体细胞中的靶向效率。这可能表明crispr是crispr/cas9系统中的一个限制因素，但需要进一步验证。靶向细胞成功地用于通过scnt生产ge猪，表明crispr/cas9的应用不影响细胞被克隆的能力。一些仔猪由于健康问题而被安乐死；然而，这在scnt来源的仔猪中并不罕见。当通过合子注射将crispr/cas9系统引入到发育中的胚胎中时，几乎100％的胚胎和猪的靶向基因中含有indel，表明该技术在胚胎发生期间是非常有效的。在此研究期间观察到的效率超过了在胚胎发生期间利用归巢核酸内切酶的其它研究中报道的频率。达到胚囊期的胚胎数量减少表明在本研究中引入的crispr/cas9的浓度可能对胚胎有毒性。递送系统的进一步优化可以提高胚胎的存活能力，从而提高整个过程的效率。这里观察到的几乎100％的突变发生率与以前在crispr/cas9介导的敲除猪中的报道不同；然而，研究之间的效率差异可能是选择的导向和靶标的组合。在本研究中，较低浓度的crispr/cas9(每种10ng/μl)在发育中的胚胎中产生突变并产生ge猪是有效的。该浓度低于之前报道的猪合子浓度(125ng/μlcas9和12.5ng/μlcrispr)。crispr/cas9组分的较低浓度可能有利于发育胚胎，因为向发育中的胚胎中引入过量的核酸可能是有毒的。在体外测定中的crispr/cas9注射胚胎中发现了一些嵌合基因型；然而，通过该方法生产的只有一头仔猪具有嵌合基因型。潜在地，crispr/cas9组分的注射可能比其它归巢核酸内切酶的引入更有效，因为嵌合基因型被认为是在合子中使用crispr/cas9系统的主要障碍。使用本发明结果所证明的crispr/cas9系统的另一个益处在于，用crispr/cas9系统注射的ivf来源的合子生产的cd163敲除猪没有损失，而几天后由scnt产生的几头仔猪被安乐死。这表明，该技术不仅可以绕过scnt产生敲除猪的需要，而且还可以克服与scnt相关的常见健康问题。现在在合子中注射crispr/cas9mrna已经得到了优化，未来的实验也将包括供体dna的共注射。本研究表明，在合子中引入具有cas9的两个crispr可以在发育中的胚胎中诱导染色体缺失并生产具有预期缺失的猪，即两个crispr导向物之间的特异性缺失。这种设计的缺失可能是有益的，因为可以指定缺失的尺寸，而不是依赖nhej引起的随机事件。具体而言，如果存在由归巢核酸内切酶引起的三的倍数的核苷酸的插入/缺失，则由于不发生阅读框移位，所以该突变可能更容易导致次形态突变。然而，通过引入两个crispr，可能导致更大缺失，这将产生非功能蛋白的机会更大。有趣的是，cd1dcrispr被设计在基因组的更大区域而不是cd163中；cd163crispr10和131之间有124bp的距离，而cd1d的crispr4800和5350之间有550bp的距离。如研究中所示，crispr之间的较长距离在产生缺失方面不是非常有效。然而，由于本研究仅包括有限数量的观察，并且需要考虑单个crispr的功效，这里没有提到，所以需要进一步的研究来验证crispr之间的距离与引起预期缺失的可能性之间的关系。crispr/cas9系统在同一胚胎内同时靶向两个基因也是有效的，唯一额外的步骤是引入一个额外的具有crrna的crispr。这说明与其它归巢核酸内切酶相比，破坏多重基因的容易性。这些结果表明，这种技术可能被用于靶向可能具有代偿效应的基因簇或基因家族，因此除非所有的基因被破坏，否则难以确定单个基因的作用。结果表明，crispr/cas9技术可应用于通过提高体细胞中基因靶向效率和直接合子注射以产生ge猪。实施例2：在编码cd163蛋白的基因中具有修饰的染色体序列的猪中对prrsv的抗性增加猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)在过去的四分之一世纪中已经肆虐猪业。关于病毒进入模式的猜测包括siglec1和cd163。尽管敲除siglec1不影响病毒缺陷的反应，但在本实施例中显示cd163无效动物没有显示感染、肺病理学、病毒血症或抗体产生的临床迹象，这些都是prrsv感染的标志。不仅已经确认prrsv进入媒介，而且如果同样的动物被允许进入食物供应中，然后已经描述了防止重大经济损失和动物痛苦的策略。材料和方法基因分型基因分型基于dna测序和mrna测序。父本的基因型在一个等位基因中具有一个11bp缺失，即当翻译预测45个氨基酸到结构域5中时，导致在氨基酸64处提前终止密码子。在另一个等位基因中，在外显子7中存在2bp添加，在外显子7之前的内含子中存在377bp缺失，即当翻译预测结构域5的前49个氨基酸时，导致在氨基酸85处提前终止编码。母猪在一个等位基因中具有7bp添加，即当翻译预测结构域5的前48个氨基酸时，导致在氨基酸70处提前终止密码子。另一个等位基因未被表征(a)，因为通过pcr或长程6.3kbpcr的外显子7处没有条带。另外3头母猪为克隆体，在外显子7中具有129bp缺失，预计导致结构域5的43个氨基酸的缺失。其它等位基因未被表征(b)。在批准的ibc申请973中涵盖了prrsv在培养物中的生长和用于感染猪的病毒接种物的生产如批准的ibc方案973中所述的，生产一种类型的prrsv菌株(分离株nvsl97-7895(genbank#af3256912001-02-11))。该实验室分离株已用于实验研究中约20年(ladinig等)，2015)。如之前所述，第二个分离株用于第二个试验ks06-72109(prather等，2013)。用prrsv感染猪prrsv的标准化感染方案用于猪的感染。通过肌内(im)和鼻内(in)途径施用使三周龄的仔猪接种大约104tcid50的prrs病毒。每天监测猪，根据cmg兽医的建议治疗那些表现出疾病症状的猪。表现严重痛苦并有感染危险的猪被人道安乐死，并收集样本。工作人员和兽医对猪的遗传状况是盲性的，以消除评估或治疗方面的偏见。感染期间prrsv存在于体液中；因此，采集血液样品并储存在-80℃直至测量以确定每头猪的病毒血症的量或程度。在实验结束时，将猪称重并人道安乐死，并将所收集的组织固定在10％福尔马林缓冲液中，包埋在石蜡中，并由委员会认证的病理学家进行组织病理学处理。缺陷猪的表型评分每天对猪的表型如下进行盲性评分：猪的态度如何？态度评分：0：bar，1：qar，2：稍微压抑，3：压抑，4：垂死。猪的身体状况如何？身体状况评分：1：消瘦，2：瘦，3：理想，4：胖，5：超重/肥胖。猪的直肠温度如何？正常体温101.6-103.6°f(考虑发烧≥104°f)。有没有跛脚(等级)？什么肢体？评估四肢关节肿胀和蹄病(检查蹄的底部和侧面)。跛脚评分：1：不跛脚，2：走路稍微不平坦，有些关节僵硬但没有跛脚，3：轻度跛脚，走路时轻微跛行，4：中度跛脚，明显跛行，包括脚趾接触跛足，5：严重跛脚，对肢体无负担，需要鼓励站立/行走。有没有呼吸困难(等级)？有没有张开嘴巴呼吸？是否有鼻腔溢液(溢液颜色，溢液量：轻度/中度/重度)？你注意到动物咳嗽吗？有没有眼部溢液？呼吸评分：0：正常，1：当受压时(处理时)轻度呼吸困难和/或呼吸急促，2：当休息时轻度呼吸困难和/或呼吸急促，3：当受压时(处理时)中度呼吸困难和/或呼吸急促，4：当休息时中度呼吸困难和/或呼吸急促，5：当受压时(处理时)严重呼吸困难和/或呼吸急促，6：当休息时严重呼吸困难和/或呼吸急促。是否有腹泻(级别)或呕吐的证据？有没有血或粘液？腹泻评分：0：无粪便，1：正常粪便，2：软便，但成形(软性酸奶稠度，产生牛肉馅饼状)，3：具有颗粒状粪便物质的棕色/褐色液体腹泻，4：没有颗粒状粪便物质的棕色/褐色液体腹泻，5：似乎与水相似的液体腹泻。该评分系统由ksu的meganniederwerder博士开发，并基于以下出版物(halbur等1995；merck；miao等2009；patience和thacker,1989；winckler和willen,2001)。使用基于基因型作为处理的分离的anova来分析评分和温度。测量prrsv病毒血症通过两种方法确定病毒血症。通过在96孔板中将连续1：10稀释的血清加入到合流的marc-145细胞中进行病毒滴定。如先前所述，将血清在补充有8％胎牛血清，青霉素，链霉素和两性霉素b的eagle最低必需培养基中稀释(prather等，2013)。温育4天后使用显微镜检查细胞是否存在细胞病变效应。将显示细胞病变效应的最高稀释度评分为滴定终点。通过使用lifetechnologiesmagmax-96病毒rna分离试剂盒从血清中分离总rna以用于测量病毒核酸。通过使用来自tetracore的ez-prrsvmpx4.0试剂盒在cfx-96实时pcr系统(bio-rad)上根据制造商的说明书进行逆转录聚合酶链式反应。每个反应(25μl)含有来自5.8μl血清的rna。通过制备试剂盒(tetracore)中提供的rna对照的系列稀释物构建标准曲线。报道每个pcr模板的数量。pam细胞的siglec1和cd163染色通过切除肺并用约100ml冷磷酸盐缓冲盐水填充猪肺泡巨噬细胞(pam)而收集猪肺泡巨噬细胞。回收磷酸盐缓冲盐水洗涤后，将细胞沉淀并重悬浮于5ml冷磷酸盐缓冲盐水中并储存在冰上。将约107个pam在5ml的含有5％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水中稀释的各种抗体(抗猪cd169(克隆3b11/11；abdserotec)；抗猪cd163(克隆2a10/11；abdserotec))中在冰上温育30分钟。将细胞洗涤并重悬浮于与染色缓冲液中稀释的山羊抗小鼠igg(lifetechnologies)共轭的异硫氰酸荧光素(fitc)的1/100稀释液中，并在冰上温育30分钟。使用facscalibur流式细胞仪和cellquest软件(bectondickinson)分析至少104个细胞。prrsv特异性ig的测量为了测量prrsv特异性ig重组prrsvn蛋白在细菌中的表达(trible等，2012)，以及通过使用试剂盒(luminexcorporation)与磁性luminex珠的共轭。用含有10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水稀释n蛋白偶联的珠子至2500个珠子/50μl，并置于96孔圆底聚苯乙烯板的孔中。将血清在含有10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水中以1：400稀释，并在两个孔中加入50μl，在室温下以温和振荡温育30分钟。接着，用含有10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水洗涤板(3x)，并加入50μl在含有10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水中稀释至2μg/ml的生物素-sp共轭的亲和纯化的山羊抗猪二级抗体(igg，jacksonimmunoresearch)或生物素标记的亲和纯化的山羊抗-猪igm(kpl)。温育30分钟后洗涤板(3x)，然后加入50μl链霉亲和素共轭藻红蛋白(2μg/ml(moss，inc.)在含有10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水中)。洗涤板30分钟后，将微球重悬浮于100μl含有10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水中，通过使用magpix和luminexxponent4.2软件进行分析。报道平均荧光强度(mfi)。结果如上文实施例1中所述的，通过使用crispr/cas9技术产生cd163中的突变。从合子注射和体细胞核转移产生若干创始动物。几个始祖动物由合子注射和体细胞核移植生产。这些始祖中的一些产生了后代以供研究。单一始祖雄性与两种基因型的雌性交配。雄性始祖(67-1)拥有一个等位基因的外显子7中的11bp缺失和另一个等位基因的外显子7中的2bp添加(以及在之前的内含子中的377bp缺失)，并被预测为无效动物(cd163-/-)。一个雌性始祖(65-1)具有一个等位基因和未表征的相应等位基因的外显子7中的7bp添加，因此，预测对于敲除(cd163-/？)是杂合的。第二个雌性始祖基因型(3个克隆的动物)含有尚未表征的等位基因和外显子7中具有129bp缺失的等位基因。预测该缺失会导致结构域5中43个氨基酸的缺失。这些动物之间的交配导致所有仔猪遗传来自公猪的无效等位基因和43个氨基酸缺失或来自母猪的一个未表征的等位基因。除了作为病毒缺陷的阳性对照的野生型仔猪之外，这产生了另外4种基因型(表8)。表12.测试对prrsv缺陷(nvsl和ks06菌株)抗性的基因型在断奶时，将基因编辑的仔猪和野生型年龄匹配的仔猪运送到堪萨斯州立大学(kansasstateuniversity)以进行prrsv缺陷。如前所述进行prrsv缺陷(prather等，2013)。3周龄的仔猪被带入缺陷设施，并保持为一个单独的组。所有实验都是在机构动物使用和生物安全委员会批准后开始的。驯化后，用在marc-145细胞上繁殖(kim等，1993)的prrsv分离株，nvsl97-7895(ladinig等，2015)对猪进行缺陷。用约105tcid50的病毒对猪进行缺陷。一半的接种物肌内递送，而剩余的接种物鼻内递送。所有受感染的猪都保持为一个单独的组，这使得来自受感染的同胞的病毒不断暴露。在感染后35天和终止35天的不同天中收集血液样品。将猪尸体解剖并将组织固定在10％福尔马林缓冲液中，包埋在石蜡中并进行组织病理学处理。感染过程中记录的与prrsv相关的临床症状包括呼吸窘迫，食欲不振，嗜睡和发热。研究期间临床症状的结果总结在图9中。正如预期的，野生型野生型(cd163+/+)猪显示prrsv感染的早期症状，其在第5天和第14天之间达到峰值并且在研究的其余部分的组中持续。发情猪的百分比在约第10天达到峰值。相反地，无效(cd163-/-)仔猪在整个研究期间没有显示出临床症状的证据。急性prrsv感染期间的呼吸症状反映在肺中显著的组织病理学变化(表9)。野生型猪的感染显示与prrs一致的组织病理学，包括伴有单核细胞浸润的间质水肿(图10)。相反地，没有证据表明无效(cd163-/-)猪的肺部变化。各种基因型的样本量很小；然而，野生型的平均分为3.85(n＝7)，未鉴定的a为1.75(n＝4)，未鉴定的b为1.33(n＝3)，无效(cd163-/-)为0(n＝3)。表13.显微评估肺临床症状峰值与血液中prrsv的水平相关。通过从血清中分离总rna并随后使用商购逆转录酶实时prrsvpcr测试(tetracore，rockville，md)扩增prrsvrna进行病毒核酸的测量。通过制备在rt-pcr试剂盒中提供的prrsvrna对照的系列稀释物来产生标准曲线，并将结果标准化为每50μlpcr反应的数量模板。prrsv分离株在野生型cd163+/+猪中遵循prrsv病毒血症的过程(图11)。在第4天病毒血症明显，在第11天达到峰值，直到研究结束。相反地，在研究期间的任何时间点，在cd163-/-猪中未检测到病毒rna。与病毒血症一致，由无效和未表征的等位基因猪的抗体生产可由第14天检测到，并增加到第28天。在无效动物中没有抗体产生(图12)。总之，这些数据显示野生型猪支持prrsv复制，产生与prrs一致的临床症状。相反地，敲除的猪没有产生病毒血症，也没有临床症状，即使猪被接种并不断暴露于受感染的同胞中。在研究结束时，如先前所述，通过肺灌洗去除猪肺泡巨噬细胞，并对siglec1(cd169，克隆3b11/11)和cd163(克隆2a10/11)的表面表达进行染色(prather等，2013)。在cd163+/+野生型动物上检测到相对高水平的cd163表达(图13)。相反地，cd163-/-猪仅显示出抗cd163染色的背景水平，因此证实了敲除表型。另一种巨噬细胞标志物cd169的表达水平对于野生型和敲除的猪是相似的(图14)。其它巨噬细胞表面标志物(包括mhcii和cd172)对于两种基因型都是相同的(数据未示出)。虽然样本量较小，但与其它三种基因型猪(未表征a为1.32kg±0.17，n＝4；未表征b为1.20kg±0.16，n＝3；无效为1.21kg±0.16，n＝3)相比，野生型猪在实验过程中倾向于较少的体重增加(平均每日增加0.81kg±0.33，n＝7)。在第二个试验中，除了使用ks06-72109接种仔猪外，如上所述，6个野生型、6个δ43氨基酸和6个具有未表征的等位基因(b)的猪被缺陷。与nvsl数据类似，野生型和未表征b的仔猪发生病毒血症。然而，在δ43氨基酸猪中，ks06没有导致病毒血症(图15；表7)。影响和结论猪业相关的最有临床意义的疾病是prrs。尽管疫苗接种计划已经成功地预防或改善了大多数猪病原体，但是prrsv已被证明是更大的挑战。这里cd163被鉴定为这种病毒株的进入媒介。始祖公猪是通过将crispr/cas9注射到合子(whitworth等，2014)中而产生的，因此没有转基因。此外，母猪的一个等位基因(也是通过使用crispr/cas9产生的)不含转基因。因此，仔猪#40在一个等位基因中携带7bp添加，在另一个等位基因中携带11bp缺失，但没有转基因。考虑到猪基因组大约28亿bp，cd163的这些病毒抗性等位基因表示较小的基因组编辑(groenen等，2012)。如果将类似产生的动物引入到食物供应中，则可以防止重大的经济损失。实施例3：增加对具有用人cd163样同源性srcr结构域8替换的cd163srcr结构域5的猪的基因型1猪生殖和prrs病毒的抗性cd163被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的主要受体。在这项研究中，猪被遗传修饰(gm)以拥有以下基因型中的一种：cd163的完全敲除(ko)，cd163清道夫受体半胱氨酸富集(srcr)结构域5内的缺失，或用编码人cd163样(hcd163l1)srcr8结构域同系物的合成的外显子对srcr结构域5的替换(结构域交换)。猪肺泡巨噬细胞(pam)的免疫分型表明具有ko或srcr结构域5缺失的猪不表达cd163，并且pam不支持prrsv感染。来自具有hcd163l1结构域8同系物的猪的pam表达cd163并且支持2型而不是1型基因型病毒的复制。具有代表性的1型和2型病毒的cd163修饰的猪的感染产生相似的结果。尽管1型和2型病毒在几个水平被认为在遗传和表型上相似，包括cd163作为受体的要求，但是结果表明在cd163分子的识别中prrsv基因型之间有明显的差异。材料和方法猪cd163基因的基因组修饰涉及动物和病毒的实验按照“动物科学学会联合会农业动物研究和教学的关爱和使用指南(federationofanimalsciencesocietiesguideforthecareanduseofagriculturalanimalsinresearchandteaching)”、美国农业部“动物福利法”和“动物福利条例”进行，并且由堪萨斯州大学和密苏里大学机构动物关爱和使用委员会和机构生物安全委员会批准。在本研究中使用的cd163的突变是使用如上文实施例中所述的crispr/cas9技术产生的。这些突变示于图17中。图17所示的图表基因组区域覆盖了猪cd163基因从内含子6至内含子8的序列。图17中所示的内含子和外显子未按比例绘制。预测的蛋白产物在每个基因组结构的右侧说明。通过pam上表面cd163的水平测量的相对巨噬细胞表达显示在图17的最右侧。如图17所示，黑色区域表示内含子；白色区域表示外显子；阴影区域表示hcd163l1外显子11模拟物，猪外显子7的同系物；而灰色区域表示与pgkneo构建体合成的内含子。图17中所示的cd163基因构建体ko-d7(11)在从核苷酸3137至核苷酸3147的外显子7中具有11个碱基对缺失。cd163基因构建体ko-i7(2)在核苷酸3149和3150之间的外显子7中具有2个碱基对插入以及在从核苷酸2573至核苷酸2949的外显子7上游的内含子中具有377个碱基对缺失。预测这些编辑会引起阅读框移位突变和提前终止密码子，导致仅部分srcr5的翻译和ko表型。另外三个突变在外显子7中产生缺失。首先，d7(129)在从核苷酸3044至核苷酸3172的外显子7中具有129个碱基对缺失。该d7(129)构建体在从核苷酸488到核苷酸2417的外显子6中也具有缺失，其中，缺失的序列被12bp插入替换。另外两个缺失构建体d7(1467)和d7(1280)具有如图17所示的外显子7和外显子8的完全缺失。d7(1467)具有从核苷酸2431至核苷酸3897的1467个碱基对缺失，并且d7(1280)具有从核苷酸2818至核苷酸4097的1280个碱基对缺失。对于这些缺失构建体，其它cd163外显子保持完整。使用缺失外显子7的靶向事件产生图17中所示的最后一个构建体hl11m，并用编码人cd163样1蛋白的srcr8同系物(hcd163l1结构域8由hcd163l1外显子11编码)的合成的外显子替换。srcr8肽序列通过在猪外显子7序列中进行33个核苷酸改变而产生。新霉素盒被包括在合成的外显子中以便筛选修饰。seqidno：118提供了对应于参考序列seqidno：47中相同区域的区域中的hl11m构建体的核苷酸序列。图18提供了猪cd163蛋白和基因的图。图18的a图片显示了cd163蛋白scrc(椭圆形)和pst(正方形)结构域以及相应的基因外显子。图18的b图片显示了猪cd163srcr5(seqidno：120)和人cd163srcr8同系物(seqidno：121)的肽序列比较。该图基于基因库(genbank)登录号aj311716(猪cd163)和gq397482(hcd163-l1)。病毒本实施例中使用的病毒组列于表14中。在marc-145细胞上繁殖和滴定分离株(kim等，1993)。为了滴定，在补充有7％fbs，pen-strep(分别为80单位/ml和80μg/ml)，3μg/mlfixizone(两性霉素b)和25mmhepes的mem中以1：10连续稀释每种病毒。将稀释的样品一式四份加入96孔板中的汇合的marc-145细胞中至每孔终体积为200μl，并在37℃、5％co2下温育4天。滴定终点被确定为具有细胞病变效应(cpe)的最后一个孔。使用前述方法计算50％组织培养感染剂量(tcid50/ml)(reed和muench1938)。表14.prrsv分离株。病毒基因型分类年份基因库登陆号nvsl97-789521997ay545985ks06-7210922006km252867p12921995af494042vr233221992ay150564co9022010km035799az2522010km035800mlv-resprrs2na*af066183ks62-0627422006km035798ks483(sd23983)21992jx258843co8422010km035802sd13-1512013na雷垒斯塔德11991m9626203-105912003na03-106012003nasd01-0812001dq4893114353pz12003na*na，不可用肺泡巨噬细胞的感染如先前所述进行巨噬细胞的制备和感染(gaudreault等，2009和patton等，2008)。从安乐死的猪中取出肺并通过将100ml冷磷酸盐缓冲盐水(pbs)倒入气管中进行灌洗。将气管夹紧，并轻轻按摩肺。将肺泡内容物倒入50ml离心管中并储存在冰上。猪肺泡巨噬细胞(pam)通过在4℃以1200×g离心10分钟而沉降。将沉淀物重悬浮并在冷无菌pbs中洗涤一次。将细胞沉淀重悬浮于含有45％rpmi1640，45％胎牛血清(fbs)和10％二甲基亚砜(dmso)的冷冻培养基中并储存在液氮中直至使用。将冷冻的细胞在冰上解冻，计数并在培养基(补充有10％fbs，penstrep和fungizone；rpmi-fbs的rpmi1640)中调整至5×105细胞/ml。将每孔约103个pam加入到96孔板中，并在37℃、5％co2中温育过夜。轻轻洗涤细胞以去除非贴壁细胞。将系列1：10稀释的病毒添加到一式三份的孔中。温育过夜后，用pbs洗涤细胞并用80％丙酮固定10分钟。干燥后，将孔用含有1％鱼明胶(pbs-fg；sigmaaldrich)的pbs以1：1000稀释的prrsvn-蛋白特异性sdow-17mab(ruraltechnologiesinc.)染色。在37℃温育30分钟后，将细胞用pbs洗涤，并用在pbs-fg中以1：200稀释的alexafluor488-标记的抗-小鼠igg(thermofisherscientific)染色。将板在黑暗中在37℃温育30分钟，用pbs洗涤，并在荧光显微镜下观察。根据前述方法计算50％组织培养感染剂量(tcid50)/ml(reed和muench1938)。测量pam上的cd169和cd163表面表达如先前所述进行cd169和cd163表面表达的染色(prather等，2013)。将大约1×106个pam置于12mm×75mm聚苯乙烯流式细胞术(facs)管中，并在室温下在1ml含有10％正常小鼠血清的pbs中温育15分钟以阻断fc受体。通过离心使细胞沉淀，并重悬浮于5μlfitc共轭的小鼠抗猪cd169mab(克隆3b11/11；abdserotec)和5μlpe共轭的小鼠抗猪cd163mab(克隆：2a10/11，abdserotec)中。温育30分钟后，将细胞用含有1％牛血清白蛋白(bsa级分v；hyclone)的pbs洗涤两次，立即用具有fcsexpress5软件(denovosoftware)的bdlsrfortessa流式细胞仪(bdbiosciences)分析。每个样品至少分析10000个细胞。prrs病毒血症的测量根据制造商的说明书，使用ambion的magmax96病毒分离试剂盒(appliedbiosystems)从50μl血清中分离rna。使用根据制造商的说明书进行的ez-prrsvmpx4.0实时rt-pcr靶特异性试剂(tetracore)对prrsvrna进行定量。每个板含有设计用于rt-pcr试剂的tetracore定量标准和对照组。使用推荐的循环参数以96孔格式在cfx96touch实时pcr检测系统(bio-rad)上进行pcr。将pcr测定结果报道为每50μl反应体积的log10prrsvrna拷贝数，其接近每毫升血清的拷贝数。病毒血症随时间推移的曲线下面积(auc)使用用于windows的graphpadprism版本6.00计算。prrsv抗体的测量如先前所述进行用于检测针对prrsv核衣壳(n)蛋白的抗体的微球荧光免疫测定法(fmia)(stephenson等，2015)。根据制造商的说明书，将重组prrsvn蛋白偶联到羧化luminexmagplex聚苯乙烯微球珠上。对于fmia，将悬浮于具有10％山羊血清(pbs-gs)的50μlpbs中的大约2500个抗原包被的珠子置于96孔聚苯乙烯圆底板的每个孔中。将血清在pbs-gs中以1：400稀释，每孔加入50μl。将该板包裹在箔中并在室温下温和振荡30分钟。将板放置在磁体上，并用190μl的pbs-gs洗涤珠3次。为了检测igg，将50μl生物素-sp共轭的亲和纯化的山羊抗猪二级抗体(igg，jacksonimmunoresearch)在pbs-gs中稀释至2μg/ml，并向各孔中加入100μl。将板在室温下温育30分钟并洗涤三次，然后加入50μl链霉亲和素共轭藻红蛋白(pbs-gs中2μg/ml；sape)。30分钟后，洗涤微球，重悬浮于100μlpbs-gs中，并使用magpix仪器(luminex)和luminexxponent4.2软件分析。平均荧光强度(mfi)是在最少100个微球珠上计算的。触珠蛋白(hp)的测定使用猪特异性hpelisa试剂盒(genwaybiotechinc.)测量血清中hp的量，并根据制造商的说明书进行步骤操作。将血清样品在1x稀释溶液中以1：10000稀释并在预先包被的抗猪hp96孔elisa板上一式两份移液，在室温下温育15分钟，然后洗涤三次。向每个孔中加入抗hp-hrp共轭物，并在室温下黑暗中温育15分钟。洗涤板，将100μl色原体底物溶液加入到每个孔中。在黑暗中温育10分钟后，将100μl终止液加入到每个孔中。在fluostaromega过滤器的酶标仪(bmglabtech)上在450nm处读取板。结果来自cd163基因修饰的猪的pam的表型性质使用肺灌洗材料中的细胞的前向和侧向散射特性来门控单核细胞亚群。在图19中显示了对于图17中显示的不同基因修饰的代表性cd169和cd163染色结果。在图19的a图片中显示的代表性实例中，来自wt猪的大于91％的pam对于cd169和cd163都是阳性的。本研究中使用的12头wt猪的结果显示平均85±8％的双阳性细胞。如图19的b图片所示，来自cd163ko猪的pam显示了没有cd163的证据，但保留了正常的cd169表面水平。尽管预测来自d7(1467)和d7(1280)缺失基因型的cd163多肽应该产生锚定到pam表面的修饰的cd163多肽，但是免疫染色结果显示没有cd163的表面表达(参见图19，d图片)。由于mab2a10识别位于前三个srcr结构域中的表位，因此不存在检测不是免疫反应性表位缺失的结果。预测d7(129)基因型在srcr5中具有43个氨基酸缺失(参见图17)。在图19的c图片所示的实例中，只有2.4％的细胞落在双阳性象限中。本研究中使用的9头d7(129)猪的pam分析显示，双阳性细胞的百分比范围从0％到3.6％(平均值＝0.9％)。cd169的表面表达仍然与wtpam类似。为了本研究的目的，具有ko，d7(1467)，d7(1280)和d7(129)基因型的猪均被归类为具有cd163无效表型。含有hcd163l1结构域8肽序列hl11m的cd163修饰显示在pam上的cd163+和cd169+的双重表达(图19，e图片)。然而，在本研究中分析的所有hl11m猪中，与wtpam相比，cd163的表面表达显著降低。cd163的水平落在连续表达上，范围从没有检测到的cd163到具有中等水平的cd163的猪。在图19的e图片所示的实例中，大约60％的细胞处于双阳性象限，而仅40％的细胞对cd169染色。从总共24头hl11m猪的pam分析显示，仅38+/-12％的pam细胞对cd169是阳性的，54+/-14％的pam细胞是双阳性的(cd169+cd163+)。在wt和cd163修饰的猪中循环触珠蛋白水平作为清除分子，cd163负责从血液中去除hbhp复合物(fabriek等，2005；kristiansen等，2001和madsen等，2004)。血清中hp的水平为确定表达cd163的巨噬细胞的整体功能特性提供了便利的方法。在感染prrsv之前三至四周龄测量来自wt，hl11m和cd163无效的猪的血清中的hp水平。图20中呈现的结果显示来自wt猪的血清具有最低量的hb(平均值a450＝23+/-0.18，n＝10)。每组的平均值和标准差分别为wt，0.23+/–0.18，n＝10；hl11m，1.63+/–0.8，n＝11；对于无效组，2.06+/-0.57，n＝9。无效组由不表达cd163的基因型(cd163无效表型猪)组成。hp测量在单个elisa板上进行。具有相同字母的组没有显著差异(p>0.05，具有dunnett后验的kruskal-wallis单因素方差分析)。wt猪的平均a450值与hl11m和cd163无效猪的平均a450值显著不同(p<0.05)。尽管hl11m组的平均a450值低于cd163无效组的平均a450值(a450＝1.6+/-0.8与2.1+/-0.6)，但差异无统计学意义。由于hbhp和cd163之间的相互作用是通过srcr3发生的(madsen等，2004)，与wt猪相比，hl11m猪的循环hp增加可能不是cd163对hb/hp亲和力降低的结果，而是cd163+巨噬细胞数量减少以及剩余的巨噬细胞上的cd163表达降低的结果(参见图19的e图片)。1型和2型病毒的pam感染通过用一组6种1型和9种2型prrsv分离株体外感染pam细胞初步评价了cd163修饰的猪对prrsv的允许度(参见表14的病毒列表)。图中的病毒表示不同的基因型，以及核苷酸和肽序列，发病机理和分离年份的差异。表15中呈现的数据显示了使用来自三头猪的pam对每个cd163基因型组进行实验所形成的结果。列出的病毒对应于表14中列出的prrsv分离株。结果显示为感染的pam百分比的平均值+/-标准偏差。cd163无效pam来自表达d7(129)等位基因的猪(分别参见图17和19中的cd163基因构建体以及在pam上的cd163表达)。表15.用不同的prrsv分离株感染来自野生型和转基因猪的pam如所预期的，wtpam被所有病毒感染。相反地，cd163无效表型猪对所有病毒的感染都是阴性的。在来自hl11m猪的pam反应中观察到显著差异。1型病毒均不能感染hl11mpam；然而，2型组中的所有病毒感染hl11mpam，尽管与wtpam相比百分比低得多。还通过比较相同2型病毒的wt和hl11mpam之间的病毒滴定终点来评估允许度。显示两个wt和两个hl11m猪的结果(图21)。log10tcid50值是基于用相同病毒样品感染巨噬细胞培养物来计算的。感染结果表示来自每种基因型的两种不同的猪。用于感染的病毒列于表14中。来自hl11m猪的pam的log10tcid50值比感染相同病毒的wtpam低1-3个对数值。唯一的例外是用修饰活病毒疫苗株感染的。结果表明，来自hl11m猪的pam对2型病毒感染具有降低的易感性或允许度。用1型和2型病毒感染cd163修饰的猪用代表性的1型(sd13-15)(图22，a图片，左图)和2型(nvsl97-7895)(图22，a图片，右图)病毒感染wt(圆圈)，hl11m(正方形)和无效cd163(三角形)猪。无效表型猪来源于ko和d(1567)等位基因(参见图17)。将来自用相同病毒接种的三种基因型的猪在一个猪圈中共混，这允许将cd163修饰的猪连续暴露于由wt猪圈同胞遮蔽的病毒。感染代表性1型病毒的猪的数目是：wt(n＝4)，hl11m(n＝5)和无效(n＝3)和2型病毒：wt(n＝4)，hl11m(n＝4)和无效(n＝3)。如图22所示，感染1型或2型病毒的cd163无效猪在所有时间点对病毒血症都是阴性的，并且没有血清转化。正如预期的，wt猪生产性地感染，在两种病毒感染后7天，每50μlpcr反应具有接近106个模板的平均病毒血症水平。到14天，所有的wt猪都有血清转化(参见图22，b图片)。与pam感染结果一致(表15)，感染1型病毒的5头hl11m猪没有显示病毒血症或prrsv抗体的证据。所有感染2型分离株nvsl的hl11m猪均支持感染和血清转化(图22，b图片)。hl11m猪的允许度降低的出现尚不清楚。四头hl11m猪中的三头的平均病毒血症与wt猪相似。然而，对于一头hl11m猪，#101(图22中的空心方块，a图片右图)，与hl11m基因型组中的其它猪相比，病毒血症大大减少。对猪#101病毒血症减少3～4个对数的解释还不清楚，但表明一些hl11m猪可能不太容许prrsv，这是支持体外pam感染结果的观察结果(表15)。由于所有的猪均接种相同量的病毒，并仍然与wt猪共混，猪#101中较低的病毒血症不是接受较低量病毒或较少接触病毒的结果。巨噬细胞的流式细胞仪显示猪#101的cd163表达与其它hl11m猪相当(数据未示出)。在外显子11模拟序列中的序列没有差异。另外的病毒感染试验使用两种病毒nvsl97-7895和ks06-72109进行。结果显示在图23中。感染后跟踪猪35天，并且在感染后3，7，11，14，21，28和35天采集作为病毒血症测量曲线下面积(auc)报道的数据。如图23所示，对于nvsl，用nvsl感染的7头wt猪的平均auc值为168+/-8，而对于7头hl11m猪为165+/-15。对于ks06，六头wt和六头hl11m猪的平均auc值分别为156+/-9和163+/-13。对于两种病毒，wt和hl11m猪之间没有统计学显著差异(p>0.05)。当完全采取时，结果显示，hl11m猪不能支持1型prrsv感染，但保留了对2型病毒感染的允许度。尽管来自体外感染2型分离株的hl11m猪的pam对prrsv允许度降低，但这种差异没有转化给猪。对于图23所示的结果，通过计算35天感染期间每只猪的曲线下面积(auc)来确定病毒载量。使用log10pcr病毒血症测量在感染后0，4，7，10，14，21，28和35天进行auc计算。水平线显示平均值和标准偏差。关键字：wt＝野生型猪，hl11＝hl11m基因型猪；无效(null)＝cd163无效基因型。讨论cd163是巨噬细胞表面蛋白，对于从血液中清除过量的hb和响应组织损伤而调节炎症是重要的。它也起着病毒受体的作用。cd163参与促炎和抗炎反应(vangorp等，2010)。将cd163阳性巨噬细胞置于巨噬细胞的交替活化的m2组内，其通常被描述为高度吞噬和抗炎的。m2巨噬细胞参与机械组织损伤或感染后的清理和修复(stein等，1992)。在抗炎能力中，cd163表达被抗炎蛋白例如il-10上调(sulahian等，2002)。在炎症期间，cd163通过从血液中去除循环血红素以减少氧化作用而减少炎症。血红素降解产物例如胆绿素、胆红素和一氧化碳是有效的抗炎分子(soares和bach，2009；以及jeney等，2002)。在促炎症能力中，cd163通过抗cd163抗体或细菌在巨噬细胞表面上的交联导致促炎性细胞因子(包括il-6，gm-csf，tnfα和il-1β)的局部释放(vandenheuvel等，1999以及fabriek等，2009)。缺乏cd163的gm猪不能支持2型prrsv分离株的复制(whitworth等，2016)。在这项研究中，体外感染试验证明了cd163无效表型巨噬细胞对1型和2型prrsv分离株组的广泛抗性，进一步扩大了对潜在包括所有prrsv分离株的抗性(表15)。在体内证实了cd163无效表型巨噬细胞对1型和2型病毒的抗性(图22和图23)。基于这些结果，可以排除之前在文献(zhang和yoo，2015)中描述的其它prrsv受体的贡献。例如，shanmukhappa等(2007)显示用cd151质粒转染的非允许性bhk细胞获得支持prrsv复制的能力，并且显示与多克隆抗cd151抗体温育显著减少marc-145细胞的感染。此外，最初开发用于繁殖猪流感病毒的猿细胞系sjpl先前显示支持prrsv复制(provost等，2012)。sjpl细胞系的重要特性包括存在cd151以及不存在唾液酸粘附素和cd163。综合起来，这些数据提供了单独存在cd151足以支持prrsv复制的令人信服的证据。研究的结果显示具有cd163无效表型的巨噬细胞和猪中不存在prrsv感染，表明cd151作为prrsv的替代受体不具有生物学相关性。病毒蛋白gp2a和gp4(在prrsv表面上形成gp2a、gp3、gp4异源三聚复合物的部分)可以在gp2和gp4质粒转染的细胞的拉下测定中与cd163共沉淀(das等，2009)。据推测，gp2和gp4与一个或多个cd163srcr域形成相互作用。在体外感染测定中，包括将含有猪srcr5和hcd163-l1srcr8同系物之间的结构域交换的猪cd163cdna骨架进一步通过1型病毒利用的区域定位于srcr5(vangorp等，2010)。有趣的是，推测gp2/gp4和cd163之间的稳定相互作用是通过srcr5发生的。另外的病毒糖蛋白(例如gp3和gp5)可以进一步稳定病毒-受体复合物或可以作为共受体分子起作用。在本研究中通过感染具有hl11m等位基因的巨噬细胞和猪来研究srcr5的需要，其通过在猪外显子7中进行33bp置换来重新创建cd163l1srcr8结构域交换。hl11m等位基因也包括用于选择对于遗传修饰为阳性的细胞的新霉素盒(图17)。hl11m猪在pam上表达cd163，尽管与wtpam相比水平降低(图19，比较a和e图片)。表达降低可能是由于存在位于外显子11模拟物和随后的内含子之间的新霉素盒。hl11m猪不允许感染1型病毒，证实了srcr5的重要性。然而，hl11m巨噬细胞和hl11m猪确实支持2型病毒的感染。基于病毒滴定和百分比感染结果，与wt巨噬细胞相比，来自hl11m猪的pam表现出病毒允许度的整体降低(表15和图17)。允许度的降低可能是由于hl11m巨噬细胞上cd163的水平降低，以及病毒对修饰的cd163蛋白的亲和力降低所致。假设2型病毒具有srcr5的需要，并且l1srcr8可以作为合适的置换基，较低的亲和力可以由人srcr8和猪srcr5之间的肽序列的差异解释(参见图18，b图片)。然而，pam的允许度降低并没有转化给猪。当与wt猪相比时，hl11m猪的平均病毒血症没有显著差异(图23)。除了pam之外，血管内、隔膜和淋巴组织巨噬细胞的prrsv感染也会导致病毒血症(lawson等，1997以及morgan等，2014)。这些及其它cd163阳性细胞群在维持hl11m猪总体病毒载量方面的潜在贡献值得进一步研究。即使具有srcr结构域缺失的cd163质粒在hek细胞中稳定表达(vangorp等，2010)，但是d7(1467)和d7(1280)中外显子7和8的缺失导致可检测的cd163表面表达的缺乏(图19，d图片)。由于用于流式细胞计量术的2a10mab识别三个n-末端srcr结构域(vangorp等，2010)，可能还有第7和第8个结构域(sanchez等，1999)，所以没有检测到是由于突变蛋白中2a10表位的去除。虽然在某些d7(129)猪的pam上可检测到少量的cd163表达(参见图19，c图片)，但表达的蛋白质量不足以支持pam或猪的prrsv感染。在外显子7和8缺失突变体中缺乏cd163表达还不完全清楚，但可能是mrna和/或蛋白降解的结果。在2003年，cd163被鉴定为非洲猪瘟病毒的受体(asfv；sánchez-torres等，2003)。这个结论是基于观察到感染的巨噬细胞具有成熟的cd163阳性表型，并且抗cd163抗体(如2a10)在体外阻断巨噬细胞的asfv感染。cd163无效猪是否对asfv感染有抗性还有待确定。包括对prrsv受体的修饰的细胞培养模型已经提供了prrsv进入、复制和发病机制的有价值见解。该研究的一个独特方面是使用受体修饰的猪进行体内平行实验。该研究在全球养猪业面临的最严重疾病之一开发预防性治疗方法的可行性上具有重要影响。本文公开的实施例是以举例的方式提供的，并不意图限制本发明的范围。鉴于以上内容，将会看到，实现了本发明的几个目的，并获得了其它有利的结果。由于在不脱离本发明的范围的情况下可以对上述产品和方法进行各种改变，所以以上描述中包含的以及附图中所示的所有内容应被解释为说明性的而没有限制意义。参考文献allender,etal.,1999.northamericanandeuropeanporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusesdifferinnon-structuralproteincodingregions.j.gen.virol.80:307–315.bauerbk,etal.,argininesupplementationinvitroincreasesporcineembryodevelopmentandaffectsmrnatranscriptexpression.reprodfertildev2011；23:107.beatonbp,etal.,compoundtransgenics:recombinase-mediatedgenestacking.in:pinkertca(ed.).transgenicanimaltechnology:alaboratoryhandbook,3rded.waltham,ma:elsevier；2014:565–578.benfieldda,etal.,1992.characterizationofswineinfertilityandrespiratorysyndrome(sirs)virus(isolateatccvr-2332).jvetdiaginvest4:127-133.boddicker,etal.,2014.genome-wideassociationandgenomicpredictionforhostresponsetoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection.genetics,selection,evolution:gse46,18.borgna,etal.,cd1d-lipid-antigenrecognitionbythesemi-invariantnktt-cellreceptor.nature2007；448:44–49.brinsterrl,etal.,factorsaffectingtheefficiencyofintroducingforeigndnaintomicebymicroinjectingeggs.procnatlacadsciusa1985；82:4438–4442.calvertjg,etal.,2007.cd163expressionconferssusceptibilitytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses.jvirol.81:7371-7379.carterdb,etal.,phenotypingoftransgen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