本发明属于医药
技术领域：
：，涉及一种中草药消毒方剂及其制备方法的研究。
背景技术：
：：化学消毒剂虽然应用广泛，但是长期的使用会带来不同程度的病原耐药性。而中草药消毒剂在应用时，不易产生耐药性，具有抗菌消炎、低毒、低残留或无残留等特点，而且可以有效地抑制、杀灭病原微生物，原因在于中草药包含多种生物有效成分，可以对病原微生物多个环节的代谢进行干扰，如能量转化、dna、rna等。中草药大多数是天然植物，含有色素、维生素、生物碱、有机酸、氨基酸、挥发油、矿物质、树脂类等多种生物有效成分。中草药消毒剂对机体生理机能几乎没有毒副作用，不会致癌、致畸、致突变等。中草药消毒剂制备工艺及设备简单，而化学合成药物消毒剂的生产工艺则相对复杂。中草药来源于大自然，大多数在野生生长，只有少数为人工种植，所以中草药来源广泛，成本较低廉，便于应用与推广。中草药为天然有机物，其生物活性不易受到影响、各种成分结构比较稳定，所以中草药不易变质，储运方便[1]。我国加入wto之后，各行各业都面临前所未有的挑战，制药行业也面临来自世界药品市场的剧烈竞争。但随着人类观念改变，开始寻求健康的生活，以及动物疾病模式发生转变，人类对中医药关注的关注与日俱增，世界各地涌现出了对中草药制剂研究的热潮，将目光投向了博大精深的中草药方剂这个巨大宝库的研究之中[2]。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种成本低廉、副作用小、标本兼治的中草药消毒方剂。其具体技术方案为：一种中草药消毒方剂，包括由下述重量份的原料药：大黄4-8份、大青叶4-8份、艾叶3-6份、丹皮5-9份。经过正交实验得到效果最佳方案：大黄4份、大青叶4份、艾叶6份、丹皮5份。其中，大黄的功效：泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经；大青叶归肝，心，胃，脾经，大青叶功效：清热解毒，凉血消斑；艾叶的功效：散寒止痛，温经止血；丹皮的功效是清热，活血散瘀，丹皮的作用是治温热病热入血分，阴虚骨蒸潮热，血滞经闭，风湿热痹。本发明所述中草药消毒方剂的剂型是汤剂。一种本发明中草药消毒方剂的制备方法，按照本发明所述重量份称取各个原料药混合，粉碎成粉，加入适当辅料，按常规工艺制成汤剂。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的药物为纯中药，以大黄、大青叶、艾叶、丹皮组成的中草药消毒剂对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用，其稳定性受温度影响不大，临床现场消毒效果明显，证明本中草药消毒剂安全有效，可用于养殖场消毒。大黄、大青叶、艾叶、丹皮药源丰富，价格低廉，因此大大降低了中草药消毒剂的成本。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。1试验材料1.1菌种试验菌株：大肠杆菌(escherichiacoli)(atcc8099)、枯草杆菌芽孢杆菌(bacillussubtilis)(cgmcc12746)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(jp-1)(从豫北地区部分发病牧场患乳房炎奶牛的牛乳中分离、鉴定得到)由本实验室提供。1.2中草药败酱草、红花、大黄、浙贝、没药、蛇床子、黄芪、艾叶、丹皮、乌梅、益母草、金银花、五倍子、秦皮、皂角刺、蒲公英、大青叶、栀子、乳香、当归、连翘、苦参、诃子、野菊花、紫花地丁等，购自河南省人民医药大药房。1.3培养基与试剂却普曼琼脂(chapmanagar，ca)用于选择性分离金黄色葡萄球菌、麦康凯培养基(macconkeyagar，mca)用于选择性分离肠杆菌、脑心浸液培养基(brianheartinfusion，bhi)用于病原菌盲筛、血平板培养基(bloodagar，ba)用于病原菌盲筛、琼脂粉(agar)、mh肉汤(mueller-hintonbroth，mhb)用于细菌增殖和纯培养。按有关文献配制[3-5]。标准比浊管：采用1.17％(w/v)bacl2·2h2o0.5ml加1％的h2so499.5ml配制而成，密闭并置于暗处，可保存6个月[7]。此标准管浊度相当于含菌1.5×108/ml。吐温-80(tween-80)，磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)，卵磷脂(lecithin)，硫代硫酸钠(na2s2o3)。1.4主要仪器设备dhp恒温培养箱，上海高致精密仪器有限公司制造。bluepardthz-100气浴摇床，上海一恒科学仪器有限公司制造。healforcehfsafe-1200lc生物安全柜，上海力康生物医疗科技控股有限公司制造。冰箱，西门子公司制造。ls-ld立式高压蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司制造。gzx-gf-101-5-s数显式鼓风干燥箱，上海精密仪器仪表有限公司制造。2试验方法2.1中草药煎剂的制备各中草药去木质，清洗去泥，自然晾干。煎煮前，取中草药100g，首次加水800ml，搅拌使中草药充分浸润，室温浸泡40min，武火加热至沸腾后，文火继续煎煮50min，用4层纱布滤过药液。向所剩药渣中加水400ml，武火加热至沸腾后，文火继续煎煮30min，抽滤并弃去药渣，合并2次滤过药液，蒸发浓缩，得到100ml提取物，即制成含药量约1g/ml的中草药液，装入广口瓶，做好标记，封口膜密封，-20℃冷冻保存。使用前，解冻，用灭菌生理盐水配制需要浓度，4℃冰箱保存[6-9]。2.2试验菌液的制备首先将试验菌株用划线法接种于bhi平板，37℃恒温培养18～24h后，挑取数个直径大约为1～3mm左右的、形态相似的单菌落于5ml生理盐水中，菌落磨碎摇匀，在比浊仪上校正浓度至0.5麦氏浊度单位。校正好的菌液15min内使用[10]。2.3培养基的制备将加热融化的bhi培养基(每个平皿约20ml)加入到培养皿(内径90mm，高17～18mm)中作为底层，倾注时转动平皿使培养基均匀摊布，水平放置待其凝固。再取200μl标准菌悬液，加到每平皿中，均匀涂布，水平放置10min，作为菌层。然后在每平皿中以等距离均匀安置4个牛津杯(高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm)，陶瓦圆盖覆盖，放于4℃冰箱备用[10]。2.4中草药体外抑菌试验采用牛津杯法对试验菌株进行体外抑菌试验。解冻中草药液，混合均匀后分别向制备好的带有菌层的平皿中的牛津杯内加入100μl中草药液，盖好，37℃恒温培养18～24h后，观察并测量抑菌圈直径，作好试验记录。设置空白对照，每组试验重复3次，结果取平均值[11-14]。根据中草药煎剂的体外抑菌试验结果，筛选出每种细菌的、有较好抑制作用的药物，利用2倍稀释法测定上述敏感中草药的mic[15]。2.5结果判定标准抑菌圈直径判断标准：抑菌圈小于8mm为不敏感；大于8mm，小于10mm为敏感；大于10mm，小于15mm为高度极敏；大于15mm为极度敏感[16]。2.6抗菌中药组方的筛选2.6.1抗菌中药组方的初步筛选利用正交试验法进行中草药组方的初步筛选[17-20]。取2.3制备的含菌培养基进行试验。试验药液共8组，药物配制按照l8(27)正交表(见表1)进行设置，药物剂量设置2个水平(见表2)。向制备好的含有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的平皿中的牛津杯内加入8种配制好中草药液各100μl，标记，37℃恒温培养18～24h，观察并测量抑菌直径。每组中药药液重复3次，取平均值。试验数据利用sas软件进行统计，极差分析法分析。表1l8(27)正交表tab.1l8(27)orthogonaltable表2各药物剂量水平tab.2thesettingofeveryherbaldosagelevel2.6.2抗菌中草药组方的确定根据上述方案的初筛试验结果，各因素做进一步剂量优化。试验中药液共9组，药物配置情况按照l9(34)正交表进行设置(表3)，药物剂量设置3个水平(见表4)。操作方法同2.6.1。每组中药液重复测定3次，取平均值。试验数据利用sas软件进行统计，极差分析法分析。得到的效果最优组合就是中草药抗菌组方。表3l9(34)正交表tab.3l9(34)orthogonaltable表4优化因素剂量水平设置tab.4thedosagelevelsettingofoptimizingagent注：“/”表示该成分不添加。2.7中和剂选择试验试验菌液为校正好的0.5麦氏单位的大肠杆菌标准菌悬液。备选中和剂分别为硫代硫酸钠、吐温-80、卵磷脂。目标中和剂以pbs缓冲液为基础，加入一定量的硫代硫酸钠、吐温-80、卵磷脂以达到中和效果。试验分组情况见表5。首先按照试验设置配制含硫代硫酸钠、吐温-80、卵磷脂相应比例的pbs缓冲液5ml，振荡摇匀，然后与消毒液混合作用15min，最后与试验菌液混合。对照组则用5ml生理盐水代替中和剂。混合条件为(20±2)℃水浴环境。利用十倍稀释法、平板计数法对各混合液进行稀释并涂布平板，37℃恒温培养24～72h，观察并统计菌落数，根据稀释倍数得到菌数(cfu/ml)。各组间菌落数误差率及试验所用试剂按《消毒技术规范》(卫生部，2002)计算和配置[21]。每组试验重复测定3次，取平均值，试验数据利用sas软件进行统计与分析。表5中和剂选择试验分组设置tab.5thegroupsettingofneutralizingagentselection注：“/”表示该成分不添加。2.8定量杀菌试验试验菌液为校正好的0.5麦氏单位的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌标准菌悬液。试验时，分别取0.5ml标准菌悬液(对照组用生理盐水代替标准菌悬液)与4.5ml消毒液混匀，在消毒剂作用的第5、10、15、30min时，分别取0.5ml混合液加入至4.5ml中和剂溶液的试管中，中和作用15min[22]。混合条件为(20±2)℃水浴环境。去除消毒剂后，利用十倍稀释法、平板计数法对各试验组和对照组混合液进行稀释并涂布平板，37℃恒温培养24～72h，观察并统计菌落数，计算杀菌率。每组试验测定3次，取平均值，试验数据利用sas软件进行统计与分析。2.9有机物影响试验在0.5麦氏单位金黄色葡萄球菌标准菌液中加入小牛血清以检测有机物对杀菌效果的影响情况，其中对照组添加相同量的生理盐水，3组试验组血清水平分别设置为10％、15％及20％。每组试验测定3次，取平均值，试验数据利用sas软件进行统计与分析。2.10稳定性试验试验菌液为校正好的0.5麦氏单位的金黄色葡萄球菌标准菌悬液。将中草药消毒剂解冻回温，取消毒剂原液2份。设置对照组和试验组各1组，其中对照组中草药液当天做杀菌效果试验，试验组中草药液放置于54℃恒温箱保存，第14d时用同样方法测定其杀菌效果。每组试验测定3次，取平均值，试验数据利用sas软件进行统计与分析。2.11现场表面消毒试验以新乡市某种鸡场为试验场地，随机选择两栋情况相似的鸡舍进行试验。设置对照鸡舍和试验鸡舍各1栋，其中试验鸡舍使用原液中草药消毒剂进行消毒，对照鸡舍使用相等量的生理盐水进行喷淋。试验前，用自来水对两栋鸡舍进行彻底冲洗。试验鸡舍在消毒前和消毒后30min内对鸡舍食槽、地面、饮水器、墙壁等不同部位的5×5cm2面积的地面或其他表面用浸润过中和剂的棉拭子横向用力擦拭15次进行样品采集，采样时应不断转换棉拭子擦拭面。剪掉拭子棉花端入装有5ml无菌生理盐水的采样管内，涡旋5min将微生物洗脱。利用10倍稀释法适当稀释，取1ml上述稀释样液加入到约20ml冷却至50℃左右的bhi琼脂培养基中，再加入约10％去纤维血清后，放入37℃恒温培养48～72h，观察并统计菌落数，根据稀释比例得到活菌数。对照鸡舍做同样处理。3结果3.1中草药的敏感性测定结果中草药煎剂对三种病原菌抑菌效果测定结果见表6～7。表627味中药水煎剂对三种病原菌的抑菌圈直径(mm)tab.6thediameterofinhibitionzoneof27kindsofchineseherbsagainst3kindsofpathogenicbacteria(mm)表7部分敏感中草药的mic(g/ml)tab.7themicofpartialsensitivechineseherbs(g/ml)由表6可知，大肠杆菌对大黄、秦皮、蛇床子、金银花、大青叶、白芍、艾叶、丹皮、鱼腥草素、苦参、千里光、五倍子均极度敏感；对凤尾草、漏芦、紫花地丁均高度敏感；对蒲公英、皂角刺、诃子、黄柏、射干、大瓜蒌、半枝莲均敏感；对连翘、败酱草、地锦草、川芎、乌梅均不敏感。枯草芽孢杆菌对丹皮、大黄、蛇床子、大瓜蒌、苦参、艾叶、大青叶、五倍子、黄柏极度敏感；对秦皮、凤尾草、金银花、漏芦、白芍、鱼腥草素、地锦草、川芎、千里光高度敏感；对败酱草、紫花地丁、半枝莲、诃子、蒲公英均敏感；对皂角刺、射干、连翘、乌梅均不敏感。金黄色葡萄球菌对苦参、大黄、乌梅、紫花地丁、丹皮、川芎、大青叶、千里光、五倍子、艾叶、蛇床子均极度敏感；对凤尾草、金银花、败酱草、皂角刺、鱼腥草素、地锦草、半枝莲均高度敏感；对连翘、秦皮、诃子、白芍均敏感；对蒲公英、漏芦、黄柏、射干、大瓜蒌均不敏感。由表7可知，大肠杆菌对艾叶最为敏感，mic达0.03125g/ml；其次为大黄、大青叶，mic达0.0625g/ml；对蛇床子、丹皮、五倍子也有较强的敏感性，mic达0.125g/ml；而对苦参、金银花、千里光的抑制作用比较强。枯草芽孢杆菌对大黄最为敏感，mic达0.0156g/ml；其次大青叶，mic达0.125g/ml；对艾叶、丹皮也有很强敏感作用，mic为0.0625g/ml；而对苦参、五倍子、千里光则有很强抗药性。金黄色葡萄球菌对丹皮最为敏感，mic达0.03125g/ml；其次是大黄、艾叶、大青叶、苦参，mic达0.125g/ml；而对蛇床子、五倍子、千里光的敏感作用较弱。由上可知，大黄、蛇床子、大青叶、艾叶、丹皮、苦参、五倍子这七种中草药抑菌效果较好，继续进行中药组方筛选。3.2抗菌中药组方的筛选实验结果见表8～10。表8各中药组合抗大肠杆菌作用测定结果(mm)tab.8thedeterminationresultsofbacteriostasisagainste.coliofeverycombination(mm)注：m1表示各因素1水平的和；m2表示各因素2水平的和；r表示极差；n表示试验重复次数。表9各中药组合抗枯草芽孢杆菌作用测定结果(mm)tab.9thedeterminationresultsofbacteriostasisagainstb.subtilisofeverycombination(mm)注：m1表示各因素1水平的和；m2表示各因素2水平的和；r表示极差；n表示试验重复次数。表10各中药组合抗金黄色葡萄球菌作用测定结果(mm)tab.10thedeterminationresultsofbacteriostasisagainsts.aureusofeverycombination(mm)注：m1表示各因素1水平的和；m2表示各因素2水平的和；r表示极差；n表示试验重复次数。由表8～10可知，按照预设方案各试验组中草药液的组成及剂量水平设置，由各中药组合抗大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的正交试验结果表明：因素1、3、4、5在抑菌过程中起主要作用，其他因素不添加反而效果更佳。因此，该组试验得到的优化组合为11223141516272，即因素1、3、4、5取1水平，而因素2、6、7取2水平。该组中草药能同时有效抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。所以，大黄、大青叶、艾叶、丹皮这四种中草药抑菌效果明显，继续进行中药组方确定试验。4.3抗菌中药组方的确定试验结果见表11～13。表11优化方案抗大肠杆菌作用测定结果(mm)tab.11thebacteriostasisagainste.colieverycombinationofoptimizingagents(mm)注：m1表示各因素1水平的和；m2表示各因素2水平的和；m3表示各因素3水平的和；s表示m1、m2、m3的标准差；t表示t检验值；*表示药效最大值；se表示实际的试验误差；fe表示误差自由度。表12优化方案抗枯草芽孢杆菌作用测定结果(mm)tab.12thebacteriostasisagainstb.subtiliseverycombinationofoptimizingagents(mm)注：m1表示各因素1水平的和；m2表示各因素2水平的和；m3表示各因素3水平的和；s表示m1、m2、m3的标准差；t表示t检验值；*表示药效最大值；se表示实际的试验误差；fe表示误差自由度。表13优化方案抗金黄色葡萄球菌作用测定结果(mm)tab.13thebacteriostasisagainsts.aureuseverycombinationofoptimizingagents(mm)注：m1表示各因素1水平的和；m2表示各因素2水平的和；m3表示各因素3水平的和；s表示m1、m2、m3的标准差；t表示t检验值；*表示药效最大值；se表示实际的试验误差；fe表示误差自由度。由表11～13可知，按照预设方案各试验组中草药液的组成及剂量水平设置，由各中药组合抗大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的正交试验结果表明：最优组合为大黄2大青叶2艾叶1丹皮2，即大黄2水平，大青叶2水平，艾叶1水平，丹皮2水平，该4种中草药在抑菌过程中的作用均极显著。也就是说，大黄40g、大青叶40g、艾叶60g、丹皮50g混合煎制而成的中草药制剂抑菌效果最理想。3.4中和剂选择试验试验结果见表14。第3组和对照组生长菌落最多，其次是第1组与第5，但是和第1组差距明显；第1组和对照组误差率4.55％。结果表明：含有0.5％硫代硫酸钠、3％吐温-80、1％卵磷脂的pbs缓冲液对中草药消毒方剂的中和效果理想，可以作为该中草药消毒剂的中和剂。表14中草药消毒剂的中和试验结果tab.14theneutralizationtestresultsofchineseherbaldisinfectant注：试验温度为20℃。大肠杆菌标准菌悬液浓度约为1.35×108cfu/ml。3.5定量杀菌试验试验结果见表15。结果表明：中草药消毒剂对大肠杆菌作用5min灭菌率99.9％，作用10min杀菌率达到100％；中草药消毒剂对枯草芽孢杆菌作用15min杀菌率达99.9％；中草药消毒剂对金黄色葡萄球菌作用10min杀菌率达99.9％，作用30min杀菌率达到100％。表15中草药消毒对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的杀菌效果tab.15thebactericidaleffectofchineseherbalmedicineone.coli,b.subtilisands.aureus注：试验温度为20℃。3.6有机物对消毒剂的影响试验结果见表16。结果表明：有机物对中草药消毒剂杀灭金黄色葡萄球菌有一定影响，而且有机物含量越多，对中草药消毒剂的影响也越大。中草药消毒剂受有机物影响后，需要增加消毒剂浓度或延长消剂作用时间才能达到之前的消毒效果。表16有机物对中草药消毒剂杀灭金黄色葡萄球菌的影响tab.16theeffectoforganiccompoundsonthekillingofs.aureusbychineseherbaldisinfectant注：试验温度为20℃，消毒前金黄色葡萄球菌菌数为1.41×108cfu/ml。3.7稳定性试验试验结果见表17。结果表明：消毒液置于54℃温箱中存放14d，作用15min以上，对金黄色葡萄球菌的杀菌率依然保持在99.9％，并没有影响其杀菌效果。表17存放前后对金黄色葡萄球菌的的杀灭效果tab.17thekillingeffecttos.aureusbeforeandafterstorage注：存放温度为54℃，试验温度为20℃。3.8现场消毒试验试验结果见表18。结果表明：中草药消毒剂对养鸡场表面现场的杀菌率为99.96％。表18中草药消毒剂对自然菌表面现场消毒效果tab.18thedisinfectioneffectofchineseherbaldisinfectantonthesurfaceofnaturalbacteria注：试验温度为室温。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。当前第1页12当前第1页12