一种篦齿眼子菜组织培养与快速繁殖方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及沉水植物篦齿眼子菜的组培和快速繁殖方法，该方法是采取完全无菌和严格的控温措施，实现了沉水植物篦齿眼子菜在实验室大量生产，并可以推广到生态环境修复领域。

背景技术：

篦齿眼子菜属于眼子菜属，是一种分布于全世界的沉水植物。篦齿眼子菜生于河沟、水渠、池塘等各类水体，水体多呈微酸性或中性，在中国西北地区亦见于少数微碱性水体及咸水中。全球分布，尤以两半球温带水域较为习见，对水体中的氮磷有突出的净化效果。

近几十年来，因为环境污染和栖息地改变等因素，篦齿眼子菜从其先前生长的环境中退化或者消失。可惜的是，目前尚缺乏成熟技术，可以大规模扩繁篦齿眼子菜优质工程苗，同时克服该物种在自然环境中种源退化且污染严重的问题。

技术实现要素：

本发明提供了一种篦齿眼子菜组织培养与快速繁殖方法，该方法是在无菌条件下，采取控温措施，给予固定光照，建立植物无菌苗体系，可常年提供大量无菌幼苗。方法易行，操作方便，产量高。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种篦齿眼子菜组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤：

a、外植体选择与预处理：选择颜色鲜绿，生长健壮的可萌发腋芽的篦齿眼子菜茎段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡10min，再用自来水冲洗1小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台；

b、无菌外植体的制备：在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒，用无菌水冲洗3-4次，进行表面消毒5分钟，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待用；

c、丛生芽诱导：选择0.10mg/lkt（激动素）和0.01mg/lnaa（萘乙酸）的ms固体培养基，蔗糖质量浓度为3%，ph调至5.8-6.0，固体培养基装于组培瓶；培养基经过120℃灭菌处理20min，冷却后，接入灭菌处理后的1.0-2.0cm的篦齿眼子菜外植体，于光照培养箱中静置培养，待幼芽长至5.0-6.0cm进行增殖培养；

d、增殖培养：选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2ms液体培养基，添加0.05-2.00mg/l6-ba（6-苄氨基嘌呤）和0.01-0.50mg/lnaa的激素；液体培养基分装于500毫升组培瓶中，每瓶100毫升，灭菌后，接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培养箱中，进行增殖培养；

e、生根培养：选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2ms液体培养基，添加0.01-1.00mg/lnaa的激素；液体培养基分装于500毫升组培瓶中，每瓶100毫升，灭菌后，接入长6.0-8.0cm的幼苗置于光照培养箱中静置，进行生根培养；

f、扩大培养：选择长度为17.0-20.0cm的无菌幼苗，置于增殖培养基中，进行工业化生产；

g、炼苗和移栽：待篦齿眼子菜无菌幼苗长至25.0cm即可炼苗，打开瓶盖，室温下炼苗1-2d后洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中；

所述的步骤c、d、e、f均采用无菌环境，光照60-70μe/（m²·s），光照周期为12h/d，室内温度（25±2）℃。

优选的，步骤b中，所述的表面消毒采用0.1%氯化汞。

优选的，步骤c中，kt的浓度为0.10mg/l，naa的浓度为0.01mg/l。

本发明具有以下有益效果：

篦齿眼子菜是修复受损水生态环境的先锋种类，但目前关于篦齿眼子菜组织培养的技术未见报道。本发明对篦齿眼子菜进行无菌繁殖体系建立，对以后对篦齿眼子菜进行系统的研究、湿地的保护与修复以及生态环境的修复具有重要意义。利用本发明可以不受季节、温度、地域影响，生产大量的篦齿眼子菜无菌苗。一个长为17-20cm的无菌幼苗经过一个月的培养可以繁殖出29-47cm长的幼苗，湿重可增加24倍，30d的增殖系数最高可达到15倍，优越于自然水体植物的繁殖速度。

附图说明

图1是实施例1中篦齿眼子菜30d增殖情况；

图2是实施例2中篦齿眼子菜30d增殖情况。

具体实施方式

本发明实施例所使用的试剂，如未特别说明，市售的均可实现本发明，涉及的技术方案，如未特别说明，均可采用本领域的常规技术。

实施例中采用的ms培养基配方如下：单位mg/l，

kno31900

nh4no31650

mgso4•7h2o370

kh2po4170

cacl2•2h2o440

mnso4•4h2o22.3

znso4•7h2o8.6

h3bo36.2

ki0.83

na2moo4•7h2o0.25

cuso4.5h2o0.025

cocl2.6h2o0.025

na2-edta37.3

feso4•7h2o27.8

甘氨酸2.0

盐酸吡哆醇0.5

盐酸硫铵素0.1

烟酸0.5

肌酸100

ms固体培养基为上述培养配方中加入6g/l琼脂。

实施例1

a、外植体选择与预处理：选择颜色鲜绿，生长健壮的可萌发腋芽的篦齿眼子菜茎段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡10min，再用自来水冲洗1小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台；

b、无菌外植体的制备：在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒，用无菌水冲洗3-4次，再用0.1%氯化汞（加入几滴吐温80）进行表面消毒5分钟，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待用；

c、丛生芽诱导：选择0.10mg/lkt和0.01mg/lnaa的ms固体培养基，蔗糖质量浓度为3%，ph调至5.8-6.0，固体培养基装于组培瓶；培养基经过120℃灭菌处理20min，冷却后，接入灭菌处理后的1.0-2.0cm的篦齿眼子菜外植体，于光照培养箱中静置培养，待幼芽长至5.0-6.0cm进行增殖培养；

d、增殖培养：选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2ms液体培养基，添加2.00mg/l6-ba和0.50mg/lnaa的激素；液体培养基分装于500毫升组培瓶中，每瓶100毫升，灭菌方式与芽诱导相同，接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培养箱中，进行增殖培养；

e、生根培养：选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2ms液体培养基，添加0.01mg/lnaa的激素；液体培养基分装于500毫升组培瓶中，每瓶100毫升，灭菌方式与芽诱导相同，接入长6.0-8.0cm的幼苗置于光照培养箱中静置，进行生根培养；

f、扩大培养：后期进行扩大传代培养，生产大量无菌植物时，选择长度为17.0cm的无菌幼苗，置于增殖培养基中，进行工业化生产；

g、炼苗和移栽：待篦齿眼子菜无菌苗长至25.00cm即可炼苗，打开瓶盖，室温下炼苗1-2d后洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中；

所述的步骤c、d、e、f均采用无菌环境，光照60-70μe/（m²·s），光照周期为12h/d，室内温度（25±2）℃。

本方法可以由一个外植体直接诱导出幼芽，再不断繁殖得到更多的丛芽，30d的增殖系数达到15，植物重量增加23.9倍，长度增加1.6倍，且获得幼苗和自然环境中的篦齿眼子菜没有差别。存活率大于95%。实施例1中篦齿眼子菜30d增殖情况如图1所示。

实施例2

a、外植体选择与预处理：选择颜色鲜绿，生长健壮的可萌发腋芽的篦齿眼子菜茎段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡10min，再用自来水冲洗1小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台；

b、无菌外植体的制备：在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒，用无菌水冲洗3-4次，再用0.1%氯化汞（加入几滴吐温80）进行表面消毒5分钟，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待用；

c、丛生芽诱导：选择0.10mg/lkt和0.01mg/lnaa的ms固体培养基，蔗糖质量浓度为3%，ph调至5.8-6.0，固体培养基装于组培瓶；培养基经过120℃灭菌处理20min，冷却后，接入灭菌处理后的1.0-2.0cm的篦齿眼子菜外植体，于光照培养箱中静置培养，待幼芽长至5.0-6.0cm进行增殖培养；

d、增殖培养：选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2ms液体培养基，添加0.05mg/l6-ba和0.01mg/lnaa的激素；液体培养基分装于500毫升组培瓶中，每瓶100毫升，灭菌方式与芽诱导相同，接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培养箱中，进行增殖培养；

e、生根培养：选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2ms液体培养基，添加1.00mg/lnaa的激素；液体培养基分装于500毫升组培瓶中，每瓶100毫升，灭菌方式与芽诱导相同，接入长6.0-8.0cm的幼苗置于光照培养箱中静置，进行生根培养；

f、扩大培养：后期进行扩大传代培养，生产大量无菌植物时，选择长度为20.0cm的无菌幼苗，置于增殖培养基中，进行工业化生产；

g、炼苗和移栽：待篦齿眼子菜无菌苗长至25.00cm即可炼苗，打开瓶盖，室温下炼苗1-2d后洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中；

所述的步骤c、d、e、f均采用无菌环境，光照60-70μe/（m²·s），光照周期为12h/d，室内温度（25±2）℃。

本方法由一个外植体直接诱导出幼苗，30d的增殖系数达到10，植物重量增加24.8倍，长度增加2.6倍，获得的幼苗和自然环境中的篦齿眼子菜没有差别。存活率大于90%。实施例2中篦齿眼子菜30d增殖情况如图2所示。

表1所示为两个实施例中篦齿眼子菜的生长情况。