一种三齿型连接子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种三齿型连接子及其应用，所述三齿型连接子可用于获得抗体药物偶联物。所述抗体药物偶联物如式Ⅰ所示：L–(T-A–D)n?Ⅰ。其中L是抗体，抗体片段或蛋白；T是三齿型连接子部分；A是可断裂连接子组合或不可断裂连接子部分；D是药物部分；n是一个范围在0-8的整数；所述三齿型连接子部分的结构如式Ⅱ所示：其中W是取代的芳基，杂芳基，链烷基，环烷基，杂环烷基，或其中任意组合。
【专利说明】一种三齿型连接子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及应用抗体药物偶联物治疗肿瘤或其它疾病，尤其涉及应用一种特殊的三齿型连接子来制备抗体药物偶联物以控制药物/抗体比值(DAR)。
【背景技术】
[0002]作为新型的靶向治疗药物，抗体药物偶联物(ADC)开创了肿瘤治疗方法的新纪兀(Carter 等，2008, Cancer J.14:154-169;Chari 等，2008, Acc.Chem.Res.41:98-107;Senter 等，2009, Curr.0pin.Chem.Biol.13:235 - 244;Teicher 等，2009, Curr.Cancer Drug Targets9:982-1004;Ducry 等，2010，Bioconjugate Chem.21:5-13;Lash等，2010, In vivo:The Business&Medicine Report32-38;Casi 等，2012, J.Control.Rel.161:422-428)。在美国的西雅图基因公司(Seattle Genetics, Inc.)和免疫原公司(ImmunoGen, Inc.)引领下，很多跨国制药企业和初创公司都开展了这一领域的研发。据美国华尔街报告披露，截止2011年5月，总计有36个ADC项目进入临床前和临床阶段。2011年8月美国食品药品监督管理局(FDA)批准西雅图基因公司研制的用于治疗霍奇金淋巴瘤以及复发性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的新药Adcetris?上市(Katz等，2011，Clin.Cancer Res.17:6428-6436)。健泰科生物技术公司(Genentech)研制的用于治疗乳腺癌的新药T-DMl正在进行三期临床试验并取得了满意的效果，有可能于2013年初获得FDA批准上市(Mathew 等,2011, Curr.0pin.0ncol.23:594-600)。
[0003]抗体药物偶联物一般由三部分组成:抗体或抗体类配体,小分子药物,和将配体与药物偶联起来的连接子。抗体药物偶联物的作用机制如下:抗体或抗体类配体特异性地识别细胞表面抗原并与之结合；形成的结合物以内吞的方式进入细胞内，同时将小分子药物带入细胞；抗体被酶解或连接子自身断裂，小分子药物以适当的活性成分形式释放出来，杀死目标细胞。抗体药物偶联物采用的小分子细胞毒性药物活性非常高，通常比目前在一线应用的化疗药物活性高10-1000倍以上。用于抗体药物偶联物的细胞毒性药物主要包括美登素类(Maytansinoids, EP0425235; US5208020, 5416064; 7276497，7473796，7851432; US2007/0269447, 2011/0158991 ;W02004/103272, 2012/061590)，耳抑素肽类(Auristatins, US6884869, 7498298)，卡奇霉素类(Calicheamicins, US5606040, 5770710)，阿霉素类(Doxorubicins, Dubowchik 等，2002, Bioconjugate Chem.13:855-869),苯并二吡咯类抗生素类(duocarmycins和CC-1065类，US7129261)，以及吡咯并苯二氮卓二聚体类(PBD dimmers, W02005/040170)等。抗体药物偶联物采用的连接子需满足以下要求:在细胞外具有足够的稳定性，保证小分子药物不与配体脱离；进入细胞后，可断裂的连接子在适当条件下断裂，释放出活性小分子药物；对于不可断裂的连接子，活性成分则由小分子，连接子，以及由配体酶解产生的氨基酸残基构成。
[0004]目前进入临床试验的抗体药物偶联物结构中，高活性的细胞毒性药物通常是通过连接子连接在配体表面的赖氨酸残基，或者抗体铰链区域的半胱氨酸残基(由链间二硫键部分还原得到)上，最佳的药物/配体比值(DAR)为2-4。抗体表面大量的赖氨酸残基(超过80个)以及偶联反应的非选择性，导致偶联数目和位点的不确定性，进而导致生成的抗体药物偶联物的不均一性。例如，T-DMl (平均DAR值为3.5)的DAR值分布为0-8 (Lazar等,2005, Rapid Commun.Mass Spectrom.19:1806-1814)。同样，尽管抗体绞链区的链间二硫键只有四对，但为达到最佳平均DAR值(2-4)的要求，需要部分还原链间二硫键(Sun等，2005，Bioconjugate Chem.16:1282-1290)。由于现有的还原剂(DTT，TCEP 等)无法选择性地还原链间二硫键，因此生成的偶联物也不是均一的产物，由多种组分组成，其主要组分的DAR值为0，2，4，6，8，而且对应每一种特定DAR值的组分都存在由于连接位点不同而形成的异构体。抗体药物偶联物产品的不均一性可以导致各成员组分间药物动力学性质，效价以及毒性的不均一性。例如，具有较高DAR值的组分在体内被清除得更快，并导致更高的毒性(Boswell 等,2011,Bioconjugate Chem.22: 1994-2004)。[0005]为了解决抗体药物偶联物均一性问题，定点偶联技术近来得到了更多的青睐，这一技术从位点和数量两方面来控制抗体药物之间的偶联。西雅图基因公司选择性地用丝氨酸部分置换组成链间二硫键的半胱氨酸，从而将可用于偶联的位点从8个降低到4个或2 个(TO2006/065533; Mcdonagh 等，2006，Protein Eng.Des.Sel.19:299-307)。这样得到的具有确定位点和DAR值的抗体药物偶联物，与从不均一偶联物中分离出来的具有同样DAR值的组分，表现出同样的体外和体内特性，包括抗肿瘤活性,药物动力学,和最大耐受量。应用噬菌体展示技术预测合宜的偶联位点，健泰科公司通过重组的方式在抗体的轻链和重链上引入半胱氨酸，在不影响抗体蛋白折叠组装和改变与抗原结合力的前提下，提供可用于偶联的巯基基团(US7855275;US2011/0301334;W02008/141044，2009/052249;Junutula 等，2008, Nat.Biotechnol.26:925-933;Junutula 等，2010，Clin.Cancer Res.16:4769-4778)。应用此项技术生产的抗体药物偶联物表现出令人满意的近均一组分具有的体内特性。与上述技术不同的是，Ambrx(W02006/069246, 2007/059312)，Allozyne(US2008/0096819;W02007/130453, 2009/026393)，Sutro(W02010/081110)，以及Redwood(US2010/0210543)等公司都采用非天然氨基酸抗体/蛋白改造技术,在抗体/蛋白的合宜位点引入带有可偶联基团的非天然氨基酸，从而实现抗体/蛋白的定点修饰，包括聚乙二醇修饰，糖基化修饰，以及抗体药物偶联物。尽管以上技术都能够实现偶联药物位点和数量的可控，所应用的抗体/蛋白都是通过基因重组的方式得到的。基因重组技术需要大量的工作和精巧的设计，以寻找合宜的位点供药物偶联或聚乙二醇修饰，因此非常耗时而且研发费用较高。
[0006]针对以上偶联技术存在的问题，通过简单的化学方法实现定点偶联目的会节省大量的人力物力财力，因此更加富有吸引力。一种平衡转移烷基化交叉偶联试剂(ETAC)被开发用于定点偶联技术，该试剂可与铰链区二硫键完全还原/部分还原成巯基的抗体反应，生成链间交叉偶联的结构(Liberatore 等，Bioconjugate Chem.1:36-50; del Rosario 等，1990，Bioconjugate Chem.1:51-59)。交叉偶联的产品不仅收率较低(30%左右)，而且均一性较差，含有O到4组链间交叉偶联的组分。韩国的LegoChem Biosciences (LCB)公司报道了一种定点偶联技术，包括定点功能化步骤和正交药物偶联步骤，但是技术的细节并没有披露(BioSpectrum, 2012，39)。
[0007]因此，本领域迫切需要提供高效、简单、实用的化学偶联方法。
【发明内容】
[0008]本发明旨在提供一种可用于化学偶联方法制备抗体药物偶联物的新型三齿型连接子。
[0009]在本发明的第一方面，提供了一种如式I所示的抗体药物偶联物，
[0010]L-(T-A-D)n I
[0011]其中L是抗体，抗体片段或蛋白^是三齿型连接子部分；A是连接子部分；D是药物部分；n是一个范围在0-8的整数；
[0012]所述三齿型连接子部分的结构如式II所示:
[0013]
【权利要求】
1.一种如式I所示的抗体药物偶联物， L- (T-A-D)n I 其中L是抗体，抗体片段或蛋白；T是三齿型连接子部分；Α是连接子部分；D是药物部分；n是一个范围在0-8的整数； 所述三齿型连接子部分的结构如式II所示:
2.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述A是可断裂连接子组合或不可断裂连接子。
3.如权利要求2所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述A的结构如式III或IV所示: C-Ee-Ff III Gg IV 其中C是可断裂连接子；E，F是自杀式连接子；e，f是在0-5范围内的整数而是不可断裂连接子；g是0-5范围内的整数。
4.如权利要求1-3任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物的结构如式V、V1、VII或VDI所示:
5.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体为针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。
6.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述药物为细胞毒性药物，治疗自身免疫疾病的药物和抗炎症的药物。
7.一种结构如式I所示的三齿型连接子:
8.一种结构如式3所示的三齿型连接子:
9.一种结构如式4所示的三齿型连接子:
10.一种结构如式5所示的三齿型连接子:
11.一种结构如式6所示的三齿型连接子:
12.—种结构如式IX所示的三齿型连接子在制备抗体药物偶联物中的应用:
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的三齿型连接子的结构如式1、式2、式3、式4、式5或式6所不:
【文档编号】A61P35/00GK103933575SQ201310025021
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月23日 优先权日:2013年1月23日
【发明者】安德强, 曾迪, 韩念和, 杨航, 朱鹏, 冉云根, 李明振, 荐立, 杨春 申请人:上海新理念生物医药科技有限公司