本发明属于农业技术领域，特别涉及一种确定玉米花粉管通道形成时间的方法。
背景技术：
花粉管通道法自我国科学家周光宇于1983年创立以来，因其无需组织培养和植株再生，且具有技术简单、易于掌握和对设备要求低等特点，在玉米转基因育种中得到了广泛应用。该方法的原理是授粉萌发形成的花粉管通道可将生殖细胞的dna及外源dna输入卵细胞并最终转化成合子或早期胚胎细胞。可见，花粉管通道只有完全打通，才能将携带的精子输送到卵细胞中完成受精并最终结实，因此，利用花粉管通道法的关键在于确定玉米花粉管通道在花丝中形成和打通的时间段。
玉米雌穗从开始结实到结实稳定需要经历从中部、下部、顶部的一个过程，说明花粉管通道在此过程中形成和打通的数量也在逐渐上升，所以通过结实可以断定通道形成、打通、关闭的时段，花粉管通道法只有在完全打通且数量入高峰的时段进行外源dna导入，转化效率才最高。
目前利用花粉管通道法进行玉米转基因育种研究中，转化时间集中在8-30小时之间，时间跨度较大，而且材料间、年度间气象条件也有差异，这便造成了花粉管通道法转化效率不高、结果重复性差、不利于不同材料间参考等缺点。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种确定玉米花粉管通道形成时间的方法，通过所述方法能够了解不同材料间花粉管通道形成时间的规律，即使在客观条件改变的情况下，只要根据每个材料的通道形成规律做相应的调整即可。
通过以下技术方案实现上述目的：
一种确定玉米花粉管通道形成时间的方法，所述方法包括套袋、授粉、切开苞叶、去除花丝、恢复苞叶至原状，每隔1-3小时去除一次花丝，并时时记录温湿度，收获时取回雌穗，并统计结实粒数，根据去除花丝的时间及平均结实粒数，确定玉米花粉管通道形成的时间。
进一步的，所述方法包括以下步骤：
1）套袋：在花丝未露出苞叶时进行套袋；
2）授粉：雌穗花丝露出苞叶达5-7cm时，开始授粉，并再次套袋，标注授粉时间，同时开始记录温湿度；
3）将雌穗苞叶及花丝从距离穗轴顶部3-5cm水平剪掉；
4）切开苞叶：根据雌穗粗细程度将苞叶分为3-4份，再从苞叶切口处从上到下剪开，直至底部；
5）去除花丝：将与穗轴连接处的花丝全部去除干净；
6）恢复苞叶：将苞叶恢复原状，顶部扎好，套袋并标注去除花丝时间，并暂停记录温湿度；
7）去除花丝：授粉后的雌穗从3小时开始每隔2小时重复步骤4-6，去除一次花丝，直至31小时结束，共15次；
8）统计：收获时取回雌穗，统计结实粒数。
进一步的，所述方法还适用于包括棉花、小麦、大豆在内的作物。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明所述的方法，在田间进行，与实际的种植情况最接近，结果可靠性高；
2、本发明所述方法的步骤简单，易于本领域技术人员掌握和操作；
3、本发明所述方法的可行性高，又因考虑到了自然因素的影响，时间段设计较为密集，总结的规律可重复性好，并且可因温湿度变化而做出调整，可在不同材料间使用；
4、本发明所述方法对操作条件的要求较低，成本低廉；
5、本发明所述方法借鉴于传统的“开苞导入法”，但本发明用于确定玉米花粉管通道形成时间，而开苞导入法中去除花丝的目的是为了进行外源dna的导入；其次，开苞导入法操作时需要在授粉后28h-30h，而本发明所述方法时间跨度较大，在3-31h；另外，开苞导入法在操作时要求较高，需要酒精对雌穗、刀具等进行消毒，而本发明不需要。
附图说明
图1为本发明所述确定玉米花粉管通道形成时间的方法操作过程的操作示意图。
具体实施方式
本实施例提供了一种确定玉米花粉管通道形成时间的方法，包括以下步骤：
1）套袋：在花丝未露出苞叶时进行套袋，为避免误差，授粉前不能接触到任何外来花粉；
2）授粉：雌穗花丝露出苞叶达5-7cm时，开始授粉，并再次套袋，标注授粉时间，同时开始记录温湿度；
3）将雌穗苞叶及花丝从距离穗轴顶部3-5cm水平剪掉；
4）切开苞叶：根据雌穗粗细程度将苞叶分为3-4份，再从苞叶切口处从上到下剪开，直至底部，注意不要伤及穗轴、弄断苞叶底部与穗柄连接处；
5）去除花丝：将与穗轴连接处的花丝全部去除干净；
6）恢复苞叶：将苞叶恢复原状，顶部扎好，套袋并标注去除花丝时间，并暂停记录温湿度；
7）去除花丝：授粉后的雌穗从3小时开始每隔2小时重复步骤4-6，去除一次花丝，直至31小时结束，共15次；
8）统计：收获时取回雌穗，统计结实粒数。
一般授粉后24-28小时绝大部分材料都能正常结实并达到稳定，为了保证试验的严谨性，将去除花丝延长至31小时；另外下述数据也表明在29小时以后的处理结实粒数上升已经不太明显，说明其在31小时结实粒数已经接近稳定，本发明的目的也是确定通道打通数量最多的时间段，31小时已经可以确定其时间段了。基于上述2点，发明人选择截止在31小时。
对两种玉米材料（b73、c92），分别进行上述确定玉米花粉管形成时间的测定，具体处理及结果如下：
可以看出，2个材料从授粉至15h均未结实，说明在该时间段内其花粉管通道均未形成。2个材料在3个月中开始结实的顺序依次是3月、12月、1月，这与温度在这3个月中逐渐降低、湿度增大有关；在相同月内，c92开始结实的时间段要早于b73，说明其花粉管通道形成的时间要早于前者。
2个材料平均结实粒数在各月间都是随着去除花丝时间的推移逐渐升高，说明其花粉管通道形成数量也在逐渐增多。b73在1月份试验时是从21h开始结实至29h处于快速上升过程，之后逐渐稳定，说明花粉管通道数量是在21h~29h打通较多；3月份试验时结实粒数是在17h~23h上升幅度较大，说明花粉管通道在17h~23h之间较多；12月份结实粒数在19h~25h上升幅度较大，说明花粉管通道是在该时间段内形成数量较多。同样，c92在1月花粉管通道形成时间是在19h~27之间；2月是在15h~23之间，3月是在17h~25之间。