一种胚蛋内注射胆汁酸促进出壳仔鸡生长的方法与流程

本发明属于禽类养殖技术领域。更具体地，涉及一种胚蛋内注射胆汁酸促进出壳仔鸡生长的方法。

背景技术：

生理调节剂是为了某些特殊需要，人为地给予动物一些具有不同用途的物质，其作用是促进禽类生长发育、预防疾病、提高饲料的利用率和肉产品的质量等。家禽能够在较短生产周期内以较低的成本生产出营养丰富的肉产品，为人类主要的动物蛋白食品来源。因此，通过生理调节剂的使用，提高禽类肌肉生长潜力一直都是养禽业追求的重要目标。

总胆汁酸的组成有鹅脱氧胆酸(chenode-oxycholicacid，cdca)、石胆酸(lithocholicacid，lca)、脱氧胆酸(desoxycholicacid，dca)和胆酸(cholicacid，ca)等，其中cdca含量最多。研究表明胆汁酸对于家禽出壳后的生长发育以及代谢等有着重要的影响。

然而，胆汁酸对禽类胚胎的生长发育影响研究还未见有报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是为了探讨胆汁酸，尤其是鹅脱氧胆汁酸，对禽类胚胎的影响。本发明采用胚蛋直接注射鹅脱氧胆汁酸的方法，研究其对鸡16胚龄(e16)、岀壳当天(doh)、42日龄(d42)时肌肉发育的影响，试图了解胚蛋注射胆汁酸是否能促进子代生长，最终影响肉鸡的骨骼肌发育，对生产实践提供可靠依据。

本发明的目的是提供一种胚蛋内注射胆汁酸促进出壳仔鸡生长的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现，胚蛋直接注射鹅脱氧胆汁酸，能够促进鸡胚的肌肉发育及出壳后鸡的生长，提高出壳后鸡的体重。

具体地，胚蛋直接注射胆汁酸能够显著改善鸡腿肌和胸肌的肌纤维分布，促进腿肌和胸肌的成肌生长因子mrna的表达，提高出壳后鸡的体重和胸肌率、腿肌率。胚蛋注射胆汁酸能够上调核心蛋白多糖(decorin)的表达，进而通过调节成肌因子的表达促进骨骼肌纤维的发育，提高肉鸡的产肉能力。

本发明为胆汁酸在鸡生产中的应用提供了一种新的方式，即胚蛋直接注射。

本发明也为鸡养殖业提供了一种增产、增加养殖效益的新方法，即通过胚蛋直接注射胆汁酸的方式，促进鸡胚的肌肉发育及出壳后鸡的生长，提高鸡养殖效益。

因此，胆汁酸在促进鸡胚的发育和/或促进出壳后鸡的生长方面的应用，以及在制备促进鸡胚的发育和/或促进出壳后鸡的生长的生理调节剂中的应用，都在本发明的保护范围之内。

优选地，所述胆汁酸为鹅脱氧胆汁酸。

其中，所述促进鸡胚的发育是指促进鸡胚的肌肉发育。

更具体地，所述促进鸡胚的肌肉发育是促进腿肌和胸肌的成肌生长因子mrna的表达。

所述促进出壳后鸡的生长是指促进出壳后鸡的腿肌和胸肌的成肌生长因子mrna的表达和/或改善鸡腿肌和胸肌的肌纤维的分布。

另外，所述饲料添加剂还是能够上调核心蛋白多糖(decorin)的表达，进而通过调节成肌因子的表达促进骨骼肌纤维的发育，提高肉鸡的产肉能力的饲料添加剂。

一种胚蛋内注射胆汁酸促进出壳仔鸡生长的方法，是将胆汁酸，优选为鹅脱氧胆汁酸，注射入鸡胚中。具体是注射入种蛋中。

优选地，所述注射的时间为种蛋孵化至3胚龄时。所述3胚龄为种蛋入孵后72小时。

优选地，所述胆汁酸为用dmso溶解、用pbs稀释成的胆汁酸注射液，注射液中胆汁酸的浓度为5～15ng/μl。

更优选地，注射液中胆汁酸的浓度为10ng/μl。

优选地，所述胆汁酸注射液的注射剂量标准为：40～60μl。

更优选地，所述胆汁酸注射液的注射剂量标准为：50μl。

具体地，所述胚蛋内注射胆汁酸促进出壳仔鸡生长的方法，包括如下步骤：

s1.制备注射液：用dmso溶解胆汁酸配成溶度为0.1μm的母液，再用pbs将母液稀释成5～15ng/μl的注射液；

s2.种蛋孵化至3胚龄时，将40～60μl注射液注射到种蛋内，继续孵化。

其中，优选地，步骤s2所述孵化的条件为：温度37.9℃，湿度60％rh，翻蛋周期2h，翻蛋时间180s，换气周期2h，换气时间30s。

步骤s2中所述3胚龄是指：种蛋入孵后24h设定为1胚龄；种蛋入孵后72小时为3胚龄。

优选地，步骤s2所述注射的具体方法为：在种蛋的小头开孔注射(孔越小越好，能保证针头刺入即可)，然后用组织胶水封口，继续孵化。

另外，一种包含有胆汁酸(优选为鹅脱氧胆汁酸)的鸡胚(种蛋)注射制剂也在本发明的保护范围之内。

该包含有胆汁酸的注射制剂能够促进鸡胚的发育和/或促进出壳后鸡的生长。具体是促进鸡胚的肌肉发育，促进出壳后鸡的腿肌和胸肌的成肌生长因子mrna的表达和/或改善鸡腿肌和胸肌的肌纤维的分布，上调核心蛋白多糖(decorin)的表达，进而通过调节成肌因子的表达促进骨骼肌纤维的发育，提高肉鸡的产肉能力。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现并公开了胆汁酸直接注射到胚蛋中，能够显著促进鸡胚的肌肉发育和出壳后鸡的生长，且对禽类的生长无毒无害，可以有效提高禽类的市场价值。

本发明以胚蛋直接注射胆汁酸的方式，过程方便快捷，无特殊设备要求，为胆汁酸在鸡生产中的应用提供了一种新的方式，即胚蛋直接注射；也为鸡养殖业提供了一种增产、增加养殖效益的新方法，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为胚蛋注射基本操作流程。

图2为胚蛋注射cdca对出壳鸡胸肌率和腿肌率的影响图。

图3为胚蛋注射cdca对16胚齡、出壳当天和42日龄鸡腿肌纤维直径的影响图。

图4为胚蛋注射cdca对16胚齡、出壳当天和42日龄鸡腿肌成肌相关因子的表达影响图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1胚蛋注射cdca对孵化后鸡体重、腿肌率和胸肌率的影响

1、为了研究胚蛋注射胆汁酸对子代鸡生长及肌肉发育的直接作用，我们设计了胚蛋注射的试验。

具体地，胚蛋注射的方法，包括以下步骤：

(1)选取240枚蛋重在55±5g范围的纯种隐性白洛克种蛋(温氏种鸡场提供)，在相同的条件下进行常规孵化。

孵化前，把种蛋随机分为四组，分别为pbs组、dmso组、低剂量cdca组和高剂量cdca组，进行称重、消毒和编号。

(2)将(1)收集的种蛋在华南农业大学动物科学学院动物分子营养研究室用科裕mfp微电脑自动孵化机进行孵化。

孵化条件：温度37.9℃，湿度60％rh，翻蛋周期2h，翻蛋时间180s，换气周期2h，换气时间30s。种蛋入孵后24h设定为1胚龄，出雏当天doh(dayofhatch)。

(3)制备注射剂：用dmso溶解鹅脱氧胆汁酸粉剂(sigma公司购)，配成溶度为0.1μm的母液，再用pbs将母液cdca稀释成注射液。

具体实验组如下：

低剂量注射液：500ngcdca/50μlpbs(dmso终浓度为0.5‰)；

高剂量注射液：1000ngcdca/50μlpbs(dmso终浓度为0.5‰)。

阴性对照组：0.5‰dmso/50μlpbs；

空白对照组：50μlpbs。

(4)将(3)制备的注射剂注射到s1收集的种蛋内，注射时间定为种蛋孵化至3胚龄时。3胚龄为种蛋入孵后72小时。

胚蛋注射过程如图1所示：分别小头敲孔注射50μl的pbs(空白对照组)、dmso/pbs混合溶剂(阴性对照组)、500ngcdca/50μlpbs溶液(低剂量cdca组)、1000ngcdca/50μlpbs溶液(高剂量cdca组)，然后用组织胶水封口后，继续进行孵化，出雏后在相同条件下，按照标准化饲养程序饲养至42日龄。

试验饲粮组成见表1。

表1试验日粮组成和营养水平

注：*提供至每千克全价料：铜，5.00mg；铁，69.00mg；锌，84.00mg；锰，98.6mg；碘，1.14mg；

硒，0.30mg；维生素a，15000iu；维生素d3，3000iu；维生素e，25.5mg；维生素k3，2.1mg；

维生素b1，2.4mg；维生素b2，9mg；维生素b6，5.1mg；维生素b12，0.02mg；泛酸钙，12mg；

烟酸，48mg；叶酸，1.2mg；生物素，0.06mg；洛克沙胂，50mg；盐霉素，90mg。

2、组织采样

16胚龄时随机选取10枚正常种蛋，称胚重、肝脏重，采集左腿腿肌放入液氮速冻后转入-80℃保存，留作分子试验研究；采集右腿腿肌液氮固定后留作he染色法的组织形态学测定。

出壳当天(doh)随机选取10只正常的雏鸡，称重后断颈处死；采集左腿胖肠肌，称重后装入2mlep管中，放入液氮速冻后转入-80℃保存，留作分子试验研究；采集右腿腓肠肌，切面与肌纤维走向垂直，修成0.5cm×0.5cm×0.3cm的组织块，自然铺于纸板上，立即以液氮固定后装入5mlep管中，留作he染色法的组织学测定。

雏鸡出壳后饲养至42天，称重后断颈处死，颈静脉采血，以3000rpm离心5min，取血清置于-20℃冰箱中冻存；采集肝脏、胸肌、腿肌称重；采集左腿腓肠肌，称重后装入2mlep管中，放入液氮速冻后转入-80℃保存，留作分子试验研究；采集右腿腓肠肌，切面与肌纤维走向垂直，修成0.5cm×0.5cm×0.3cm的组织块，自然铺于纸板上，立即以液氮固定后装入5mlep管中，留作he染色法的组织学测定。

胚蛋注射cdca孵化出雏后，监测肉鸡体重的变化。

3、结果如表2和图2。

表2胚蛋注射cdca对肉鸡平均体重的影响

注：小写字母不同代表差异显著(p<0.05)。0天：(n＝32)，7至42天:(n＝22)。

胚蛋注射高剂量的cdca显著提高雏鸡doh时的体重；标准统一饲养一周后，注射cdca组的雏鸡体重有所下降；饲喂五周后，注射低剂量cdca组体重显著高于其它组，并且这一趋势维持到第六周。

研究结果表明，胚蛋注射低剂量cdca能够显著促进出壳后鸡的生长和体重增加，显著提高胸肌率和腿肌率。

实施例2胚蛋注射cdca对腿肌肌纤维的发育以及成肌相关因子mrna表达的影响

1、为了研究胚蛋注射cdca对腿肌组织肌纤维分布以及成肌相关因子的影响，进行了肌纤维切片h&e染色试验。

2、结果如图3和图4：试验结果表明，胚蛋注射低剂量的cdca显著提高e16和doh时单位面积腿肌肌纤维数目，高剂量cdca显著增加d42时肉鸡肌纤维直径。胚蛋注射cdca能够上调decorin的表达，进而通过调节成肌因子的表达促进骨骼肌纤维的发育，提高肉鸡的产肉能力。