一种大熊猫精液干罐冷冻方法与流程

本发明属于精子保藏领域，具体涉及一种大熊猫精液干罐冷冻方法。

背景技术：

大熊猫是我国特有的珍稀物种，繁殖能力低下，发情期短。在圈养大熊猫种群中，由于同时处于繁殖期的雌雄大熊猫数量较少，自然交配的成功率较低，所以有时候会采取人工受精的方法促使大熊猫怀孕。

人工采集到的大熊猫精液，其中的活性精子在常温环境中会逐渐失去活性，影响人工受精的受胎率。

大熊猫精液采集后，需要进行冷冻保藏运输，如果处理方法不当，将导致精子活力下降，会极大的降低人工受精的成功率。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为：如何保存运输大熊猫的精液，保证精子的活力。

本发明的技术方案为：一种大熊猫精液干罐冷冻方法，包括如下步骤：

(1)将采集的大熊猫精液用稀释液在30～33℃进行稀释；

(2)将稀释后的大熊猫精液置于4℃环境中平衡；

(3)向平衡后的大熊猫精液中加入抗冻保护剂，并继续置于4℃环境中；

(4)将步骤(3)处理后的大熊猫精液转入容器中，将容器包覆于纱布袋中并将纱布袋放入干液氮罐中，将纱布袋置于干液氮罐灌口下6cm处，加盖停留5min后再将纱布袋置于干液氮罐的罐底，密封，运输。

(5)运输完成后，放入常规液氮罐保存，在需要使用时再取出在50℃的热水中解冻10s即可使用；或者在运输完成后，在50℃的热水中解冻10s即可使用。

进一步地，稀释液采用irvinescientific公司的testyolkbufferwithgentamicin稀释液。

进一步地，稀释液与大熊猫精液的体积比为1︰1。

进一步地，步骤(2)中，平衡时间为3.5小时。

进一步地，步骤(3)中，抗冻保护剂为甘油，甘油加入的体积与大熊猫精液的体积比为1︰1。

进一步地，步骤(3)中，加入抗冻保护剂后，继续置于4℃环境中1小时。

进一步地，干液氮罐包括外壳和设置在外壳内的内胆，内胆顶部设置有内胆颈，所述内胆颈从外壳顶部伸出，内胆颈的顶部设置有保温盖子，外壳上设置有连通外壳和内胆之间空间的抽真空嘴，内胆内壁上设置有液氮吸附层，内胆外壁包覆有气凝胶隔热层，外壳内壁设置有分子筛干燥剂层，气凝胶隔热层与分子筛干燥剂层之间形成真空夹层。

进一步地，所述气凝胶隔热层采用二氧化硅气凝胶材料，厚度为0.5-1cm。

进一步地，分子筛干燥剂层采用5a分子筛，厚度为0.8-1.2cm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的方法中，需要对大熊猫的精液进行稀释和抗冻保护，稀释液能为精子体外存活提供营养和能量，抗冻保护剂能防止冷冻时对精子造成损失。

2、本发明的方法中，需要对大熊猫精液进行特定条件的平衡处理，能提高最终精子的质量。

3、本发明的方法中，采用50°热水10秒解冻的方法，能很好的保证精子的活力。

4、本发明的方法中，采用特殊设计的干液氮罐运输，内胆外壁包覆气凝胶隔热层，气凝胶是非常优秀的隔热材料，能显著提升保温效果，延长保温时间，保证精子质量。外壳内壁设置有分子筛干燥剂层，少量空气进入真空夹层时，水蒸气被分子筛干燥剂吸附，降低真空夹层中空气的湿度，降低热交换，提高保温效果，使内部温度稳定，提升保存效果。

5、本方法操作方便，使用的设备简单，适用于在国家公园内或者野外场所(无电力供应，无精密实验场所)，对野生动物的遗传价值保存具有重大意义。

附图说明

图1为不同冷冻方法对大熊猫冷冻精液活力的影响；

图2为不同冷冻方法对大熊猫冷冻精液顶体完整率的影响；

图3为不同冷冻对大熊猫冷冻精液精子运动状态的影响；

图4为不同冷冻与解冻方法对大熊猫冷冻精液活力的影响；

图5为不同冷冻与解冻方法对大熊猫冷冻精液顶体完整率的影响；

图6为不同冷冻与解冻方法对大熊猫冷冻精液精子运动状态的影响。

具体实施方式

一种大熊猫精液干罐冷冻方法，包括如下步骤：

(1)将采集的大熊猫精液用稀释液在30～33℃进行稀释；

(2)将稀释后的大熊猫精液置于4℃环境中平衡；

(3)向平衡后的大熊猫精液中加入抗冻保护剂，并继续置于4℃环境中；

(4)将步骤(3)处理后的大熊猫精液转入容器中，将容器包覆于纱布袋中并将纱布袋放入干液氮罐中，将纱布袋置于干液氮罐灌口下6cm处，加盖停留5min后再将纱布袋置于干液氮罐的罐底，密封，运输。

(5)运输完成后，放入常规液氮罐保存，在需要使用时再取出在50℃的热水中解冻10s即可使用；或者在运输完成后，在50℃的热水中解冻10s即可使用。

本发明中采用的干液氮罐是自行设计的设备，容量为5l，干液氮罐包括外壳和设置在外壳内的内胆，内胆顶部设置有内胆颈，所述内胆颈从外壳顶部伸出，内胆颈的顶部设置有保温盖子，外壳上设置有连通外壳和内胆之间空间的抽真空嘴，内胆内壁上设置有液氮吸附层，内胆外壁包覆有气凝胶隔热层，外壳内壁设置有分子筛干燥剂层，气凝胶隔热层与分子筛干燥剂层之间形成真空夹层。所述气凝胶隔热层采用二氧化硅气凝胶材料，厚度为0.5-1cm。分子筛干燥剂层采用5a分子筛，厚度为0.8-1.2cm。

实验表明：本发明的干液氮罐在灌口下6cm处的温度为-98℃，罐底的温度为-168℃，正好满足大熊猫精液的最佳冷冻温度。

因干液氮罐为短时间的冷冻运输精液用，运输完成后，可将冷冻好的精液转移至储存精液的液氮灌中永久保存。

实施例1

(1)利用电刺激采精法采集5.5岁～20.5岁大熊猫雄性个体精液，检查精子活力，活力大于80％为合格品。

(2)配置稀释液：稀释液采用irvinescientific公司的testyolkbufferwithgentamicin稀释液。

(3)将合格的精液在泡沫保温箱内在30-33℃条件下用等温的稀释液按1:1的比例作第1次稀释于15ml的离心管中，然后放置在250ml的烧杯中置于4℃冰箱内平衡3.5小时，然后加入抗冻保护剂，抗冻保护剂选用甘油，甘油加入的体积与大熊猫精液的体积比为1︰1。继续置于4℃冰箱中1小时，之后将精液装入0.25ml的精液细管中，放置于4℃冰箱内干燥处。(进行以上步骤时打开冰箱门，速度要快，温度的恒定性，防止温度回升。)

(4)将精液细管包覆于3层纱布袋中并将纱布袋放入干液氮罐中，将纱布袋置于干液氮罐灌口下6cm处，加盖停留5min后再将纱布袋置于干液氮罐的罐底，密封，运输。

(5)运输完成后，放入常规液氮罐保存，在需要使用时再取出在50℃的热水中解冻10s即可使用；或者在运输完成后，在50℃的热水中解冻10s即可使用。

活力检测：解冻后检测精子活力为62％，完全满足生产需要。

对比实验1不同冷冻方法精子活力的对比实验

利用电刺激采精法采集5.5岁～20.5岁大熊猫雄性个体精液，比较了三种冷冻方法即手工两步法、程序冷冻法和本发明的方法(干罐发)对大熊猫冷冻精液质量的影响，以筛选出最适冷冻解冻方法。通过精子活力、顶体完整率和运动状态对冷冻精液质量进行评估。结果如图1、图2和图3所示。研究结果表明，以上三种方法均可制备高质量的冷冻精液。由于本发明的方法具有便携，易于操作的特性适用于野外大熊猫精液的冷冻。

对比实验2不同解冻方法精子活力的对比实验

利用电刺激采精法采集5.5岁～20.5岁大熊猫雄性个体精液，比较了三种冷冻方法即手工两步法、程序冷冻法和本发明的方法(干罐法)与三种解冻温度，分别是22℃，37℃及50℃对大熊猫冷冻精液质量的影响，以筛选出最适冷冻解冻方法。通过精子活力、顶体完整率和运动状态对冷冻精液质量进行评估。研究结果表明，以上三种方法均可制备高质量的冷冻精液，采用运输罐冷冻50℃解冻以及采用手工两步法冷冻50℃解冻优于其它方法，最差的是采用程序冷冻22℃解冻。解冻温度50℃优于其它解冻温度，最差的是22℃慢速解冻，说明大熊猫冷冻精液适宜于高温快速解冻。

从图4可以看出，从对冷冻精液的活力影响来看，三种冷冻方法均无显著差异，但是干罐法和手工两步法略优于程序冷冻法，而在解冻温度上，使用同一种冷冻方法在不同的解冻温度下对精液的活力影响差异不显著，但是50℃解冻略优于37℃，37℃略优于22℃，综合冷冻与解冻方法，采用本发明的冷冻和50℃解冻以及采用手工两步法冷冻50℃与37℃解冻优于其它方法，最差的是采用程序冷冻22℃解冻，精子活力显著低于上述三种方法。

从图5与图6可以看到，从对精子运动状态的影响来看，采用本发明的冷冻和50℃解冻以及采用手工两步法冷冻50℃解冻优于其它方法，所有22℃解冻的样品精子运动状态均显著低于上述两种方法，最差的是采用程序冷冻22℃解冻。