本发明涉及一种利用真菌培养腐烂茎线虫的方法，属植物病原线虫培养。
背景技术：
腐烂茎线虫（ditylenchusdestructor）是一种全球重要的植物病原线虫，美国、加拿大、秘鲁、日本、新西兰、南非、荷兰、挪威、俄罗斯、伊朗、澳大利亚等国家和地区分布广泛，危害严重。在我国主要分布于北京、河北、河南、安徽、山东、江苏、甘肃、云南等地。
腐烂茎线虫主要危害甘薯和马铃薯。在甘薯上，腐烂茎线虫主要引起甘薯块根糠心、空心和腐烂等症状，一般可导致其减产20%～50%，严重时达80%以上，甚至绝收，在储藏期还可引起烂窖，是威胁我国甘薯生产的重要病害。在马铃薯上，主要造成薯块腐烂,该病害在荷兰、挪威、俄罗斯等国家发生较严重，我国目前只有零星发生。除甘薯和马铃薯外，该线虫还可危害当归、薄荷、三七、黄芪等，严重危害当归时发病率高达80%～90%，是当归生产上最重要的病害。
腐烂茎线虫是重要的植物病原线虫，它的寄主范围较广，主要有甘薯、马铃薯、当归、花生、胡萝卜、大豆、烟草、番茄等约90～120多种植物。在国外主要危害马铃薯和花生,在国内主要危害甘薯和中药材，是我国甘薯上最重要的病害之一。该线虫可在甘薯薯块上进行培养，但目前尚缺乏成熟的线虫离体培养技术。在科学研究和实践中，没有足够的材料是开展该线虫生理生化特性、致病机理、遗传特点、药剂筛选以及控制技术等的主要制约因素，因此，研发一种可获得大量、具有良好生命力的线虫群体的培养技术显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明成功实现有效地对腐烂茎线虫离体培养，因而，提供一种腐烂茎线虫离体培养方法，本发明根据腐烂茎线虫具有食真菌的习性，有针对性地选择培养该类线虫喜食的、可培养的真菌，采用马铃薯蔗糖琼脂（pda）培养基培养真菌，然后利用真菌菌丝培养腐烂茎线虫，以解决该类线虫可控制、可持续培养的问题。
本发明提供的技术方案是：一种腐烂茎线虫离体培养方法，包括如下步骤：
第一步，培养基上培养镰刀菌（fusariumspp.），待其长出菌丝体后；第二步，将马铃薯腐烂茎线虫培养于所述长有菌丝的培养基中。
所述的培养方法，其中，第一步所述培养基为马铃薯蔗糖琼脂（pda）培养基；第二步所述线虫制备成悬浮液后再养于所述长有菌丝的培养基中。
所述的培养方法，其中第一步所述培养镰刀菌是在培养皿上进行，待菌丝长满培养皿后，用于培养所述线虫。
所述的培养方法，其中第二步中将线虫悬浮液均匀地分布于长满菌丝的培养基中，将培养容器用封口膜封好，将正置于25℃下暗培养。
所述的培养方法，优选地，所述接种量为1000条/皿（培养皿直径90mm）。
所述的培养方法，优选地，正置培养2～4d后将培养皿盖朝下放置，继续培养25-35后，即可收集到大量的线虫。
所述的培养方法，优选地，第二步中，所述线虫从病薯中分离。
所述的培养方法，第二步中，线虫悬浮液的具体制备方法如下：在漏斗上连一乳胶管，乳胶管的另一头连一指形管，将漏斗放在漏斗架上，漏斗内放一铁丝网，网上铺两层餐巾纸；将采集到的病薯用自来水冲洗干净，用刀切小块，轻轻放在纸上，从餐巾纸背面加入适量无菌水，使水漫过病害组织；24h后取下指型管，静置1-2min后，弃去上层水；然后用玻璃吸管将分离到的线虫转移至2ml离心管中；加入35%的蔗糖溶液后，以3000r/min离心2min；取表层线虫悬浮液，转移至无菌水中，以3000r/min离心2min，弃上清液；然后用0.5%次氯酸钠消毒2min后，移入0.5%青霉素和0.5%硫酸链霉素混合液中消毒10min，离心后吸出消毒液，用无菌水冲洗3遍后4℃保存备用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明根据腐烂茎线虫具有食真菌的习性，有针对性地选择培养该类线虫喜食的、可培养的真菌，采用马铃薯蔗糖琼脂（pda）培养基培养真菌，然后利用真菌菌丝培养腐烂茎线虫，以解决该类线虫可控制、可持续培养的问题，本发明可用于离体繁殖大量研究用腐烂茎线虫，也可用于腐烂茎线虫的保存。
2、本发明使用的镰刀菌生长迅速、容易培养，是较理想的线虫培养基质。培养得到的线虫纯度高、生活力强。
具体实施方式本发明利用真菌培养腐烂茎线虫的方法，其具体操作步骤如下：
一、pda培养基的制作：称取洗净、去皮的马铃薯薯块200g，切碎后加水1000ml煮沸半小时，用纱布滤去薯块，加入葡糖糖15g，琼脂15g，加水补足1000ml，加热使琼脂熔化。分装在三角瓶中，加塞后在121℃下灭菌20分钟。当培养基温度降至45℃左右时，分装至直径9cm培养皿，每皿培养基10-15ml。
二、镰刀菌的培养
将分离、纯化得到的镰刀菌（fusariumspp.）或保存的镰刀菌菌种在超净工作台上接种至pda平板培养基上，25℃培养恒温培养。待菌丝长满培养皿后，在超净工作台上用无菌的打孔器打取镰刀菌菌饼，用无菌的接种针或镊子将菌饼接入pda培养基上，置于25℃下恒温培养。
三、线虫悬浮液的制备：在漏斗上连一乳胶管，乳胶管的另一头连一指形管，将漏斗放在漏斗架上，漏斗内放一铁丝网，网上铺两层餐巾纸。将采集到的病薯用自来水冲洗干净，用刀切小块，轻轻放在纸上，从餐巾纸背面加入适量无菌水，使水漫过病害组织。24h后取下指型管，静置1-2min后，弃去上层水。然后用玻璃吸管将分离到的线虫转移至2ml离心管中。加入35%的蔗糖溶液后，以3000r/min离心2min；取表层线虫悬浮液，转移至无菌水中，以3000r/min离心2min，弃上清液。然后用0.5%次氯酸钠消毒2min后，移入0.5%青霉素和0.5%硫酸链霉素混合液中消毒10min，离心后吸出消毒液，用无菌水冲洗3遍后4℃保存备用。
四、茎线虫的接种和培养
待菌丝长满整个培养皿（一周左右）后，用移液枪将线虫悬浮液均匀地分布于长满菌丝的培养基中，接种量为1000条/皿（培养皿直径90mm），将培养皿用封口膜封好，将培养皿正置，于25℃下暗培养。培养2～3d后将培养皿盖朝下放置。继续培养30d后，即可收集到大量的线虫。