本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种用于大规模种植的白木香组织培养方法。
背景技术：
白木香(aquilariasinensis)，又名莞香、女儿香、土沉香，为瑞香科(thmelaceae)植物。白木香树为多年生常绿的木本植物，是香料及药用植物，也是我国唯一能够生产沉香的植物资源。野生资源主要分布在广西省、海南省和福建省等省市，有少部分分布在云南的西双版纳和思茅等地区。白木香树是一种名贵的药材，高级的香料，随着国际市场需求数量的增大，其价格也不断的上涨。上等沉香药材价格每公斤高达万元之上，使其在市场上供不应求。白木香其味辛、苦，性温，具纳气平喘、有止痛止吐的功效，主要用于治疗胃寒呕吐、肾虚气喘、胸腹涨闷疼痛。由此带来的过度伐木和采香，使得土沉香资源面临灭绝，白木香树1987年被评为国家珍稀濒危三级保护植物，其次1999年又被国家批准为国务院二级重点保护野生植物。
白木香树是属于自然野生树种，繁殖方式主要是通过种子繁殖，但目前野生成年的母树已经极其稀少，无法产生大量的种子，造成大面积推广种植较困难;而且种子繁殖的种苗较容易产生变异，难保留良种优势。
植物组织培养是一种将植物体的部分细胞或组织与母体分离，在适当的条件下加以培养，使它们能够生长、发育、分化与增殖的技术。原理是来自植物细胞的全能性分化能力，也就是植物体内的某一类细胞，能够独立发育并且分化成为完整的植物成体。植物组织培养能够以少量的母体培养出大量的植物，这使植物组织培养有许多的用途，例如基础植物学与遗传学研究，以及农业上的育种与品种保留。
现有技术如授权公告号为cn104686341b的中国发明专利，公开了一种白木香的组织培养技术，涉及白木香（aquilariasinensis）通过离体快繁技术获得优质种苗的育苗方法。该方法以白木香带芽茎段为外植体，经过外植体消毒、丛生芽诱导、生根培养、炼苗移栽等过程从而建立了白木香组织培养快速繁殖体系，加速白木香良种的推广和资源开发利用具有重要的现实意义。但上述方法中丛生芽的量少，长出的丛生芽颜色偏黄，生命力不旺盛。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种丛生芽的量多，得到的丛生芽叶大而绿，生命力旺盛的用于大规模种植的白木香组织培养方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：用于大规模种植的白木香组织培养方法，包括无菌苗培养、芽诱导及芽增殖、生根壮苗培养和炼苗移栽。无菌苗培养步骤包括将白木香种子胚先用无菌水清洗，再用70~80%酒精漂洗，无菌水清洗后再放入10~18%次氯酸钠中浸泡，再用无菌水清洗，并放入种子萌发培养基中。种子萌发培养基为添加了0.7~1.5mg/l的ga3的ms培养基。种子消毒较容易，污染率低，直接取白木香腋芽作为外植体消毒较困难，污染率高。
芽诱导和芽增殖步骤包括去除将幼苗子叶去掉，留下顶芽转接到添加0.7~1.5mg/l6-ba、0.07~0.15mg/lnaa、0.4~0.6mg/lkt和活性短肽的ms培养基，即芽诱导培养基中培养，形成丛生芽。选取无菌苗的顶芽为外植体缩短了丛生芽的诱导时间；子叶和不带芽的茎段只能诱导出大量的愈伤组织，所以外植体选为无菌苗顶芽。上述方法培育的丛生芽的量多，得到的丛生芽叶大而绿，生命力旺盛。
活性短肽的氨基酸序列为scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc。上述活性短肽可明显提高分化后细胞的增殖速度，得到的丛生芽的量多，叶大而绿，生命力旺盛。
芽诱导和芽增殖步骤包括将丛生芽转入添加0.04~0.06mg/lbap、27~34g/l蔗糖、0.07~0.14g/l肌醇和6~9g/l琼脂的ms培养基中继代培养，得到无根苗丛，将苗丛的无根苗从基部切割，并切成0.4~0.7cm长的小段，再将小段和切割后剩下的苗丛分别转入芽诱导培养基中培养，形成丛生芽，重复上述步骤得到大量的丛生芽和无根苗。
生根壮苗培养步骤为先将无根苗转移到添加0.8~1.5mg/liba和0.4~0.6mg/lnaa的1/2ms培养基中培养1~3d，再转入无生长素的1/2ms培养基中间接诱根产生。无根苗在生长素作用下形成较多的根原基，在无生长素的抑制作用下让根伸长并正常生长，从而解决了根原基的发生和根伸长之间的矛盾，并减少了愈伤组织的形成。采用上述方法诱导白木香外植体生根，不仅生根率较高，而且生根苗基部无愈伤组织，根系生长良好。
炼苗移栽步骤包括待生根的试管苗长至3~5cm高时，将试管苗置窗前散射光处3~5d再打开封口膜炼苗2~3d，接着从瓶中取出试管苗，用清水洗净粘附根系的培养液，转入到珍珠岩的基质中，淋足定根水，套上带小孔的塑料袋保湿防风，20~30d后移去塑料套，之后每隔1~2d喷水一次。试管苗叶片表面的角质层已形成，可有效抵抗低强度的光线照射及减少水分散失，但抗应激性弱，上述方法可提高白木香苗茎秆强度，增强抗猝能力。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.本发明方法培育白木香苗的时间短，得到的白木香苗病毒少、遗传性质稳定，得到的白木香枝条较粗，抗风性较强，生命力相比现有技术组织培养培育的白木香更为旺盛，成活率更高。
2.在芽分化培养基中加入氨基酸序列为scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc的活性短肽。上述活性短肽可明显提高分化后细胞的增殖速度，丛生芽的量多，得到的丛生芽叶大而绿，生命力旺盛。
3.无根苗在生长素作用下形成较多的根原基，在无生长素的抑制作用下让根伸长并正常生长，从而解决了根原基的发生和根伸长之间的矛盾，并减少了愈伤组织的形成。采用分阶段间接诱导白木香外植体生根的方法，不仅生根率较高，而且生根苗基部无愈伤组织，根系生长良好。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
用于大规模种植的白木香组织培养方法，包括无菌苗培养、芽诱导及芽增殖、生根壮苗培养和炼苗移栽。无菌苗培养步骤包括将白木香种子胚先用无菌水清洗，再用75%酒精漂洗，无菌水清洗后再放入12%次氯酸钠中浸泡，再用无菌水清洗，并放入种子萌发培养基中。种子萌发培养基为添加了1.2mg/l的ga3的ms培养基。种子消毒较容易，污染率低，直接取白木香腋芽作为外植体消毒较困难，污染率高。
芽诱导和芽增殖步骤包括去除将幼苗子叶去掉，留下顶芽转接到添加1.2mg/l6-ba、1.2mg/lnaa、0.5mg/lkt和活性短肽的ms培养基，即芽诱导培养基中培养，形成丛生芽。选取无菌苗的顶芽为外植体缩短了丛生芽的诱导时间；子叶和不带芽的茎段只能诱导出大量的愈伤组织，所以外植体选为无菌苗顶芽。上述方法培育的丛生芽的量多，得到的丛生芽叶大而绿，生命力旺盛。
活性短肽的氨基酸序列为scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc。上述活性短肽可明显提高分化后细胞的增殖速度，得到的丛生芽的量多，叶大而绿，生命力旺盛。
芽诱导和芽增殖步骤包括将丛生芽转入添加0.05mg/lbap、31g/l蔗糖、1.2g/l肌醇和8g/l琼脂的ms培养基中继代培养，得到无根苗丛，将苗丛的无根苗从基部切割，并切成0.5cm长的小段，再将小段和切割后剩下的苗丛分别转入芽诱导培养基中培养，形成丛生芽，重复上述步骤得到大量的丛生芽和无根苗。
生根壮苗培养步骤为先将无根苗转移到添加1.2mg/liba和0.5mg/lnaa的1/2ms培养基中培养2d，再转入无生长素的1/2ms培养基中间接诱根产生。无根苗在生长素作用下形成较多的根原基，在无生长素的抑制作用下让根伸长并正常生长，从而解决了根原基的发生和根伸长之间的矛盾，并减少了愈伤组织的形成。采用上述方法诱导白木香外植体生根，不仅生根率较高，而且生根苗基部无愈伤组织，根系生长良好。
炼苗移栽步骤包括待生根的试管苗长至3~5cm高时，将试管苗置窗前散射光处4d，再打开封口膜炼苗2d，接着从瓶中取出试管苗，用清水洗净粘附根系的培养液，转入到珍珠岩的基质中，淋足定根水，套上带小孔的塑料袋保湿防风，2,5d后移去塑料套，之后每隔1~2d喷水一次。试管苗叶片表面的角质层已形成，可有效抵抗低强度的光线照射及减少水分散失，但抗应激性弱，上述方法可提高白木香苗茎秆强度，增强抗猝能力。
实施例2：
用于大规模种植的白木香组织培养方法，包括以下步骤：
1）无菌苗培养：将白木香种子胚先用无菌水清洗，再用75%酒精漂洗，无菌水清洗后再放入15%次氯酸钠中浸泡，再用无菌水清洗，并放入种子萌发培养基中。种子萌发培养基为添加了1mg/l的ga3的ms培养基；
2）芽诱导和芽增殖：去除将幼苗子叶去掉，留下顶芽转接到添加1.0mg/l6-ba、1.0mg/lnaa、0.5mg/lkt和活性短肽的ms培养基，即芽诱导培养基中培养，形成丛生芽。活性短肽的氨基酸序列为scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc。将丛生芽转入添加0.05mg/lbap、30g/l蔗糖、1.0g/l肌醇和8g/l琼脂的ms培养基中继代培养，得到无根苗丛，将苗丛的无根苗从基部切割，并切成0.6cm长的小段，再将小段和切割后剩下的苗丛分别转入芽诱导培养基中培养，形成丛生芽，重复上述步骤得到大量的丛生芽和无根苗；
3）生根壮苗培养：先将无根苗转移到添加1.0mg/liba和0.5mg/lnaa的1/2ms培养基中培养2d，再转入无生长素的1/2ms培养基中间接诱根产生；
4）炼苗移栽：待生根的试管苗长至3~5cm高时，将试管苗置窗前散射光处4d，再打开封口膜炼苗2d，接着从瓶中取出试管苗，用清水洗净粘附根系的培养液，转入到珍珠岩的基质中，淋足定根水，套上带小孔的塑料袋保湿防风，2,5d后移去塑料套，之后每隔1~2d喷水一次。
实施例3：
用于大规模种植的白木香组织培养方法，包括以下步骤：
1）无菌苗培养：将白木香种子胚先用无菌水清洗，再用80%酒精漂洗，无菌水清洗后再放入13%次氯酸钠中浸泡，再用无菌水清洗，并放入种子萌发培养基中。种子萌发培养基为添加了1.1mg/l的ga3的ms培养基；
2）芽诱导和芽增殖：去除将幼苗子叶去掉，留下顶芽转接到添加1.1mg/l6-ba、1.1mg/lnaa、0.6mg/lkt和活性短肽的ms培养基，即芽诱导培养基中培养，形成丛生芽。活性短肽的氨基酸序列为scasvckshrarrcgsvfrcycrclrc。将丛生芽转入添加0.06mg/lbap、32g/l蔗糖、1.1g/l肌醇和7g/l琼脂的ms培养基中继代培养，得到无根苗丛，将苗丛的无根苗从基部切割，并切成0.6cm长的小段，再将小段和切割后剩下的苗丛分别转入芽诱导培养基中培养，形成丛生芽，重复上述步骤得到大量的丛生芽和无根苗；
3）生根壮苗培养：先将无根苗转移到添加1.1mg/liba和0.5mg/lnaa的1/2ms培养基中培养2d，再转入无生长素的1/2ms培养基中间接诱根产生；
4）炼苗移栽：待生根的试管苗长至3~5cm高时，将试管苗置窗前散射光处4d，再打开封口膜炼苗2d，接着从瓶中取出试管苗，用清水洗净粘附根系的培养液，转入到珍珠岩的基质中，淋足定根水，套上带小孔的塑料袋保湿防风，2,5d后移去塑料套，之后每隔1~2d喷水一次。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>浦江县美泽生物科技有限公司
<120>用于大规模种植的白木香组织培养方法
<130>1
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>27
<212>prt
<213>人工合成
<400>1
sercysalaservalcyslysserhisargalaargargcysglyser
151015
valpheargcystyrcysargcysleuargcys
2025