一种延长浮萍种质无菌保存的存活时间的方法与流程

本发明涉及植物种质资源保存领域，尤其涉及一种延长浮萍种质无菌保存的存活时间的方法。

背景技术：

随着矿物能源消耗和生态环境问题的日益严重，研究、开发和利用可再生能源是人类社会、经济发展的大势所趋。生物质能作为可再生能源的重要组成部分，越来越受到世界各国的重视。2007年，国家发改委发布《可再生能源中长期发展规划》，明确将生物质能源作为我国可再生能源发展的重点领域，力争到2020年生物质发电达到3000万千瓦，沼气年利用总量达到443亿立方米，燃料乙醇的年生产能力达到1000万吨，生物柴油的年生产能力达到200万吨。然而，实现上述目标并不是一件容易的事情。由于发展生物燃料需要消耗一定量的农作物，在目前还没有大规模发展的今天，生物燃料已经产生了与食物“争地盘”的矛盾，使粮食和食用油的价格大幅上涨。例如，马来西亚和印度尼西亚一直是世界领先的棕榈油生产国，由于利用棕榈油生产生物柴油，造成食用油价格大幅上涨。美国虽然是粮食出口大国，近年由于发展生物乙醇，其玉米期货价格在2007年上涨75％。因此，如何解决吃饱肚子和发展生物能源的矛盾是各国决策者需要面对的难题。

浮萍浮萍科(lemnaceae)植物的统称，是一种常见的水生植物，具有生长速度快，淀粉含量高，能分解、吸收、转化氮、磷和有机物，木质素含量极低以及纤维素较易转化为乙醇等诸多优点，在城市污水和农业、渔业废水处理以及生物质能源领域的应用前景广泛。与曾寄予厚望的能源微藻相比，浮萍具有容易收获及不怕污染等优点，是一种综合利用价值极高的新型能源植物。《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》将可再生能源低成本规模化开发利用、综合治污与废弃物循环利用、水产健康养殖列为优先主题。党的“十八大”将生态文明建设列入建设中国特色社会主义“五位一体”(即经济、政治、文化、社会、生态)的总体布局中。切实搞好生态环境保护工作具有战略性重要意义。由于城市的扩张和养殖业的发展，市政污水和养殖业废水已成为生态环境的威胁。

然而，浮萍目前还没有形成产业。其能否形成产业的关键之一是大量收集现有的浮萍种质资源，开展浮萍的遗传育种工作，培育出针对不同应用目的品种。因此，浮萍种质资源的保存具有重要意义。全球浮萍共有5个属37个种，分布在不同的国家地区。我国约有10个物种。国内外浮萍种质资源已保存6000多份，都是采用活体无菌保存，每隔一段时间就要转入新鲜的培养基中，因此，需要消耗大量的人力和财力。由于有些物种较难保存，可能在较短的时间(比如1个月)就死亡，因此，常出现种质资源丢失的情况。例如：浮萍科植物中最小的微小芜萍(学名为wolffiamicroscopica)，用浮萍常用的培养基保存，在一个月内就死亡，常常需要2个星期就换1次培养基。这一问题直接导致该物种曾经在全球所有的种质资源库中消失了20多年，直到2014年才在印度和孟加拉国重新发现并收集保存。

可见，延长浮萍种质资源的活体保存时间能节省人力和财力，更能为浮萍遗传育种工作提供技术保障。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于一种延长浮萍种质无菌保存的存活时间的方法。本发明提供的方法能够将浮萍的种质的存活期延长，有些浮萍种质的存活期延长5倍以上。

本发明提供了椰子水在浮萍种质保存中的应用。

浮萍的种质保存采用活体无菌保存的方式，其在保存过程中，存在无性生殖的现象，但不会产生愈伤组织、器官或胚胎发育现象。浮萍在活体无菌保存时的生存介质通常与自然界浮萍生长的环境相似，不同的是活体保存的介质经过消毒处理，并提供更为充分的营养物质，配合适宜的保存条件使浮萍能够健康的存活并得以保存。

椰子水是椰子坚果腔内的液态胚乳，主要成分是糖、矿物质、蛋白质、氨基酸及其他微量成分。椰子水广泛的应用于食品或生物、医药领域。本发明通过实验发现，在浮萍的种质保存培养基中添加质量分数为5％～20％椰子水，可以使浮萍保存期延长1～5倍。

本发明实验涉及的浮萍种类包括：wolffiamicroscopica(微小芜萍)、wolffiaglobosa(球状芜萍)、wolffiaarrhiza、wolffiaelongata、wolffiabrasiliensis、wolffiaaustraliana、wolffiacolumbiana、wolffiaangusta、wolffiaborealis、wolffianeglecta或wolffiacylindracea。

实验表明，采用含有椰子水的培养基培养浮萍，4个月不更换培养基，浮萍植株死亡率不超过20％；在30天存活率方面，椰子水对微小芜萍的保护效果显著优于对其他浮萍的保存效果。

本发明提供了一种浮萍种质保存培养基，其特征在于，包括椰子水和植物种质保存培养基；其中椰子水的质量分数为5％～20％。具体的，椰子水的质量分数为5％、10％或20％。

以微小芜萍为例，在培养基中添加质量分数为5％的椰子水，微小芜萍存活率下降10％的时间为2.5个月；添加质量分数10％的椰子水，存活率下降10％的时间为3个月，此后，进一步添加椰子水至质量分数为20％，相对于添加10％的实验组，浮萍在4个月内存活率变化不大。出于节约成本的考虑，椰子水的添加量为5％～20％；优选为10％～20％。

本发明中所述植物种质保存培养基为n培养基、sh培养基、e培养基、或mh培养基。

本发明实施例中，所述植物种质保存培养基的浓度为100％或50％。

培养基的浓度为100％即指采用完整培养基，培养基浓度为50％即指采用1/2稀释的培养基。具体的，植物种质保存培养基为n培养基、1/2n培养基、sh培养基、1/2sh培养基、e培养基、1/2e培养基、mh培养基、或1/2mh培养基。

所述培养基为固体培养基，琼脂糖含量为6g/l，ph＝5.7。

本发明还提供了一种浮萍的保存方法，将浮萍接种至本发明所述的浮萍种质保存培养基，24℃～28℃培养，光照强度为1800lx～2200lx，每1～4个月更换新鲜培养基。

本发明实施例中，所述浮萍为wolffiamicroscopica、wolffiaglobosa、wolffiaarrhiza、wolffiaelongata、wolffiabrasiliensis、wolffiaaustraliana、wolffiacolumbiana、wolffiaangusta、wolffiaborealis、wolffianeglecta或wolffiacylindracea。

本发明的培养的温度为26℃；光照强度为2000lx。

本发明中，将浮萍整株接种至培养基。培养采用培养皿为培养容器。以直径为6cm的培养皿为例，将浮萍接种于培养基的中央，每皿接种2～5株。

本发明研究表明，将椰子水添加入常用的浮萍种质资源保存培养基中，用常规培养条件培养，可使浮萍的保存期延长1～5倍。如此，便可将更换培养基的频率降低1～5倍。不仅减少了频繁更换培养基带来的大量工作，也降低了浮萍的保存成本，更重要的是，能够避免因更换不及时造成的种质资源丢失问题。

附图说明

图1示微小芜萍在含0％(左)、5％(中)、10％(右)椰子水的mh培养基中培养30天的情况；在不加椰子水(0％)的对照培养基中，微小芜萍几乎全部死亡，而添加椰子水的培养基中浮萍生长良好，植物群落直径大于对照；

图2示微小芜萍在含10％(左)、0％(右)椰子水的mh培养基中培养4个月的情况；在不加椰子水(0％)的对照培养基中，微小芜萍早已全部死亡，而添加椰子水的培养基中浮萍还有80％的成活率，生长良好，植物群落直径大于对照。

具体实施方式

本发明提供了一种延长浮萍种质无菌保存的存活时间的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

mh培养基：nh4no380mg/l，kno3506mg/l，kh2po4136mg/l，mgso4.7h2o493mg/l，ca(no3)2.4h2o954mg/l，h3bo36.2mg/l，mnso4.h2o16.9mg/l，znso4.7h2o8.6mg/l，cuso4.5h2o0.025mg/l，na2moo4.2h2o0.25mg/l，ki0.83mg/l，cocl2.6h2o0.025mg/l，feso4.7h2o27.8mg/l，na2edta37.3g/l，椰子水质量分数0％～20％，琼脂粉6g/l，ph值为5.7。

1/2mh培养基：nh4no340mg/l，kno3253mg/l，kh2po468mg/l，mgso4.7h2o247mg/l，ca(no3)2.4h2o477mg/l，h3bo33.1mg/l，mnso4.h2o8.45mg/l，znso4.7h2o4.3mg/l，cuso4.5h2o0.013mg/l，na2moo4.2h2o0.13mg/l，ki0.42mg/l，cocl2.6h2o0.013mg/l，feso4.7h2o13.9mg/l，na2edta18.7g/l，椰子水质量分数0％～20％，琼脂粉6g/l，ph值为5.7。

n培养基：kno3809mg/l，kh2po420.4mg/l，mgso4.7h2o246.5mg/l，ca(no3)2.4h2o,236.13mg/l，h3bo30.309mg/l，mncl2.4h2o2.5725mg/l，na2moo4.2h2o0.047mg/l，fenaedta9.175mg/l，椰子水质量分数0％～20％，琼脂粉6g/l，ph值为5.7。

1/2n培养基：kno3404.5mg/l，kh2po410.21mg/l，mgso4.7h2o123.25mg/l，ca(no3)2.4h2o118.1mg/l，h3bo30.15mg/l，mncl2.4h2o1.29mg/l，na2moo4.2h2o0.024mg/l，fenaedta4.59mg/l，椰子水质量分数0％～20％，琼脂粉6g/l,ph值为5.7。

sh培养基：kno31250mg/l，(nh4)h2po4150mg/l，mgso4.7h2o200mg/l，cacl275.5mg/l，ki0.5mg/l，h3bo32.5mg/l，mnso4.h2o5mg/l，znso4.7h2o0.5mg/l，na2moo4.2h2o0.05mg/l，cuso4.5h2o0.1mg/l，cocl2.6h2o0.05mg/l，na2edta.2h2o10.2mg/l，fenaedta99mg/l，椰子水质量分数0％～20％，琼脂粉6g/l,ph值为5.7。

1/2sh培养基：kno3625mg/l，(nh4)h2po475mg/l，mgso4.7h2o100mg/l，cacl237.75mg/l，ki0.25mg/l，h3bo31.25mg/l，mnso4.h2o2.5mg/l，znso4.7h2o0.25mg/l，na2moo4.2h2o0.025mg/l，cuso4.5h2o0.05mg/l，cocl2.6h2o0.025mg/l，na2edta.2h2o5.1mg/l，fenaedta49.5mg/l，椰子水质量分数0％～20％，琼脂粉6g/l,ph值为5.7。

e培养基：kno31515mg/l，kh2po468mg/l，mgso4.7h2o493mg/l，ca(no3)2.4h2o1181mg/l，h3bo32.86mg/l，mncl2.4h2o3.62mg/l，znso4.7h2o0.22mg/l，cuso4.5h2o0.08mg/l，na2moo4.2h2o0.12mg/l，fecl3.6h2o5.4mg/l，edta8.77g/l，酒石酸3g/l，椰子水质量分数0％～20％，琼脂粉6g/l，ph值为5.7。

1/2e培养基：kno3757.5mg/l，kh2po434mg/l，mgso4.7h2o246.5mg/l，ca(no3)2.4h2o590.5mg/l，h3bo31.43mg/l，mncl2.4h2o1.81mg/l，znso4.7h2o0.11mg/l，cuso4.5h2o0.04mg/l，na2moo4.2h2o0.06mg/l，fecl3.6h2o2.7mg/l，edta45.38g/l，酒石酸1.5g/l，椰子水质量分数0％～20％，琼脂粉6g/l，ph值为5.7。

培养基在121℃灭菌20分钟，在超净工作台上倒平板，室温冷却凝固。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

将继代培养的浮萍种质接种至上述含椰子水的平板培养基中央，以不含椰子水的培养基为对照。将接种好的浮萍种质放置于26℃培养室培养，光照强度为2000lx。每周观察一次浮萍的生长状况。

表1浮萍生长状况

注：表中a列示30天存活率(％)；b列示存活率下降10％经历的时间(月)

实验结果表明，在不含椰子水的培养基上，浮萍30天存活率非常低，而在含有椰子水的培养基上，各种浮萍的30天存活率都达到100％，10％死亡率的时间也得到了延长。其中最为效果最为显著的是微小芜萍。

微小芜萍培养2周左右开始死亡，在常用的mh和sh培养基上，30天时仍然存活的浮萍植株非常少，有些平板中甚至没有存活的浮萍。而在含有椰子水的培养基中培养30天，微小芜萍没有出现死亡现象。4个月后，死亡的浮萍个体也很少，因此，采用添加5％～20％椰子水的培养基保存浮萍种质，可以将微小芜萍的保存周期延长4倍以上。在30天存活率的效果方面，椰子水对微小芜萍的保存效果显著优于对其他浮萍种质的保存效果，具有统计学差异，p<0.05。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。