一种海滨木槿组培再生的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种海滨木槿组培再生的方法。

背景技术：

海滨木槿(hibiscushamabosieb.etzucc.)为锦葵科木槿属落叶小乔木，原产浙江舟山、宁波等沿海一带，其树冠浓密，花金黄色，花形大而色泽艳丽，花期长，入秋后叶片变红，季相变化明显，且枝条富有韧性，耐修剪，是一种十分珍贵的观花观叶园林绿化树种；此外，海滨木槿还具有惊人的抗逆能力，不但能耐盐碱和海水侵袭，还具有很强的耐旱、耐贫瘠和抗风能力，是一种颇具发展潜力的防护树种，在环境治理和盐碱地改良方面具有十分重要的作用。

近几十年来，因围海造地等多种原因，人为破坏严重，海滨木槿已处于濒危灭绝境地，被列为浙江珍稀濒危树种。目前在生产上，海滨木槿主要采用播种繁殖，但由于海滨木槿种子种壳坚硬，吸水困难，导致自然条件下种子萌发时间延迟且易腐烂，萌发率仅在10％左右；此外，利用种子育苗时还存在性状分离和遗传变异等问题，很难保持母本株系的优良性状。扦插和嫁接技术在海滨木槿繁育方面的应用虽有报道，但存在繁育过程繁琐，受季节限制，且繁殖效率低等问题。植物组织培养技术因其具有繁育周期短，繁殖系数高，所需要的外植体材料少等优势，在濒危植物的繁育中起着重要作用。

目前，有关海滨木槿组培繁育的研究尚属空白状态。为了满足规模化种植和品种改良对海滨木槿优质种苗的需求，急需开发一种简单、稳定、高效的海滨木槿组培再生的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种简单、稳定、高效的海滨木槿组培再生的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种海滨木槿组培再生的方法，包括如下步骤：

(1)以海滨木槿的当年生未木质化枝条为外植体来源，经表面消毒后，切成适宜大小的切段；

(2)接种于添加有不同种类和浓度植物生长调节剂的培养基中，于适宜的光照和温度条件下依次进行腋芽的萌发、增殖、不定芽的伸长和生根诱导培养；

(3)获得根系健壮的海滨木槿再生植株。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中海滨木槿为取材于野外的具有优良农艺性状的多年生海滨木槿植株。

作为本发明的优选方式之一，所述具有优良农艺性状的多年生海滨木槿植株指具有高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状的多年生海滨木槿植株株系。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中表面消毒是指将海滨木槿的当年生枝条经流水冲洗10-30min，用74-76％无水乙醇擦拭后，于无菌操作台中用74-76％无水乙醇消毒15-50s；然后经10-20％的过氧化氢溶液消毒2-8min后，再用0.05-0.15％升汞溶液消毒2-5min，最后用无菌水冲洗5-6遍。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中切成适宜大小的切段是指将消毒后的海滨木槿茎段切成至少带有1个腋芽的长为0.5-1.0cm大小的切段，备用。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中添加有不同种类和浓度植物生长调节剂的培养基分别为用于茎段腋芽萌发诱导的诱导培养基、用于茎段腋芽增殖的增殖培养基、用于不定芽伸长的伸长培养基及用于不定芽生根的生根培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述诱导培养基具体为添加有0.1-3.0mg/lkt、0.05-0.5mg/lga3、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的wpm培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述增殖培养基具体为添加有0.5-2.0mg/lkt、0.1-1.0mg/ltdz、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的wpm培养基；所述伸长培养基具体为添加有0.2-1.0mg/l6-ba、0.1-0.5mg/liba、0.05-0.5mg/lga3、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的1/2wpm培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述生根培养基具体为添加有0.5-2.0mg/liaa、0.2-4.0mg/liba、20g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的1/2wpm培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中适宜的光照和温度条件是指将培养物置于温度为22-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照/黑暗周期为16/10h的恒温培养室进行培养。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)均在无菌条件下进行。

本发明相比现有技术的优点在于：其一，取材方便、材料丰富，且不受季节限制，满足海滨木槿规模化种植的需求；其二，再生效率高，繁殖系数大，腋芽萌发率高达100％，腋芽经过增殖培养后，增殖率高达96.8％，且平均每个外植体可产生7.4个不定芽，后期不定芽的生根率高达100％；其三，以所获得的组培再生苗的茎段为外植体，可进一步实现对海滨木槿植株的扩大繁殖。因此，本发明所提供的一种海滨木槿组培再生的方法，不仅为海滨木槿的快速繁殖和规模化生产提供了技术支撑，同时也为后期利用分子生物学手段对其进行遗传改良提供重要的技术支持。

附图说明

图1是实施例1中的接种于诱导培养基中的海滨木槿茎段图；

图2是实施例1中的海滨木槿茎段腋芽萌发图；

图3是实施例1中的海滨木槿腋芽增殖图；

图4是实施例1中的海滨木槿不定芽伸长图；

图5是实施例1中的海滨木槿组培苗生根图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种海滨木槿组培再生的方法，均在无菌条件下进行，包括如下步骤：

(1)从野外选取具有优良农艺性状(具备高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状)的多年生海滨木槿植株株系，剪取当年生未木质化枝条作为外植体的来源；

(2)枝条去叶后，剪切成5cm大小的茎段，进行表面消毒；表面消毒后，将茎段两端坏死部位切除，再将茎段切成至少带有1个腋芽的长为0.7cm大小的切段，备用；其中，表面消毒的方式为：将海滨木槿的当年生枝条经流水冲洗20min，用75％无水乙醇擦拭后，于无菌操作台中用75％无水乙醇消毒30s；然后经15％的过氧化氢溶液消毒4min后，再用0.1％升汞溶液消毒3min，最后用无菌水冲洗6遍；

(3)将得到的海滨木槿茎段切段竖直接种于wpm+1.5mg/lkt、0.25mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的诱导培养基中进行茎段腋芽的萌发诱导(图1)，恒温培养室中光照培养(温度24℃，光照强度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)2周后，腋芽的萌发率高达100％(图2)；

(4)待腋芽萌发后，将茎段转接于wpm+1.0mg/lkt+0.5mg/ltdz+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的增殖培养基中进行腋芽的增殖培养；恒温培养室中光照培养(温度24℃，光照强度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周后，腋芽的增殖率高达96.8％，且平均每个外植体产生7.4个不定芽(图3)；

(5)待不定芽长至1.0cm，将不定芽转接于1/2wpm+0.6mg/l6-ba+、0.35mg/liba+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的伸长培养基中进行不定芽的伸长培养；恒温培养室中光照培养(温度24℃，光照强度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)2周后，不定芽伸长至2.0-3.0cm并伴有2-6片真叶(图4)；

(6)将伸长的不定芽转接于1/2wpm+1.0mg/liaa+2.0mg/liba+20g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的生根培养基中进行不定芽的生根诱导；恒温培养室中光照培养(温度24℃，光照强度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周后，获得伴有白色健壮根系的海滨木槿完整植株，生根率高达100％且平均每个外植体产生6.2条不定根(图5)。

实施例2

本实施例的一种海滨木槿组培再生的方法，均在无菌条件下进行，包括如下步骤：

(1)从野外选取具有优良农艺性状(具备高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状)的多年生海滨木槿植株株系，剪取当年生未木质化枝条作为外植体的来源；

(2)枝条去叶后，剪切成5cm大小的茎段，进行表面消毒；表面消毒后将茎段切成至少带有1个腋芽的长为0.5cm大小的切段，备用；其中，表面消毒的方式为：将海滨木槿的当年生枝条经流水冲洗10min，用74％无水乙醇擦拭后，于无菌操作台中用74％无水乙醇消毒15s；然后经10％的过氧化氢溶液消毒2min后，再用0.05％升汞溶液消毒2min，最后用无菌水冲洗5遍；

(3)将得到的海滨木槿茎段切段竖直接种于wpm+0.1mg/lkt、0.05mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的诱导培养基中，并于恒温培养室中光照培养(温度22℃，光照强度2000lx，光照/黑暗周期16/10h)1周，进行茎段腋芽的萌发诱导；

(4)待腋芽萌发后，将茎段转接于wpm+0.5mg/lkt+0.1mg/ltdz+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的增殖培养基中，并于恒温培养室中光照培养(温度22℃，光照强度2000lx，光照/黑暗周期16/10h)2周，进行腋芽的增殖培养；

(5)待不定芽长至1.0cm左右，将不定芽转接于1/2wpm+0.2mg/l6-ba+、0.1mg/liba+0.05mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的伸长培养基中，并于恒温培养室中光照培养(温度22℃，光照强度2000lx，光照/黑暗周期16/10h)1周，进行不定芽的伸长培养；

(6)将伸长的不定芽转接于1/2wpm+0.5mg/liaa+0.2mg/liba+20g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的生根培养基中，并于恒温培养室中光照培养(温度22℃，光照强度2000lx，光照/黑暗周期16/10h)2周，进行不定芽的生根诱导；最终获得伴有白色健壮根系的海滨木槿完整植株。

实施例3

本实施例的一种海滨木槿组培再生的方法，均在无菌条件下进行，包括如下步骤：

(1)从野外选取具有优良农艺性状(具备高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状)的多年生海滨木槿植株株系，剪取当年生未木质化枝条作为外植体的来源；

(2)枝条去叶后，剪切成5cm大小的茎段，进行表面消毒；表面消毒后将茎段切成至少带有1个腋芽的长为1.0cm大小的切段，备用；其中，表面消毒的方式为：将海滨木槿的当年生枝条经流水冲洗30min，用76％无水乙醇擦拭后，于无菌操作台中用76％无水乙醇消毒50s；然后经20％的过氧化氢溶液消毒8min后，再用0.15％升汞溶液消毒5min，最后用无菌水冲洗6遍；

(3)将得到的海滨木槿茎段切段竖直接种于wpm+3.0mg/lkt、0.5mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的诱导培养基中，并于恒温培养室中光照培养(温度26℃，光照强度2500lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，进行茎段腋芽的萌发诱导；

(4)待腋芽萌发后，将茎段转接于wpm+2.0mg/lkt+1.0mg/ltdz+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的增殖培养基中，并于恒温培养室中光照培养(温度26℃，光照强度2500lx，光照/黑暗周期16/10h)4周，进行腋芽的增殖培养；

(5)待不定芽长至1.0cm左右，将不定芽转接于1/2wpm+1.0mg/l6-ba+、0.5mg/liba+0.5mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的伸长培养基中，并于恒温培养室中光照培养(温度26℃，光照强度2500lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，进行不定芽的伸长培养；

(6)将伸长的不定芽转接于1/2wpm+2.0mg/liaa+4.0mg/liba+20g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的生根培养基中，并于恒温培养室中光照培养(温度26℃，光照强度2500lx，光照/黑暗周期16/10h)4周，进行不定芽的生根诱导；最终获得伴有白色健壮根系的海滨木槿完整植株。

实施例4

本实施例测试了茎段生长状态对海滨木槿腋芽萌发及增殖的影响，具体步骤如下：

(1)从野外选取具有优良农艺性状(具备高产、优质、抗逆性好中一种或几种性状)的多年生海滨木槿植株株系，分别剪取当年的未木质化、半木质化和木质化的枝条作为外植体的来源；

(2)枝条去叶后，剪切成5cm大小的茎段，进行表面消毒；表面消毒后，将茎段两端坏死部位切除，再将茎段切成至少带有1个腋芽的长为0.7cm大小的切段，备用；其中，表面消毒的方式为：将海滨木槿的当年生枝条经流水冲洗10min，用75％无水乙醇擦拭后，于无菌操作台中用75％无水乙醇消毒15s；然后经10％的过氧化氢溶液消毒2min后，再用0.1％升汞溶液消毒2min，最后用无菌水冲洗5遍；

(3)将得到的海滨木槿茎段切段竖直接种于wpm+1.5mg/lkt、0.25mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的诱导培养基中，恒温培养室中光照培养(温度24℃，光照强度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，进行茎段腋芽的萌发诱导；

(4)待腋芽萌发后，将茎段转接于wpm+1.0mg/lkt+0.5mg/ltdz+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的增殖培养基中，恒温培养室中光照培养(温度24℃，光照强度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，进行腋芽的增殖培养；

(5)待不定芽长至1.0cm，将不定芽转接于1/2wpm+0.6mg/l6-ba+、0.35mg/liba+0.3mg/lga3+30g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的伸长培养基中，恒温培养室中光照培养(温度24℃，光照强度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，进行不定芽的伸长培养；

(6)将伸长的不定芽转接于1/2wpm+1.0mg/liaa+2.0mg/liba+20g/l蔗糖+7.0g/l琼脂的生根培养基中，恒温培养室中光照培养(温度24℃，光照强度2200lx，光照/黑暗周期16/10h)3周，进行不定芽的生根诱导。

统计茎段不同生长状态对海滨木槿腋芽萌发和增殖的影响，结果如表1所示。

表1茎段生长状态对海滨木槿腋芽萌发和增殖的影响

注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。

表1研究表明：茎段不同生长状态对海滨木槿腋芽萌发无影响，但对腋芽的增殖具有一定影响。以木质化的茎段为外植体，腋芽的增殖效果最差，增殖率仅为43.4％，且平均每个外植体仅可产生1.5个不定芽。而以处于未木质化和半木质化的海滨木槿茎段为外植体，腋芽的增殖效果较好，且无明显差异。其中以处于未木质化状态的茎段为外植体，腋芽的增殖率高达90.5％，且平均每个外植体可产生4.7个不定芽。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。