一种通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法与流程

本发明属于水产养殖技术领域，尤其涉及一种通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法。

背景技术：

中国鲎(tachypleustridentatus)，又名三刺鲎，隶属于节肢动物门(arthropoda)、有螯亚门(chelicerata)、肢口(merostomata)、剑尾目(xi-phosura)、鲎科(limulidae)、东方鲎属(tachypleus)，是西太平洋沿岸的暖水性底栖动物，最早出现在距今近4亿年的古生代奥陶纪，主要分布于日本的濑户内海和九州岛、中国东南沿海、中国台湾岛西岸、越南、菲律宾各地、苏门答腊岛印度洋侧，爪哇岛东部，马来西亚的北婆罗州、加里曼丹岛的东岸及北岸。现存鲎的种类少、分布狭窄，根据其形态和分布特点可分为二亚科三属四种。其中limulidae亚科仅有美洲鲎属(limulus)，美洲鲎(l.polyphemus)一种，分布于北美洲东海岸水域；而tachypleinae亚科有二属，分布于亚洲东南岸及东岸沿海水域。其中东方鲎属(tachypleus)有两种:中国鲎(t.tridentatus)和巨鲎(t.gigas)；蝎鲎属(carcinoscorpius)仅一种圆尾鲎(c.rotundicauda)。另外，至少还有十几种已经成为化石的种类分布在北美、欧洲、亚洲、澳洲等地。鲎被称为“活化石”，是因为其形态结构经历了近4亿年至今都没有多大变化，还保持着原本特有的生态习性：如成体略呈卵圆形，成年鲎体长约50厘米，体高约10厘米，尾细长，略短于体长，呈三角形；背壳坚硬，壳面净滑如青瓷，呈青黑色，眼细小生在背上，口在腹部，腹部两旁有脚六对。雌常背负雄体。每年初夏开始成对从海中爬上沙滩产卵，深人沙中5-10厘米，每年产卵可达万个。常离海可以生存十天左右，产卵后回到深海。从卵孵化出幼鲎开始，须经过5-7次蜕壳，整个生长期为10-14年。幼鲎喜欢以小型多毛类为食；大的未成年鲎及成年个体多以双壳类软体动物、环节动物、星虫等蠕虫及海豆芽等为食。这种古老的海洋底栖动物具有重要的经济和科研价值:它是一种美味的海产食品；其肉、壳、胆、尾、卵、血均可入药，可治疗白内障、青光眼、胃炎、皮肤过敏、跌打损伤、肺结核咯血、高热等；鲎是研究受精和胚胎发育的理想材料]；其血淋巴及其内含物具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等生物活性，是生产鲎试剂的原料；其视觉器官是电子仿生学研究很好的材料，如复眼是雷达研究的原型，与国防工业关系密切；其甲壳可提取甲壳素和壳聚糖，用于生产人造皮肤；等等。目前，中国鲎的地理分布、生活习性、生长生态特征、资源价值调查研究资料已基本完善，保育研究工作也进行到了繁殖、胚胎发育、人工授精育苗等更深层次。而近年来由于人们利益熏心和监管部门监管不力，在其产地许多单位和个人都在进行大量的收购和捕杀，以及社会的发展导致环境污染日益扩大，严重影响了中国鲎的生存和繁衍，致使中国鲎数目急剧下降，资源濒临枯竭；因此在中国鲎被列为国家二级保护动物，在其天然产地的保护工作迫在眉睫。敌百虫是一种有机磷农药，多数用于杀灭水体中的细菌、寄生虫等敌害生物，为人工育苗、养殖保障一个少害的水质条件，但在其生产和使用中，有大量的有毒废水进入水环境，对水生生物造成危害，破坏水域生态环境；在养殖业迅速发展的今天，敌百虫等有机磷农药的使用越来越频繁，了解并正确使用其安全浓度十分重要。

综上所述，现有技术存在的问题是：敌百虫的有毒废水进入水环境，对水生生物造成危害，破坏水域生态环境。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法。

本发明是这样实现的，一种通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法，所述通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法包括：

敌百虫的安全浓度为0.3813g/l；

96h，2.0g/l以下敌百虫浓度组幼鲎存活率100％；

12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h，敌百虫对中国鲎的lc50分别为0、7.88g/l、5.912g/l、5.912g/l、5.912g/l、4.143g/l、4.038g/l、3.813g/l。

进一步，所述通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法采用敌百虫毒性试验和spss17.0社会学统计软件进行方差分析检验其差异显著性；用lsr法的新复极差检验法进行组间多重比较，用probit法求出12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的lc50浓度。

进一步，所述通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法计算存活率公式如下：

s：存活率；a：各个容器中存活的鲎苗个数；b：各个容器鲎苗总数；

不同时间段存活时间计算公式如下：

其中，h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7分别表示24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时鲎苗存活时间，a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8分别表示鲎苗存活12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的个数。

进一步，所述通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法不同浓度的敌百虫在不同时间段下的毒力回归方程为：

24hy＝5.504+12.356x；

36hy＝8.574+2.848x；

48hy＝8.574+2.848x；

60hy＝8.574+2.848x；

72hy＝6.740+6.459x；

84hy＝6.903+6.441x；

96hy＝7.042+5.212x。

本发明的优点及积极效果为：设置5个浓度梯度进行96h的敌百虫对中国鲎第i期幼体(约0.0235g)存活率影响的急性毒性试验，结果发现：96h，2.0g/l以下敌百虫浓度组幼鲎存活率100％；4.0g/l以上浓度组与对照组(0g/l)差异显著(p<0.05)。12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h，敌百虫对中国鲎的lc50分别为0、7.88、5.912、5.912、5.912、4.143、4.038、3.813g/l；安全浓度为0.3813g/l。试验验证了敌百虫对中国鲎幼体的毒副作用较弱，中毒症状主要表现为生物活性降低。本发明的敌百虫(即有机磷类化合物)对中国鲎第i期幼体的急性毒性试验，通过科学的方案设计，严谨的试验操作，旨在找出有机磷类化合物对中国鲎第i期幼体存活影响的安全浓度，以及敌百虫对中国鲎第i期幼体生存影响的强弱；为中国鲎的保种育苗以及人工饲养的水质方面提供合理可靠的试验依据参考。

附图说明

图1是本发明实施例提供的通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的中国鲎第i期幼体在不同时间段不同浓度的敌百虫溶液下的存活率示意图。

图3是本发明实施例提供的敌百虫对中国鲎幼体的lc50示意图。

图4是本发明实施例提供的敌百虫不同时间段中国鲎第i期幼体存活时间的影响示意图。

图5是本发明实施例提供的敌百虫恢复后对中国鲎第i期幼体存活率的影响示意图。

图6是本发明实施例提供的敌百虫恢复后对中国鲎第i期幼体的存活时间的影响示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的通过控制敌百虫浓度提高中国鲎幼体存活率的方法包括以下步骤：

s101：经预试验后，设置0g/l(对照)、0.5g/l、1.0g/l、2.0g/l、4.0g/l、8.0g/l共6个敌百虫浓度梯度，由25度海水溶解配制而成。每浓度梯度设置3个平行，每个平行10只鲎苗，共计180只鲎；

s102：采用spss17.0社会学统计软件进行方差分析(one-wayanova)检验其差异显著性；用lsr法的新复极差检验(ssr检验)法(duncan法)进行组间多重比较，p<0.05为差异显著；用probit法求出12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的lc50浓度；另外用excel2010软件进行绘图；

s103：计算存活率、不同时间段存活时间。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1中国鲎第i期幼体

鲎苗购买于湛江人工育苗场，平均每个体重大约0.0235g，放在盐度25的海水中打氧备用。试验时挑选腹肢健全、活性好、大小均匀的鲎苗来做试验。

1.1.2海水及养殖桶

海水为经沙滤的天然海水，再经400目筛绢网过滤备用，盐度为25-26，ph为8.03。养殖容器为13.6×13.6×19cm，容量大约为4l的塑料方桶，试验前用高锰酸钾浸泡1h后用自来水洗净，并用上述海水润洗，试验时准确装入2l上述海水，并打氧。

1.1.3药品

90％敌百虫(可溶性粉剂)，产于浙江平湖农药厂。

1.1.4仪器工具

溶氧仪、ph计、盐度计、烧杯、玻璃分针、网捞

1.2方法

1.2.1敌百虫毒性试验

经预试验后，本试验设置0g/l(对照)、0.5g/l、1.0g/l、2.0g/l、4.0g/l、8.0g/l共6个敌百虫浓度梯度，由25度海水溶解配制而成。每浓度梯度设置3个平行，每个平行10只鲎苗，共计180只鲎。

由于敌百虫为粉剂且现配现用，试验前须先计算好各个浓度在2l海水中所需的量，再精确称量溶于各个桶中，然后装入2l海水，搅匀，再把挑选好的鲎苗按每个桶10只投放进去，最后接上打氧管持续充氧；一天换一次水和药。

试验持续4d，每12h观察一次，记录其生命特征、存活率、存活时间以及水体温度、气温、ph值、水体溶氧量。

1.2.2统计分析

采用spss17.0社会学统计软件进行方差分析(one-wayanova)检验其差异显著性；用lsr法的新复极差检验(ssr检验)法(duncan法)进行组间多重比较，p<0.05为差异显著；用probit法求出12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的lc50浓度；另外用excel2010软件进行绘图。

1.2.3计算方法

存活率计算公式如下：

s：存活率；a：各个容器中存活的鲎苗个数；b：各个容器鲎苗总数。

不同时间段存活时间计算公式如下：

其中，h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7分别表示24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时鲎苗存活时间，a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8分别表示鲎苗存活12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的个数。

2结果与分析

2.1不同浓度的敌百虫溶液对中国鲎第i期幼体的影响

不同浓度的敌百虫溶液对中国鲎第i期幼体的影响，包括敌百虫对鲎苗存活率和存活时间的影响。

2.1.1不同浓度的敌百虫溶液对中国鲎第i期幼体存活率的影响

不同浓度的敌百虫溶液对中国鲎第i期幼体存活率的影响明显，结果见表1。

表1中国鲎第i期幼体在不同时间段不同浓度的敌百虫溶液下的存活率

对表1的数据进行one-wayanova统计分析见图2。

从图2可见，12h时，各敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体存活率(100％)差异不显著(f(5，12)＝0，p>0.05)。24h时，8.0g/l的敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体存活率(46.67％)与对照组有显著差异(f(5，12)＝64.00，p<0.05)，但8.0g/l以下的敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体存活率与对照组差异不显著(p>0.05)。36h时，8.0g/l以下敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体存活率(100％)与对照组差异不显著(p>0.05)，但8.0g/l的敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体存活率已为0。48h、60h时，8.0g/l以下的敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体存活率(100％)与对照组差异不显著(p＞0.05)。72h时，对照组与2.0g/l以下的敌百虫浓度组差异不显著(p>0.05)，但与4.0g/l的浓度组差异显著(f(5，12)＝246.21，p<0.05)。84h时，4.0g/l以下的敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体存活率(100％)与对照组差异不显著(p＞0.05)，4.0g/l的敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体存活率与对照组差异显著(f(5，12)＝928.00，p＞0.05)。96h时，对照组与4.0g/l以下的敌百虫浓度组存活率(均为100％)差异不显著(p>0.05)，但4.0g/l的浓度组存活率(40％)与对照组差异显著(f(5，12)＝1033.00，p<0.05)。这说明，4d以内的短时间，浓度为4.0g/l以下的敌百虫，对中国鲎第i期幼体存活影响不明显。

2.1.2probit分析

用probit回归分析，对表1的数据进行处理，得出不同浓度的敌百虫在不同时间段下的毒力回归方程，结果见表2。

表2不同时间段下不同浓度的敌百虫对中国鲎第i期幼体的毒力回归方程

不同时间段下敌百虫的lc50结果见图3：

由图3可见，24h时，敌百虫的lc50较高，随着时间的增加，敌百虫的lc50逐渐降低，但在36-60h时，稳定在一个固定的值，随后继续随着时间的增加而降低，到96h时，lc50为3.813g/l。敌百虫对中国鲎第i期幼体的安全浓度为lc50*0.1＝0.3813g/l。

2.2敌百虫对中国鲎第i期幼体存活时间的影响

有敌百虫对中国鲎第i期幼体存活时间的影响，结果见表3。

表3敌百虫不同时间段中国鲎第i期幼体的存活时间

对表3的数据进行one-wayanova统计分析结果见图4。

从图4可知，12h时，试验各浓度的敌百虫对中国鲎第i期幼体存活时间的影响不显著(p＞0.05)。24h时，8.0g/l的敌百虫浓度组对中国鲎第i期幼体存活时间具有显著影响(f(5，12)＝64.000，p＜0.05)；8.0g/l的敌百虫浓度组以下组间差异不显著(p＞0.05)。36h时，8.0g/l的敌百虫浓度组间对中国鲎第i期幼体存活时间具有显著影响(f(5，12)＝240.250，p＜0.05)；8.0g/l的敌百虫浓度组以下组间差异不显著(p＞0.05)。48h时，8.0g/l敌百虫浓度的中国鲎第i期幼体全部死亡；8.0g/l的敌百虫浓度以下组间差异不显著(p＞0.05)。60h和72h时，4.0g/l(包括4.0g/l)的敌百虫浓度以下组间差异不显著(p＞0.05)。84h时，4.0g/l的敌百虫浓度组间对中国鲎第i期幼体存活时间具有显著影响(f(5，12)＝43177.000，p＜0.05)；4.0g/l的敌百虫浓度组以下组间差异不显著(p＞0.05)。96h时，4.0g/l的敌百虫浓度组间对中国鲎第i期幼体存活时间具有显著影响(f(5，12)＝18732.000，p＜0.05)；4.0g/l的敌百虫浓度组以下组间差异不显著(p＞0.05)。整个图可以看出，敌百虫浓度越高中国鲎第i期幼体存活时间越短，说明在短时间内敌百虫浓度达到2.0g/l以上时都不适于中国鲎第i期幼体的存活。

2.3敌百虫恢复后对中国鲎第i期幼体的影响

敌百虫恢复后对中国鲎第i期幼体存活率和存活时间的影响见下表4、图5和表5、图6。

2.3.1敌百虫恢复后对中国鲎第i期幼体存活率的影响

敌百虫恢复后，中国鲎第i期幼体不同时间段的存活率见表4。

表4敌百虫恢复后的中国鲎第i期幼体存活率

对表4数据进行统计分析见图5。

从图5发现，恢复12h时，所有敌百虫浓度的组间差异不显著(p＞0.05)；恢复24h时，4.0g/l敌百虫浓度的组间差异影响不显著(f(4，14)＝1.000，p＞0.05)，其存活率降低，活性反而下降了，这说明敌百虫的药效持久，短时间内不易清除恢复；恢复到36h、48h时，所有敌百虫浓度的组间差异不显著(p＞0.05)，存活率保持不变，这说明在敌百虫的药效需36小时以上才能完全清除。

2.2.2敌百虫恢复后对中国鲎第i期幼体存活时间的影响

敌百虫恢复后，中国鲎第i期幼体不同时间段的存活时间见表5。

表5敌百虫恢复后不同时间段中国鲎第i期幼体的存活时间

对表5的数据进行统计分析见图6。

从图6发现，在恢复12h时，各敌百虫浓度试验组组间差异不显著(p＞0.05)；恢复到24h时，4.0g/l的敌百虫浓度组间差异影响不显著(f(4，14)＝1.000，p＞0.05)，其他敌百虫浓度组间差异影响也不显著(p＞0.05)，但4.0g/l敌百虫浓度组的存活时间下降，这说明，恢复24h时，敌百虫的毒性依旧还在发挥作用，中国鲎第i期幼体还没有完全恢复得过来；在恢复到36h、48h以后，敌百虫对中国鲎第i期幼体的存活时间影响不显著(p＞0.05)，剩余的中国鲎第i期幼体全部恢复回来，说明在36小时以后敌百虫的毒性基本完全失效。

3结果分析与讨论

3.1结果

通过敌百虫不同浓度间对中国鲎第i期幼体的存活率、存活时间以及敌百虫恢复后对中国鲎第i期幼体的存活率、存活时间的影响，可以得出以下几个结论：

a)各敌百虫浓度在试验12h以内，对中国鲎第i期幼体存活率和存活时间没有显著影响；到24h时，8.0g/l敌百虫浓度组以下对中国鲎第i期幼体存活率和存活时间没有显著影响，而8.0g/l的敌百虫浓度组对中国鲎第i期幼体的存活率和存活时间有显著影响，开始有中国鲎第i期幼体死亡；到36h时，8.0g/l的敌百虫浓度组全部死亡，而8.0g/l以下的敌百虫浓度组一直持续到60h都没有死亡，这说明在60小时内，8.0g/l的敌百虫浓度为中国鲎第i期幼体的最低致死质量浓度。

b)试验进行到72h时，4.0g/l的敌百虫浓度组中国鲎第i期幼体开始有死亡，直到96h毒性试验结束，容器中的试验中国鲎第i期幼体还有存活，而4.0g/l以下的敌百虫浓度组全部存活，这说明在96h急性毒性试验范围内，2.0-4.0g/l的敌百虫浓度是中国鲎第i期幼体的最高安全质量浓度范围。

c)试验96h，敌百虫的安全浓度为0.3813g/l，说明，敌百虫浓度在0.3813g/l以下为中国鲎第i期幼体可存活的浓度。

d)敌百虫浓度在2.0g/l(包括2.0g/l)以下对中国鲎第i期幼体没有显著影响，为其抗敌百虫毒性能适应生存的浓度上限。

e)敌百虫恢复后12h，4.0g/l(包括4.0g/l)以下的浓度对中国鲎第i期幼体存活率、存活时间没有显著影响；敌百虫恢复后24h，4.0g/l以下浓度组对中国鲎第i期幼体存活率、存活时间没有显著影响。

f)恢复36h、48h后，各敌百虫浓度组对中国鲎第i期幼体的存活率、存活时间均无显著影响，说明在中国鲎第i期幼体敌百虫中毒后，可用25度的自然海水对其进行施救，其恢复的时间在36h以上。

3.2分析与讨论

3.2.1敌百虫对中国鲎第i期幼体的毒性

毒性试验96h后，2.0g/l(包括2.0g/l)以下的敌百虫浓度组存活率100％；4.0g/l以上浓度组与对照组(0g/l)差异显著(p<0.05)。12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h，敌百虫对中国鲎第i期幼体的lc50分别为0、7.88、5.912、5.912、5.912、4.143、4.038、3.813g/l；随着时间的增加，敌百虫的毒性逐渐减弱；从整体而言敌百虫的毒性对中国鲎第i期幼体的影响并不敏感。

3.2.2中国鲎第i期幼体的敌百虫适应性

在本试验中，高浓度的敌百虫对中国鲎第i期幼体的存活率及存活时间产生显著的影响(p＜0.05)，敌百虫浓度升高，中国鲎第i期幼体的存活率降低，存活时间短。试验证明，敌百虫浓度在4.0g/l时，中国鲎第i期幼体的存活率仅43.33％，平均存活时间88.8h；敌百虫浓度在4.0g/l以上时，存活率为0，存活时间最高不超过36h。敌百虫浓度在0～2.0g/l时，中国鲎第i期幼体的存活率最高，达100％，存活时间96h以上，probit分析得出，毒性试验进行到96h时，敌百虫的安全浓度为0.3813g/l，则说明敌百虫浓度在0.3813g/l以下为中国鲎第i期幼体在含敌百虫环境中的可生存的浓度。中国鲎第i期幼体与同属于海洋生物的幼体相比，其在敌百虫浓度0.3813g/l以下都能存活，敌百虫浓度适应上限较高，这说明，在较高浓度敌百虫的条件下，中国鲎第i期幼体能存活的可能性很大；也可说明中国鲎第i期幼体对敌百虫的耐受性较其他海洋生物幼体强。

3.2.3敌百虫恢复后对中国鲎第i期幼体的影响

敌百虫恢复后12h，对中国鲎第i期幼体的存活率及存活时间无显著影响(p＞0.05)。恢复24h时，对中国鲎第i期幼体的存活率及存活时间有著影响(p＞0.05)，说明在敌百虫中毒恢复后的24小时内毒性仍有残留。恢复36h、48h时，对中国鲎第i期幼体的存活率及存活时间无显著影响(p＞0.05)，说明敌百虫解毒需36h以上。

3.3建议

敌百虫是一种有机磷农药，主要用于鱼类养殖中杀灭或抑制水体里的细菌、寄生虫和浮游生物以及藻类等敌害生物，是养殖中常用的常规类高效药物。例如，敌百虫对微藻的生长能起完全抑制作用，青岛大扁藻、三角褐指藻和球等鞭金藻在敌百虫浓度大于200*10-6mg/l时及海洋原甲藻在敌百虫浓度大于150*10-6mg/l时均不能生长；对野生甲壳类有较强的杀灭力，仅需2.75*10-6mg/l的敌百虫就可以在96h内将其全部杀死。本发明通过试验研究得出敌百虫对中国鲎第i期幼体96h的安全浓度为0.3813g/l，可知中国鲎第i期幼体对敌百虫的耐受性远远在水体中的敌害生物之上，在育苗和人工养殖时可优先选择敌百虫作为杀虫剂给养殖水杀菌消毒。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。